Hoạt tính của polysaccharide từ nấm dược liệu

Trong số các hoạt tính y dược của polysaccharide từ nấm, hoạt tính tăng cường miễn dịch và kháng u được quan tâm nhiều hơn cả. Polysaccharide có hoạt tính sinh học thường là glucan (polymer của đường glucose) với các kiểu liên kết glucoside khác nhau. Một số là heteroglucan, một số gắn với protein tạo thành phức proteoglucan (bảng 1.3) [187].

Bảng 1.3. Nguồn gốc, kiểu và hoạt tính polysaccharide từ một số nấm dược liệu [187] Nguồn nấm Nguồn polysaccharide Kiểu Hoạt tính Pleurotus tuber-regium Sclerotium, (sợi nấm)

β -D-glucan Bảo vệ gan, chữa ung thư vú

Ganoderma lucidum Quả thể, dịch nuôi cấy Heteroglycan, mannoglucan, glycopeptide

Chống tăng đường huyết, tăng cường miễn dịch, kháng u, chống oxi hóa

Auricularia auricula

Quả thể Glucan Chống tăng đường huyết, tăng cường miễn dịch, kháng u, kháng viêm, chống bức xạ

Schizophyllum commune

Sợi nấm Glucan, schizophyllan Kháng u

Hericum erinaceus

Quả thể, sợi nấm Heteroglycan, heteroglycanpeptide

Chống tăng đường huyết, tăng cường miễn dịch, kháng u

Lentinus edodes

Dịch nuôi cấy, quả thể

Mannoglucan,

polysaccharide-protein complex,

glucan, lentinana

Tăng cường miễn dịch, kháng u, kháng vi rút

Sclerotinia sclerotiorum

Sclerotium Glucan, scleroglucan (SSG) Kháng u

Polystictus versicolar Quả thể, dịch nuôi và sợi nấm Heteroglycan, glycopeptide, krestin (PSK)

Chống tăng đường huyết, tăng cường miễn dịch, kháng u, kháng viêm, chống bức xạ

Grifola frondosa

Quả thể Proteoglycan, glucan, galatomannan, heteroglycan, grifolan

Tăng cường miễn dịch, bảo vệ gan, kháng u, kháng vi rút

Inonotus obliquus

20

Agaricus blazei

Quả thể, sợi nấm Glucan, heteroglycan, glucan protein, Glucomannan- proteincomplex

Kháng u

Flammulina velutipes

Quả thể, sợi nấm Glucaneprotein complex, glycoprotein Kháng u, Kháng viêm, tăng cường miễn dịch, kháng vi rút Ganoderma applanatum Quả thể Glucan Kháng u Polypours umbellatus

Sợi nấm Glucan Kháng u, tăng cường miễn dịch

Clitopilus caespitosus Quả thể Glucan Kháng u Pleurotus citrinopileatus Quả thể Galactomannan Kháng u Trametes robiniophila

Sợi nấm Proteoglycan Kháng u, tăng cường miễn dịch, giải độc gan

Tremella fuciformis

Quả thể, sợi nấm, dịch nuôi

Heteroglycan Chống mỡ máu, chống tăng đường huyết, kháng u, tăng cường miễn dịch, chống lão hóa, chống tụ huyết

Tremella aurantialba

Quả thể, sợi nấm Heteroglycan Chống tăng đường huyết, tăng cường miễn dịch

Pleurotus ostreatus

Quả thể Glycoprotein Chống tăng đường huyết, kháng u, chống oxi hóa

Morchella esculenta

Quả thể Heteroglycan Chống tăng đường huyết, kháng u

Omphalia lapidescens

Quả thể Glucan Kháng viêm, tăng cường miễn dịch Phellinus linteus Quả thể Glucan Kháng u Armillariella tabescens

Quả thể, sợi nấm Heteroglycan Kháng u

Dictyophora indusiata Quả thể Heteroglycan, mannan, glucan Kháng u, chống tăng đường huyết

Các glucan tập trung chủ yếu ở vách tế bào nấm (chiếm 1545% trọng lượng khô). Vách tế bào được cấu tạo bởi chủ yếu là β-glucan, α-mannan

21

glucan, galactomannanprotein, cellulose (hình 1.1) (Leung và cs., 2006) [96]. Chitin tạo thành một mạng lưới sợi và không tan trong nước, kiềm. Trong đó,

