Theo phương pháp phenol/axit sulphuric (Dubois và cs., 1956) [43]. 100 L mẫu được trộn đều với 100 L dung dịch 5% phenol. 500 L dung dịch H2SO4 đặc được bổ sung trực tiếp vào hỗn hợp mẫu. Đun nóng hỗn
47
hợp trong 5 phút, để nguội và so màu tại bước sóng A492nm (hình dưới). Từ giá trị mật độ quang và dựa vào đường chuẩn (dùng glucose), xác định được hàm lượng polysaccharide trong mẫu. Màu sắc càng nâu đậm, thì hàm lượng polysaccharide càng cao. y = 0.0021x + 0.042 R2 = 0.9902 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 0 100 200 300 400 500 600 microgr/mL O D 4 9 2 n m
Cường độ màu của poly polysaccharide với hỗn hợp dịch nhuộm (hình trái). Đồ thị chuẩn dùng glucose với nồng độ xác định phản ứng tạo mầu với hỗn hợp dịch nhuộm (hình phải)
2.7. Thủy phân không hoàn toàn β-1,3-glucan từ nấm hầu thủ bằng -1,3- glucanase
Enzyme β-1,3 glucanase (cắt liên kết β-1,3 glucoside một cách đặc hiệu, hãng Sigma) được chọn làm enzyme thủy phân mạch - 1,3 glucan thành - 1,3-glucan mạch ngắn hơn và các oligomer, đường glucose. Enzyme này không có hoạt tính β-1,6-glucanase nên không làm thay đổi cấu trúc mạch nhánh (liên kết β-1,6 glucoside) của sản phẩm sau khi được cắt, đảm bảo các cấu trúc β-
1,3/1,6 glucan vẫn được giữ nguyên.
Dung dịch DNS (3,5 dinitrosalicylic acid) được dùng để hiện mầu nhận biết gốc đường khử và cường độ mầu đo ở bước sóng 540 nm (Miller, 1959) [106].
2.8. Nghiên cứu bao curcumin (Cur) bằng β-1,3/1,6-glucan
Sản phẩm β-1,3/1,6-glucan đã tách chiết và tinh sạch từ nấm hầu thủ,
được sử dụng để làm chất mang curcumin (Cur) (chiết xuất từ cây nghệ vàng), tạo phức curcumin/β-1,3/1,6-glucan (Cur-Glu). Phức Cur-Glu giúp làm tăng độ tan của Cur trong nước, tăng tính sinh khả dụng của Cur cũng như tăng hoạt tính chống ung thư của hệ Cur-Glu.
48
2.9. Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học
2.9.1. Phương pháp thử khả năng gây độc tế bào (cytotoxicity)
Nuôi tế bào ung thư in vitro theo Skehan và cs. [145]. Xác định hoạt tính gây độc các dòng tế bào ung thư theo phương pháp SRB của Likhitayawuid và cs. đang được tiến hành tại Viện Nghiên cứu Ung thư Quốc gia của Mỹ (NCI) (Likhitwitayawid và cs. 1993)[99]. Phương pháp này đã được phòng Sinh học Thực nghiệm thuộc Viện Hoá học các Hợp chất Thiên nhiên áp dụng từ năm 1996.
Phản ứng dựa vào khả năng thuốc nhuộm SRB bám vào protein của tế bào đã được cố định bởi trichloroacetic acid (TCA). SRB là chất nhuộm aminoxanthene hồng nhạt với 2 nhóm sulfonic tác dụng gắn với các chất chứa amino acid cơ bản trong điều kiện axit nhẹ, và tách ra trong môi trường pH kiềm. Lượng chất màu tách ra từ tế bào được nhuộm là tương ứng với khối lượng tế bào.
Độ mạnh của sự bám dính SRB cho phép phản ứng thực hiện trong phiến 96 giếng. Phản ứng SRB được chứng minh là có tính ứng dụng bởi lớp tế bào sau khi cố định bởi TCA và nhuộm với SRB có thể được lưu giữ lâu dài. Chất mầu tách ra từ tế bào nhuộm SRB là bền vững. Với tính nhạy cao, sử dụng với phiến 96 giếng và tính bền vững, phản ứng SRB là phù hợp với ứng dụng sàng lọc lớn cũng như trong nghiên cứu. Phản ứng này được dùng rộng rãi cho kiểm tra độc tính của thuốc với các dòng tế bào ung thư và không ung thư.
