Nấm L .edodes thuộc giới nấm (kingdom – fungi), ngành (phylum) nấm đảm Basidiomycota, lớp (class) nấm đồng đảm Homobasidiomycetes, bộ (order) nấm tán Agaricales, họ (family) nấm hương Agaricaceae, chi (genus) nấm hương Lentinus và loài (species) edodes. Đây là đối tượng nấm lớn dược
liệu đầu tiên cho ngành công nghệ sinh học. Nấm hương được trồng phổ biến thứ hai trên thị trường thế giới (chỉ sau nấm mỡ Agaricus bisporus), đóng góp
giá trị dinh dưỡng và giá trị dược liệu. Nấm hương còn được gọi là nấm đông cô (Trung Quốc), shiitake (Nhật Bản).
Nơi sống và sự phân bố
Nấm hương mọc ở trên thân các cây gỗ như sồi, thích, dương, thiết mộc, dâu tằm trong điều kiện khí hậu nóng và ẩm. Chúng phân bố ở tự nhiên ở các nước thuộc vùng Đông Á như Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, New Guine, ở Đông Nam Á như Việt Nam, Thái Lan. Ở Việt Nam, nấm hương mọc ở các vùng rừng núi như Tuyên Quang, Hòa Bình, Thái Nguyên, Cao bằng, v.v.. Trung Quốc và Nhật Bản là nước trồng nhiều loại nấm này (Chang, 1999; Chang và Miles, 2004) [27,29].
Giá trị thực phẩm và dinh dưỡng (Wasser, 2005)
Nấm hương là loại nấm ăn được có giá trị dinh dưỡng cao. Quả thể khô nấm rất giầu carbohydrate và protein. Chúng chiếm 5860% carbohydrate, 2023% protein, 910% xơ, 34% chất béo và 4-5% tro. Nấm là nguồn cung cấp vitamin, đặc biệt tiền vitamin D2 (ergosterol). Chúng cũng chứa vitamin
36
nhóm B như vitamin B1, B2, B12 và pantothenic acid. Hàm lượng các chất khoáng (mg/g) gồm K, 15,1; Ca, 22; Mg, 4478; Mn, 1,2; Cd, 0,96; Fe, 2,36; Ni, 52,5; Cu, 89,1; P, 281; Zn, 282; Ge, 3; Br, 11,4; và Sr, 164 [168].
Các polysaccharide tan trong nước ước tính từ 15% trọng lượng khô. Ngoài ra, các polysaccharide giống như glycogen là (1,4)-, (1,6) α-D-glucans,
lentinan (β- 1,3/1,6 glucan), heterogalactan, heteromannan, xyloglucan … cũng có trong quả thể nấm. Các polysaccharide không tiêu hóa được (chất xơ) bao gồm heteroglycan, polyuronide, β-glucan và chitin. Các đường tự do gồm
trehalose, glycerol, mannitol, arabinol, mannose và arabinose [168].
Các axit béo chiếm 3,38% tổng số lipid, và gồm linoleic acid (18:2), 72,8%; palmitic acid (16:0), 14,7%; oleic acid (18:1), 3,0%; tetradecenoic acid (14:1), 1,6%; stearic acid (18:0), 0,9%; và myristic acid (14:0), 0,1%.
Các chất thơm chứa nhóm alcohol, ketone, sulfide, alkane, acid béo. Chất bay hơi, có mùi thơm là matsutakeol (octen-1-ol-3) và ethyl-n-amyl ketone. Chất tạo vị ngon, dễ chịu gồm monosodium glutamate, 5’nucleotides, amino acid tự do, các peptide phân tử thấp, acid hữu cơ và đường. Các acid hữu cơ tạo nên mùi vị nấm gồm axit malic, fumaric, alpha keto glutaric, oxalic, lactic, acetic, formic và glycolic [168].
1.3.2.1. Trên thế giới
Hoạt tính sinh học và giá trị y học của nấm hương
Người Nhật Bản xưa đã coi nấm hương là “thuốc tiên của cuộc sống” bởi chúng tăng cường sinh lực và năng lượng. Hoạt tính sinh học ở nấm hương như kháng vi sinh vật, kháng ung thư, kháng vi rút, chống tiểu đường, mỡ máu, tim mạch v.v… được phát hiện ở cả quả thể và sợi nấm. Một vài chất có hoạt tính đáng chú ý ở nấm hương là lentinan (β-glucan tăng cường miễn dịch, chống ung thư…), lectin (protein phân tử lượng thấp chống ung thư, tăng miễn dịch) (Nikitina và cs., 2007) và eritadenine (giảm mỡ máu) (Sugiyama và cs., 1995) [121,151]. Nấm hương được sử dụng làm thuốc trị các bệnh liên quan đến suy
37
giảm miễn dịch (bao gồm cả AIDS), ung thư, tiểu đường, dị ứng môi trường, nhiễm nấm, cảm cúm, viêm nhiễm, và bệnh liên quan tiết niệu.