β-1,3 glucan (có thể phân nhánh), tạo vách tế bào, có các dạng tan khác nhau

một số tan được trong nước, kiềm (S-glucan) và không tan trong kiềm (R- glucan). Các β-1,3 glucan, có chứa các liên kết nhánh hoặc β-1,4 hoặc β-1,6

glucoside, liên kết với chitin và khoảng trống được lấp đầy bởi protein. Các sợi liên kết β-1,4 glucoside trong mạch chính cũng có thể hiện diện ở trong vách tế bào nấm. Ở vách tế bào nấm, chitin chiếm 1,47,9%, mannan (dạng manoprotein chủ yếu là mannan) chiếm 2867%, β-1,3 glucan chiếm 2846% và β-1,6 glucan chiếm 511%, và các polymer này nối với nhau tạo thành một đơn vị thống nhất của thành tế bào nấm (hình 1.1).

Hình 1.1: Kết nối các polymer trong vách tế bào nấm.

(Leung và cs., 2006) [81]

Hoạt tính tăng cường miễn dịch, chống khối u của β-1,3 glucan

Các polysaccharide có hoạt tính tăng cường miễn dịch hay chống u có mặt chủ yếu ở vách tế bào nấm, trong đó β- 1,3/1,6-D glucan và α-1,3 mannan (liên kết với protein) là hai chất có hoạt tính chính. Chitin và cellulose không có hoạt tính này. β-1,3-glucan là polymer gồm các đơn phân tử là glucose nối

22

số nấm, polymer này còn có các liên kết mạch nhánh β- 1,6 glucoside. Ở nấm

lớn, mạch nhánh thường ngắn (1 đơn vị glucose). Giữa các nấm cũng có sự khác biệt về cấu trúc β-1,3-glucan. Ngoài ra, các β-1,3 glucan có nguồn gốc

khác nhau sẽ khác nhau ở mức độ polymer hóa (hay trọng lượng phân tử), độ phân nhánh (degree of branching, DB). Hoạt tính tăng cường miễn dịch sẽ phụ thuộc vào mức độ phức tạp về cấu trúc hóa học và lý học của mỗi glucan. Ngoài nấm, β-1,3 glucan cũng được phát hiện ở vi khuẩn, tảo nâu, với mức

phân nhánh kém (tảo nâu) hoặc không phân nhánh (vi khuẩn). Cấu trúc của một

β-1,3 glucan điển hình với phân nhánh β-1,6 glucoside được trình bày tại hình

1.2.

Hình 1.2. cấu trúc hóa học của β-1,3/1,6 glucan điển hình.

Các β-1,3/1,6 glucan với hoạt tính tăng cường miễn dịch tốt, được nghiên cứu kỹ, là từ các nấm L. edodes (nấm hương), Grifola frondosa (maitake), Schizophillum commune và Scleroninia sclerotiorum.

Mối liên quan giữa cấu trúc β-glucan và hoạt tính chống u

Các β-glucan có hoạt tính chống u có sự khác nhau về thành phần hóa

học, mức độ phân nhánh, cấu trúc không gian và các đặc tính vật lý khác. Hoạt tính chống u được thấy ở các glucan từ dạng homoglucan tới dạng phức hợp heteroglucan. Mặc dù rất khó có thể đưa ra mối liên quan cấu trúc và hoạt tính

23

của các glucan phức tạp, tuy nhiên vẫn có mối liên quan chung giữa cấu trúc và hoạt tính. Các cấu trúc với liên kết β-1,3 glucan trong mạch chính và có nhánh bên liên kết qua cầu nối là β-1,6 glucoside là cần thiết để các glucan này có

hoạt tính tốt. Trong khi đó, β-1,6-glucan thì hoạt tính yếu hơn hẳn (Yanaki.,

1985; Pang và cs., 2005) [175,126]