Phép xác định gồm hai bước như sau:
Bước 1: Sàng lọc tìm các mẫu thử có hoạt tính Chuẩn bị tế bào
- RD: Human Rhabdomyosarcoma (Ung thư mô liên kết)
- Hep-G2: Human Hepatocellular carcinoma (Ung thư gan người) - Lu: Lung cancer (Ung thư phổi)
49
Dòng tế bào được lưu giữ trong nitơ lỏng, hoạt hóa và duy trì trong các môi trường dinh dưỡng MEME, Eagle hoặc DMEM.
Tế bào được nuôi trong các điều kiện tiêu chuẩn (CO2 5%; độ ẩm 98%; nhiệt độ 37oC, vô trùng tuyệt đối), tế bào được hoạt hoá trước khi thí nghiệm tiến hành từ 1824 giờ.
Dùng dung dịch tripsin versel 0,1% để tách tế bào sau khi đã rửa tế bào bằng đệm PBS. Pha tế bào bằng môi trường sạch, đếm số lượng, tạo huyền dịch tế bào ở nồng độ thí nghiệm ( khoảng 35104 tế bào/mL tùy theo từng loại tế bào thử nghiệm).
Chuẩn bị mẫu thử
Mẫu thử: Chất chiết từ thực vật hay sinh vật nói chung
Tạo mẫu gốc (110 mg mL1) trong dung môi DMSO. Dimethyl sulphoxide (DMSO) độc tính ở nồng độ cao, nên cần hòa loãng với môi trường ở nồng độ nhỏ hơn 1%.
Tiến hành thí nghiệm
Nhỏ vào các giếng của phiến thí nghiệm theo sơ đồ như sau: Dãy đối chứng âm: DMSO 10%
Dãy đối chứng dương: chất chuẩn có khả năng diệt tế bào (ellipithine) pha tới nồng độ 0,01mM trong DMSO.
Dãy thí nghiệm: mẫu thử + dịch huyền phù tế bào Phiến được ủ trong tủ CO2 ở 37oC trong 3 ngày. Kết thúc thí nghiệm
Tế bào sau khi ủ 3 ngày được cố định bằng dung dịch TCA lạnh. Rửa, để khô, nhuộm SRB 0,4% trong axit axetic 1% và rửa lại bằng axit axetic 1% để loại màu thừa; để khô, hoà lại bằng dung dịch đệm Trisbazơ 10M trên máy lắc ngang.
Đọc trên máy ELISA ở bước sóng 515-540mm.
Tính kết quả
50
Giá trị CS: là khả năng sống sót của tế bào ở nồng độ ban đầu của mẫu thử, mẫu nào cho giá trị CS ≤ 50% thì được đánh giá là có hoạt tính.
Giá trị CS(%) được tính theo công thức:
Trong đó: OD: mật độ quang σ: độ lệch tiêu chuẩn σ được tính theo công thức:
Trong đó: xi : giá trị OD tại giếng i : giá trị OD trung bình n: số giếng thử lặp lại
Các mẫu có biểu hiện hoạt tính (CS50 ≤ 50% ± ) sẽ được chọn ra cho thử nghiệm bước 2 để tìm giá trị IC50.
Bước 2: Tìm giá trị IC50
Dùng giá trị CS% của 10 nồng độ, dựa vào chương trình Table curve theo thang giá trị logarit của đường cong phát triển tế bào và nồng độ chất thử để tính giá trị IC50.
Công thức:
Trong đó: y: nồng độ chất thử X: Giá trị CS (%)
2.9.2. Phương pháp ức chế hình thành khối u 3 chiều trên thạch mềm (anti-tumor promoting assay) in vitro tumor promoting assay) in vitro
Theo các tác giả Kim (2005) [74] và Gao và cs. (2002) [47], hiện đang được triển khai thực hiện tại phòng Sinh học thực nghiệm, Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên.
51
Hoạt tính ức chế hình thành khối u trên thạch mềm là thử nghiệm sự bám dính và hình thành khối u trên thạch mềm. Theo kỹ thuật này, tế bào (đã được xử lý bằng các chất gây ung thư hoặc các chất ức chế ung thư) được nuôi cấy cùng với chất điều chỉnh thích hợp trên môi trường thạch mềm trong 1020 ngày. Tiếp theo giai đoạn nuôi cấy này, các khuẩn lạc hình hành có thể được nhuộm rồi phân tích hình thái, hoặc đếm số lượng khuẩn lạc hình thành trên mỗi giếng.