Bảng 1.5. Giá trị y học và một số chất hoạt tính từ nấm hương [20].
Tác dụng chữa bệnh Hợp chất có hoạt tính
Kháng u Lentinan (β-D-glucan), KS-2-α-mannan-peptide, LEM, LAP (Heteroglucan-protein), EP3.
Điều hòa miễn dịch Mannoglucan, polysaccharide-protein, glucan, lentinan, polysaccharide L-II.
Kháng vi sinh vật Lentinamicin
Kháng vi rút Lentinan, LEM, JL-18, EP3, EPS4
Kháng vi khuẩn LEM, Lenthionine, dịch chiết chloroform và ethyacetate. Kháng nấm Lentin
Chống mỡ máu, xơ vữa động mạch
Eriadenine (lentinacin, lentysine)
Chống viêm gan Lentinan, LEM, dịch chiết nước và dịch chiết cồn Chống vón cục máu Lectin
Chống oxi hóa Chất polyphenolic
Chú thích
Lentinan: β-1,3/1,6 glucan
Eriadenin: 2(R), 3(R)-dihydroxy-4-(9-adenyl) - butyric acid
LEM và LAP: dịch chiết nước nóng bột sợi nấm và dịch nuôi cấy nấm. Cả hai đều là glycoprotein chứa glucose, galactose, xylose, arabinose, mannose và fructose. LEM chứa thêm dẫn xuất của nuleic acid, vitamin B và ergosterol.
EP3: Một phân đoạn của LEM.
KS-2-α-mannan peptide: Phức mannan và peptide.
38
Hoạt tính kháng u, kháng các tác nhân gây ung thư và tăng cường miễn dịch
Lentinan được tinh sạch và nghiên cứu hoạt tính đầu tiên bởi tác giả Chihara (1970) [36]. Lentinan có hoạt tính chống ung thư mạnh hơn so với polysaccharide từ các nấm khác. Ở chuột CD-1 gây nhiễm Sarcoma-180, lentinan với liều 15 mg/kg 10 lần sẽ ức chế 9597,5% khối u và với lượng nhỏ tới 0,2 mg/kg 10, lentinan hồi phục 6/10 chuột nhiễm u (Chihara, 1970) [36]. Lentinan bám vào bề mặt tế bào bạch huyết làm hoạt hóa bạch cầu, tế bào trợ giúp loại T (T- helper cell), tế bào giết tự nhiên (NK), và các tế bào hỗ trợ khác. Qua đó, các kháng thể, interleukin (IL-1, IL-2) và IFN-ϒ được tăng sinh tổng hợp nhằm kiểm soát ung thư.
Nấm hương có khả năng tăng cường miễn dịch cao nhờ lentinan làm tăng hoạt tính tế bào giết tự nhiên (NK), tế bào độc tố T (CTL), tế bào giết hoạt hóa bởi lymphokine (LAK) và đáp ứng quá mẫn muộn (DTH) đối với các kháng nguyên của khối u.
Việc sử dụng lentinan giúp chuột giảm đáng kể mức độ nhiễm ký sinh trùng sốt rét Plasmodium yoelii, tăng sự sống sót. Nhờ đáp ứng miễn dịch,
lentinan làm tăng lượng IL-12, IFN-ϒ và NO (nitric oxit) ở tế bào lá lách chuột bị nhiễm ký sinh trùng (Zhou, 2009) [186]. Lentinan được cho chuột thí nghiệm uống qua đường miệng trong 7 ngày với lượng 3 mg trước khi gây u biểu mô ruột, kết quả làm giảm 94,44% kích thước khối u (Mah-Lee, 2002) [103].
Lee (2009) đã tinh sạch được 9 polysaccharide từ nấm hương, trong đó, 3 loại (CPFN-G-I, CPBN-G và CPBA-G) có tác dụng tăng NO, tăng lượng TNF-α và hoạt hóa đại thực bào [90].