Ảnh hưởng của trọng lượng phân tử

Khi xử lý nhiệt β-1,3 glucan từ nấm G. frondosa ở 150oC với thời gian khác nhau, Sakaki (1976) [135] thu được các β- glucan có trọng lượng phân tử khác nhau. Thử nghiệm hoạt tính kháng u dẫn đến kết luận phân đoạn có trọng lượng cao nhất (800 kDa) luôn luôn có hoạt tính chống u, tăng cường miễn dịch tốt nhất. PSK (polysaccharide K: polysaccharides 30%, nitơ 6%, protein 15%) từ nấm vân chi được lọc và chia 4 phân đoạn: 50 kDa, 50100 kDa, 100200 kDa và >200 kDa. Hoạt tính kháng u và tăng miễn dịch tốt nhất ở phân đoạn có Mw >200 kDa. Sakaki (1976) xử lý lentinan (β-1,3/1,6 glucan từ nấm hương, Mw >1.000 kDa) bằng axit formic thành 7 phân đoạn với Mw 2,870110 kDa. Hoạt tính kháng u của các phân đoạn có Mw <16 kDa giảm rõ rệt, trong khi các phân có Mw lớn vẫn giữ nguyên hoạt tính như đầu (Sasaki và cs., 1976) [135]. Nghiên cứu khác cũng chỉ ra rằng, trọng lượng phân tử cao (>100 kDa) là cần thiết để β-glucan có hoạt tính tốt nhất (Yanaki, 1983) [175]. Tuy nhiên, một số oligo β-1,3 glucan có hoạt tính tốt hơn hẳn so với các β-1,3 glucan mạch dài

(Miyanishi và cs., 2003; Pang và cs., 2005) [108,126].

Ảnh hưởng của độ phân nhánh

Ở nấm, các β-glucan có độ phân nhánh khác nhau, dọc theo mạch chính. Lentinan (DB 2/5), β-1,3/1,6 glucan với 2 phân nhánh cho mỗi 5 đơn vị glucose mạch chính; schizophyllan (DB 1/3) là β-1,3/1,6 glucan với mỗi phân nhánh

cho mỗi 3 đơn vị glucose mạch chính. Mối liên hệ giữa độ phân nhánh và hoạt tính của β-glucan là rất phức tạp. β-1,3-glucan mạch chính là cần thiết và hoạt

tính tốt nhất khi có mức độ phân nhánh (DB) khoảng từ 0,20,4 (Zang và cs., 2007) [184]

24

Ảnh hưởng của cấu trúc tới hoạt tính

Cấu trúc của β-glucan gồm các dạng xoắn đơn (single helix), xoắn ba (triple helix) và vô định hình (random coil). Cấu trúc xoắn ba thường bền vững hơn xoắn đơn bởi luôn có xu hướng xoắn đơn chuyển thành dạng xoắn ba. Các phân tử β-glucan được nghiên cứu nhiều như lentinan, schizophyllan và PSK

đều ở dạng xoắn ba. Các dạng cấu trúc của β-glucan có thể chuyển đổi lẫn nhau bởi các yếu tố như nhiệt độ, hóa chất v.v… (hình 1.3) (Adachivà cs., 1999) [14].

Hình 1.3. Các dạng cấu trúc của βglucan và sự chuyển đổi giữa chúng

Cấu trúc dạng xoắn cũng ảnh hưởng tới hoạt tính của polysaccharide. Yanaki (1983) đã phát hiện ra schizophyllan khi ở trạng thái xoắn ba (tương ứng với Mw > 9104 Da) thì hoạt tính tốt nhất. Cấu trúc xoắn đơn làm giảm hoạt tính và mất hoàn toàn khi không còn trạng thái xoắn (Mw < 5103 Da) (Yanaki, 1983) [175].

Một số sản phẩm β-glucan tiêu biểu có hoạt tính tăng cường miễn dịch, kháng u.

Lentinan từ quả thể nấm hương (L. edodes) có hoạt tính kháng u và tăng cường miễn dịch rất tốt. Cấu trúc cơ bản của lentinan gồm mạch chính β-1,3

Xoắn ba Kiềm

Trung hòa Nhiệt độ

Xoắn đơn

25

glucan trong đó cứ 5 liên kết β- 1,3 glucoside mạch chính có 2 liên kết nhánh β- 1,6 glucoside, tạo nên cấu trúc xoắn ba (độ phân nhánh 0,4) (hình 1.4) (Bisen và cs., 2010) [20]. Lentinan thương mại có trọng lượng phân tử khoảng 400800103 Da [186]. Khả năng kéo dài đời sống bệnh nhân ung thư của Lentinan đã được chứng minh, đặc biệt đối với ung thư dạ dày, ung thư đường ruột. Ngoài ra, lentinan có tác dụng thúc đẩy hoạt động của các enzyme chống oxi hóa. Lentinan cũng có tác dụng tăng cường miễn dịch ở bệnh nhân AIDS (Sobieralski, 2012) [148]. Hiện nay, lentinan đã được thử nghiệm lâm sàng ở Trung Quốc và Nhật bản (Zhou và cs., 2009) [186].

Hình 1.4. Cấu trúc của lentinan

Liên kết β1,3 glucoside ở mạch chính và β1,6 glucoside tại mạch nhánh. Cứ mỗi 5 đơn vị glucose mạch chính, sẽ có 2 liên kết nhánh

Schizophyllan (SPG) là polysaccharide chính từ nấm S. commune.