Nuôi tế bào ung thư in vitro theo phương pháp Skehan và cs. [145].
Chuẩn bị tế bào (như ở mục 2.6.1) Tiến hành thí nghiệm
Tế bào nuôi trong môi trường MEM bổ sung 10% FBS ở 37C trong tủ ấm CO2 (5% CO2). Tế bào phát triển trong bình nuôi cấy 1 lớp, đạt đến phase Log, tế bào được tách khỏi bình và tách rời nhau bởi tripsin, đếm và hòa lại vào môi trường thạch loãng (0,35 % với thạch mặt và 0,5% với thạch nền) với nồng độ tế bào 3,33103/mL. Trộn mẫu thử với nồng độ đầu 525 µg mL1. Thí nghiệm được tiến hành trên phiến 6 giếng, lặp lại 23 lần. Sau 1020 ngày lấy ra và nhuộm tế bào bằng tím kết tinh 0,005%, đọc kết quả dưới kính hiển vi ngược có gắn camera và nối ra máy tính. Hoạt tính ức chế hình thành khối u trên thạch được tính lặp lại 35 lần so sánh % số lượng khuẩn lạc hình thành khối u, kích thước khối u so với đối chứng (DMSO 1%).
2.10. Các phương pháp thử dược lý
2.10.1. Phương pháp đánh giá độc tính cấp
Nghiên cứu tính độc cấp theo phương pháp của Abrham (1978) [13] và Turner (1965). Được thử nghiệm tại Bộ môn Dược lý – Học viện Quân y.
2.10.2. Phương pháp đánh giá độc tính bán trường diễn
Căn cứ vào kết quả LD50 dùng phép ngoại suy cho liều dùng trên động vật, chúng tôi sử dụng cho uống chế phẩm bán trường diễn 2 mức liều thấp và cao.
52
Phương pháp được mô tả bởi Abrham (1978) [13] và theo quy định của WHO (2000) [169] và Bộ Y tế về hiệu lực và an toàn trong nghiên cứu thuốc có nguồn gốc thiên nhiên. Được thử nghiệm tại Bộ môn Dược lý – Học viện Quân y.
2.10.3. Phương pháp đánh giá một số tác dụng của sản phẩm
Được thử nghiệm tại Bộ môn Dược lý – Học viện Quân y.
2.10.3.1. Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của HG1 trên mô hình gây độc gan bằng carbon tetracholorid bằng carbon tetracholorid
2.10.3.2. Nghiên cứu tác dụng của HG1 đến quá trình tổng hợp protein trên động vật khi dùng bán trường diễn động vật khi dùng bán trường diễn
Phương pháp được mô tả bởi Samuel Irwin (1967) [136].
2.10.3.3. Nghiên cứu tác dụng trên hệ miễn dịch của HG1 thực nghiệm
Theo phương pháp của Santos, Mansour (1968) và Phạm Mạnh Hùng (1984) [138,4]
2.10.3.4. Phương pháp thử hiệu lực kháng u thực nghiệm
Theo phương pháp của Agafonova và cs. (2008) [16] và được thử nghiệm tại Viện Hàn lâm Khoa học Nga
2.10.4. Xử lý số liệu
Theo phương pháp thống kê dùng trong y-sinh-dược học. Sử dụng phần mềm Microsoft Excel (Nguyễn Xuân Phách và cs., 1995) [5].
53
CHƯƠNG III. THỰC NGHIỆM
3.1. Nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học của nấm hương
3.1.1. Phân lập các hợp chất từ quả thể nấm hương
Nấm hương khô (2 kg) được tiến hành chiết siêu âm với ethanol 95% ba lần. Phần dịch chiết (sử dụng để phân lập các hợp chất có phân tử lượng nhỏ) và phần bã nấm sau khi chiết cồn (sử dụng để tách polysaccharide) được thu riêng.
Các dịch chiết ethanol được gộp lại và làm lạnh ở 410C thu chất kết tinh NH-1 (6 g). Tiếp theo đó, phần dịch được loại dung môi dưới áp suất thấp thu được cặn chiết ethanol (65 g).
Cặn chiết ethanol được hòa trong nước và tách phân đoạn sử dụng 3 dung môi lần lượt là n-hexan, ethyl axetat và butanol. Tiến hành cất loại dung
môi dưới áp suất giảm thu được các cặn chiết tương ứng là: cặn n-hexan (22 g), cặn ethyl axetat (15 g) và cặn butanol (18 g) (sơ đồ 3.1).
Cặn n-hexan có hoạt tính (xem kết quả bảng 4.2 và 4.3) tiếp tục được
tách phân đoạn bằng sắc ký cột lặp lại trên silica gel pha thường với hệ dung môi n-hexan/axeton theo tỉ lệ 49/11/1 thu phân đoạn NH-A1 (1,5 g), NH-A2 (1,3g), NH-A3 (900 mg).
Phân đoạn NH-A1 (1,5g) có hoạt tính (xem bảng 4.4 và 4.5) được tách chiết phân đoạn sử dụng sắc ký cột với hệ dung môi n-hexan/axeton theo tỉ lệ
3/1-1/1, thu được 2 hợp chất ký hiệu là NH-2 (150 mg) và NH-3 (50 mg).
Tách chiết polysaccharide (sơ đồ 3.1). Bã nấm sau khi chiết cồn được sấy khô, bổ sung nước cất với tỉ lệ 10:1 (v/w) và trộn đều, đun 100C trong 8 h, lọc thu phần dịch, lặp lại 3 lần. Dịch lọc của 3 lần chiết được gộp lại và cô quay chân không dưới áp suất để làm giảm thể tích, bổ sung EtOH 95 % vào dịch chiết nước với tỉ lệ 3:1 (v:v), ủ 24 tại 4C. Phần cặn chứa polysaccharide thô được thu bằng ly tâm và cặn được rửa 2 lần trong ethanol, làm khô thu được cặn polysaccharide P1 (76,8 g).
54
Phần không tan sau khi chiết nước được làm khô và hòa trong 1% ammonium oxalate, chiết tại 30oC qua đêm. Hỗn hợp được ly tâm 10.000 vòng/phút, 5 phút. Dịch nổi được trung hòa dịch bằng NaOH và được bổ sung 3 lần thể tích ethanol 95%, ủ 24 h ở 4C. Ly tâm thu cặn polysaccharide P2 (50 g).
Phần cặn sau khi chiết axit được sấy khô và chiết tiếp trong dịch 5% NaOH (tỉ lệ 1:10, w/v) ở 5560C trong 24 h. Dịch nổi được thu bằng ly tâm (10.000 v/p) và trung hòa bằng axit axetic 1 M, ủ 4C qua đêm, ly tâm thu dịch. Bổ sung 3 lần thể tích EtOH 95%, ủ 24 h ở 4C. Ly tâm thu cặn polysaccharide P3 (221,6 g).
Sơ đồ 3.1: Sơ đồ chiết phân đoạn mẫu nấm hương
1% NH4 oxalate (100C) EtOH P 1 (76,8) EtOH Làm lạnh ở 4-100 C Cặn etyl axetat (15g) Cặn chiết EtOH (65 g) Cặn n-hexan (22 g) - Bổ sung nước - Bổ sung n-hexan Lớp n-hexan Bổ sung EtOAc
Lớp etyl axetat Lớp nước
Chiết siêu âm với EtOH 95% Nấm hương khô (2 kg) NH1 (6g) Cất loại dm Dịch Bã nấm Nước (100C) Cặn nấm I Kết tinh Cặn BuOH (18 g) Chiết BuOH Dịch chiết nước NaOH (5%), 60C P 2 (50 g) Cặn II EtOH Dịch chiết axit Cặn III P 3 (221,6 g) Dịch chiết kiềm
55
Sơ đồ 3.2: Sơ đồ phân lập các hợp chất NH2 và NH3 3.1.2. Tách polysaccharide từ dịch lên men nấm hương
Dịch lên men nấm hương (nuôi cấy lắc 15 ngày, 200 vòng/phút) được ly tâm 5000 vòng/phút trong 5 phút để bỏ sợi nấm. Phần dịch được cô tới thể tích 1/10 thể tích ban đầu và được bổ sung EtOH 95% vào phần dịch (tỉ lệ 3:1, v:v), lắc đều và ủ hỗn hợp tại 4C trong 12 h tạo kết tủa. Ly tâm tại 10000 vòng/phút thu cặn chứa polysaccharide thô, rửa sạch cặn bằng methanol được phân đoạn polysaccharide P4.