Glucan này có gồm mạch chính chứa liên kết β-1,3 glucoside và mạch nhánh liên kết β-1,6 glucoside theo tỉ lệ cứ 3 đơn vị glucose mạch chính thì có 1 đơn vị glucose mạch nhánh (độ phân nhánh 0,33) (hình 1.5). SPG có cấu trúc xoắn ba, với MW nguyên thủy là 6106 và có độ nhớt cao. Do có khối lượng phân tử cao, khả năng tan của SPG kém dần dẫn đến khả năng ứng dụng trong điều trị bị hạn chế. Để khắc phục nhược điểm này, SPG được cắt nhỏ bằng siêu âm tới trọng lượng khoảng 450103. SPG được dùng điều trị ung thư đường sinh dục,

26

bàng quang, biểu mô, phổi, đầu, cổ v.v.. Ở Nhật Bản, SPG được điều trị lâm sàng với bệnh ung thư bắt đầu từ năm 1986 và hiện nay được sử dụng cho bệnh nhân ung thư giai đoạn 2 và 3, phối hợp với xạ trị. Kết quả là SPG kéo dài tuổi thọ ở bệnh nhân ung thư phổi và ung thư dạ dày (Kogan, 2000) [82].

Hình 1.5. Cấu trúc β1,3/1,6 glucan của schizophyllan

Mạch chính cấu tạo bởi 3 đơn vị glucose liên kết β1,3 glucosidic và glucose mạch nhánh liên kết β1,6 glucosidic.

Pleuran cũng là một polysaccharide được tách chiết từ nấm Pleurotus ostreatus (nấm sò). Mạch chính của nó gồm các đơn vị glucose liên kết β-1,3

glucoside và cứ mỗi 4 đơn vị glucose mạch chính có 1 nhánh đơn liên kết β-1,4

glucoside hoặc β-1,6 glucoside. Phân tử lượng của pleuran từ 600 700 103. Polysaccharide này có hoạt tính kháng u, giảm mỡ máu và ổn định quá trình đồng hóa carbohydrate. Hơn nữa, chúng có hoạt tính kháng nấm, chống oxi hóa. Pleuran tăng giúp các thực bào và bạch cầu hạt tập trung tới vùng viêm, chống lại vi sinh vật (Radzki và cs., 2010) [131].

Mayell (2001) đã tách grifolan (GRN) từ nấm G. frondosa (maitake). β- 1,3 glucan này có Mw khoảng 450 103, với cấu trúc tương tự với schizophyllan và scleroglucan, là cấu trúc xoắn ba. GRN có hoạt tính tăng cường miễn dịch và kháng ung thư cao, dùng cho bệnh nhân ung thư vú, bệnh AIDS, mỡ máu, cao huyết áp và viêm gan vi rút [104].

Từ nấm linh chi (G. lucidum), ganoderan (GPP) được phân lập, với Mw

27

glucan với protein, trong đó protein chiếm 4%. GPP có hoạt tính chống ung thư. Nghiên cứu sâu hơn về polysaccharide từ nấm linh chi cho thấy polysaccharide tổng của nó (GPL-T) gồm 3 loại, trong đó có β-1,3/1,6 glucan

(GPL) là homoglucan, chiếm 31,6% và có Mw lớn tới 2.080103. Hai polysaccharide còn lại (heteroglucan) chứa cả galactose và manose. Cả 3 phân đoạn đều có hoạt tính kích thích bạch cầu đơn nhân người sản xuất TNF-α, trong đó β-1,3/1,6 glucan là mạnh nhất (Chang và cs., 2004) [29]. GPL có hoạt tính chống ung thư ổ bụng in vivo, và có hoạt tính kháng viêm (Joseph và cs.,

2011) [64]. GLPs được cho là chất hoạt tính chủ chốt của linh chi, polymer này thể hiện hoạt tính tăng cường miễn dịch bao gồm hỗ trợ chức năng các tế bào miễn dịch, sản xuất các cytokine như IL, TNF-α, INF-ϒ v.v.. Ngoài ra, GLPs còn làm giảm bệnh tim mạch, và chống di căn tế bào ung thư (Xu và cs., 2011) [173].

Cơ chế tác dụng của β-glucan lên hệ miễn dịch

Các β-glucan ở nấm là chất điều hòa đáp ứng sinh học (BRM) bởi chúng không gây tổn thương và tạo stress lên tế bào, cơ thể, nhưng chúng giúp cơ thể thích nghi với môi trường và stress sinh học và thể hiện các hoạt động không đặc hiệu lên cơ thể chủ. Các β-glucan hỗ trợ một vài hoặc toàn hệ thống chính

của cơ thể, bao gồm cả thần kinh và hệ miễn dịch cũng như chức năng điều khiển. Các glucan không trực tiếp tấn công tế bào ung thư hoặc tế bào lạ trực tiếp, mà chúng kích thích các đáp ứng miễn dịch trong cơ thể chủ (Wasser, 2002) [167].

Về mặt cơ chế, glucan gây đáp ứng miễn dịch ở động vật nhờ vào sự tương tác giữa glucan với các thụ thể màng của tế bào miễn dịch như đại thực bào (macrophage), bạch cầu trung tính (neutrophile) và tế bào giết tự nhiên (natural killer, NK). Ở động vật có 4 thụ thể đặc hiệu với β-glucan, đó là thụ

thể của bổ thể (complement receptor 3, CR3), lactosylceramide, thụ thể dọn dẹp (scavenger receptor), và dectin-1 (Leung và cs., 2006) [96]. Hệ miễn dịch bẩm sinh gồm các tế bào miễn dịch (đại thực bào, tế bào trung tính, tế bào giết

28

tự nhiên và tế bào tua (dendritic cell, DCs). Các tế bào này được điều khiển bởi cytokine (là protein tín hiệu) và bởi sự hoạt hóa viêm v.v.. Hệ miễn dịch thích nghi hoạt động trên kháng nguyên lạ, và có liên quan tới tế bào miễn dịch B và T. Tế bào B tạo kháng thể và điều khiển miễn dịch dịch thể (humoral immunity), trong khi tế bào T kích thích tính miễn dịch dựa trên miễn dịch điều khiển bởi tế bào (cell-mediated immunity). Tế bào tua DCs liên quan đến miễn dịch thích nghi, và trình diện kháng nguyên lạ đến tế bào T và gây đáp ứng miễn dịch.

Các thụ thể nhận biết khuôn mẫu với một số polysaccharide được trình bày trên bảng 1.4 và mô hình glucan hoạt hóa tế bòa miễn dịch chống tác nhân gây bệnh trình bày ở hình 1.6.

Bảng 1.4. Các thụ thể nhận biết khuôn mẫu với một số polysaccharide

(Leung và cs., 2006) [96]

Thụ thể/protein bám polysaccharide

TLR2 Zymosan

TLR4 β-1,4-glucan

SR Fucoidan, β-glucan

Dectin-1/β-glucan receptor β-1,3-glucan

CR3 β-1,3-glucan

MR Mannan

MBL Mannan

Viết tắt: TLR (Toll-like receptor); SR (scavenger receptor); CR3 (complement receptor type 3); MR (mannose receptor); MBL (mannan binding lectin)

29

Hình 1.6. Mô hình glucan hoạt hóa tế bào miễn dịch gây phá hủy tác nhân gây bệnh (Leung và cs., 2006) [96].

β-Glucan trực tiếp hoạt hóa con đường bổ thể, tế bào miễn dịch T, B và

NK, hoặc thông qua hoạt động của đại thực bào, tế bào tua và gián tiếp làm kích hoạt tế bào T, B, NK. Glucan kích thích tế bào tua DCs, đại thực bào tiết các cytokine như IL-1 qua đó kích thích tiết cytokine điều khiển hoạt động tế bào đại thực bào, tế bào T, B và NK loại bỏ tác nhân gây bệnh.

β-Glucan kích thích hoạt hóa nội bào, tế bào đại thực bào, bạch cầu đơn

nhân, và tế bào miễn dịch khác sẽ tiết các interleukin 1 (IL-1), IL-9, IL-8 hoặc yếu tố hoại tử ung thư (TNF-α), gây sự viêm sưng.

βGlucan có thể được sử dụng qua đường tiêm tĩnh mạch, hoặc đường miệng. Với đường miệng, các tế bào ở trong ruột non tương tác với β-glucan

để vận chuyển tới tế bào lympho ruột non (Peyer’s patches) và dẫn tới sản xuất các cytokine. Ngoài ra, các đại thực bào trong hệ thống đường ruột sẽ dẫn β-

30

và thu nhận bởi các bạch cầu hạt (granulocyte), đi vào tuần hoàn máu để thực hiện vai trò của chúng (Novak và Vetvicka, 2009) [122].