3.1.3. Các hằng số vật lý và số liệu phổ của các hợp chất đã phân lập từ nấm hương
Hợp chất 1 (NH3): ergosterol peroxide
Dạng tinh thể hình kim màu trắng. Độ nóng chảy 181183oC
Khối lượng phân tử M = 426, Công thức phân tử là C28H44O3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 H-NMR và 13C-NMR (xem mục 4.1.2.1) Cặn n-hexan (22g) NH-A3 (900mg) Silica gel CC n-hexan/axeton 49/11/1 NH-A1 (1,5g) NH-A2 (1,3g) NH3 (50mg) Silica gel CC n-hexan/axeton: 3/1-1/1 NH2 (150mg)
56
Hợp chất 2 (NH1): galactiol
Kết tinh màu trắng.
Độ nóng chảy 167169C
Khối lượng phân tử M = 182, Công thức phân tử là C6H8 (OH)6 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1
H-NMR và 13C-NMR (xem mục 4.1.2.2)
Hợp chất 3 (NH2): ergosterol
Dạng tinh thể hình kim màu trắng Độ nóng chảy : 168o
C
Khối lượng phân tử M = 396, Công thức phân tử là C28H44O Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1
H-NMR và 13C-NMR (xem bảng 4.7)
3.1.4. Tinh sạch β-1,3/1,6 glucan (lentinan) từ nấm hương (sơ đồ 3.3)
Phân đoạn polysaccharide P1 (25,2 g) thô từ nấm hương được hòa tan
trong 2 L nước và được làm đồng nhất tạo thành dịch có màu nâu. Nhỏ từng giọt cetyltrimethylammonium hydroxide (CTAOH) 0,2 M (pH 13,2) vào dung dịch, khuấy đều cho tới khi nhận được các sợi kết tủa trắng (tại pH 1011,5). Kết tủa được thu bằng cách ly tâm (9.000 vòng/phút trong 5 phút), rửa bằng ethanol, hòa lại trong 20% axit axetic và khuấy đều trong 5 phút tại 0C. 4 lần thể tích ethanol 95% được bổ sung vào và thu nhận kết tủa. Kết tủa được rửa 2 lần bằng ethanol và làm khô (P1-1).
Polysaccharide P1-1 tiếp tục được hòa trong 50% axit axetic, khuấy đều 5 phút tại 0C, ly tâm thu kết tủa. Phần kết tủa được hòa trong 6% NaOH và ly tâm loại bỏ cặn. Tiếp theo, bổ sung vào phần dịch 4 lần thể tích ethanol 95%. Thu kết tủa và rửa kỹ 2 lần bằng ethanol, tiếp theo rửa bằng ether (1 lần). Cô quay chân không làm khô tại nhiệt độ phòng, thu bột polysaccharide. Bột được loại bỏ protein tạp nhiễm bằng phương pháp Sevag (sử dụng chloroform và butanol tủa protein). Loại bỏ kết tủa protein và thu phần dịch. Dịch được bổ sung 4 lần thể tích ethanol 95% tạo kết tủa. Thu kết tủa, rửa bằng ethanol và ether. Kết tủa được làm khô là polysaccharide đã tinh sạch (lentinan) (NH-
57
Sơ đồ 3.3. Sơ đồ tinh sạch β-1,3/1,6 glucan từ nấm Hương
3.2. Nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học của nấm hầu thủ
3.2.1. Phân lập các hợp chất từ quả thể nấm hầu thủ (sơ đồ 3.4)
Nấm hầu thủ khô (2 kg) được tiến hành chiết siêu âm với ethanol ba lần. Phần dịch chiết (dùng để phân lập các hợp chất phân tử lượng nhỏ) và phần bã nấm (phần bã được sấy khô để làm nguyên liệu tách chiết polysaccharide) được tách riêng.
Các dịch chiết ethanol được gộp lại và cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được cặn chiết ethanol (25 g). Dịch cô này được hoà tan vào 1 L nước cất sau đó được chiết lần lượt với các dung môi n-hexan, ethyl axetat và
butanol (mỗi dung môi chiết 3 lần) và tiến hành cất loại dung môi dưới áp suất
P1 (25 g)
2L nước, khuấy. Tủa với CTAOH 0.2M CTA-OH K. tủa 20% acetic acid K. tủa 50% acetic acid K. tủa
Hòa tan trong 6% NaOH Dịch tan
Ethanol, 3 V K. tủa
Loại protein bằng phương pháp Sevag Polysaccharide tinh sạch (15,2 g)
58
giảm thu được các cặn chiết tương ứng là: cặn n-hexan (15 g), cặn ethyl axetat (7 g) và cặn butanol (3 g) (sơ đồ 3.4).
Cặn chiết n-hexan (15 g) có hoạt tính (xem kết quả bảng 4.12 và 4.13)