Ngoài lentinan, 2 loại lectin (protein) là L-1 và L-2 ở nấm hương cũng được nghiên cứu. Các lectin ở nấm nói chung được cho là có khả năng giảm sự nhân lên của các tế bào ung thư bạch cầu M1, U937, tế bào ung thư gan Hep- G2. Ngoài ra, lectin từ nấm có hoạt tính tăng sự phân bào của tế bào lách, tế bào T và tăng sản xuất các chất IL-2, IFN-ϒ, TNF-α (Nikitina và cs., 2007)
39
[121]. Lectin nấm hương được sản xuất ở dịch nuôi cấy chìm sợi nấm. Lectin này có hoạt tính tăng sự phân bào của tế bào bạch huyết lách chuột và tế bào bạch huyết ngoại vi ở người (Moon và cs., 1995) [113]. Hơn nữa, lectin nấm hương có khả năng ngưng kết các tế bào ung thư người.
Các hoạt tính y-dược khác của nấm hương
Bên cạnh khả năng kháng u, tăng cường miễn dịch của nấm hương, nhiều hoạt tính sinh học khác cũng được nghiên cứu. Các phân đoạn chiết chloroform, ethyl acetate, nước nóng có hoạt tính kháng vi sinh vật gồm vi khuẩn, nấm men và nấm mốc (Bisen, 2010) [20]. Các hợp chất có hoạt tính kháng vi sinh vật gồm có lentinanmicin, lenthionine, β-ethyl phenyl alcohol
(Bisen, 2010) [20]. Nấm hương có hoạt tính chống virus cúm tương đương chất amantadine hydrochloride (chất chống cúm thông dụng). Dịch chiết nước nóng nấm hương ngăn cản sự nhân lên của virus polio. Lentinan giúp cơ thể kháng lại sự nhiễm vi khuẩn, nấm, ký sinh trùng và virus (gồm cả tác nhân gây AIDS). Lentinan làm giảm độc tố của thuốc AZT (azidothymidine) cho bệnh nhân AIDS, giảm các triệu chứng ban đầu của bệnh nhân. Ngoài lentinan và nhiều chất khác từ nấm hương cũng có tác dụng chống virus. Chất LEM từ nấm hương ngăn chặn sự phóng thích của virus Herpes simplex ở động vật và chất JLS-18 (dẫn xuất LEM) có tác dụng tốt trong điều trị viêm gan B và AIDS (Yamamoto, 1977) [174].
Ngoài ra, nấm hương có chứa chất eritadeine làm giảm lượng cholesterol trong máu. Tác động làm giảm cholesterol trong máu của eritadenine từ nấm hương trên cơ thể động vật đã được thử nghiệm và chứng minh [51].
Hoạt tính chống tiểu đường của polymer từ dịch nuôi cấy nấm hương có tác dụng giảm 21,5% lượng glucose trong máu và tăng lượng insulin lên 22,1% ở chuột. Polymer này còn làm giảm 25,1 và 44,5% lượng cholesterol tổng và triglyceride [20,75].
40
Một phân đoạn polysaccharide ở nấm hương có tác dụng bảo vệ gan và tăng kháng thể chống lại vi rút viêm gan B. Chất lentinan tăng chỉ số SGPT (glutamic pyruvic transaminase) và làm hồi phục mức GPT trong gan khi nhiễm virus (Bisen, 2010) [20].
Một số nghiên cứu tách chiết polysaccharide từ nấm hương
Chihara và cs. (1970) đã tách chiết được 6 loại polysaccharide trong dịch chiết nước nóng của nấm hương, trong đó có lentinan (-1,3/1,6-glucan) chiếm khối lượng nhiều nhất. Tuy nhiên, Rincao và cs. (2012) tách được polysaccharide có liên kết β-1,6 và 1,4 glucoside nhưng không phải β-1,3-
glucan [134].
Dịch chiết bằng axit thu được hàm lượng polysaccharide thấp hơn. Nhiều nghiên cứu về bản chất polysaccharide của phần dịch chiết axit nấm. Kim và cs. (2012) thấy rằng hàm lượng -glucan trong dịch chiết bởi axit là ít hơn 34 lần so với hàm lượng β-glucan trong dịch chiết nước nóng và chiết 50% ethanol kết hợp sóng vi tần [76]. Mizuno và cs. (1970) tách glucoxylan (Mw 155103) liên kết -1,3/1,6 bằng ammonium oxalate [109].
Surenjav và cs. (2006) đã tách thành công lentinan từ nấm hương bằng NaOH/NaBH4, và các hoạt tính kháng u được nghiên cứu, so sánh giữa các dạng cấu trúc khác nhau của lentinan [152].
1.3.2.2. Ở Việt Nam
Tác giả Lê Xuân Thám (2000; 2011) có các công trình nghiên cứu về đa dạng di truyền của nấm hương tại Việt Nam [8,9,10]. Năm 2000, nấm hương được bổ sung vào danh sách các nấm có hoạt tính chống ung thư (Lê Xuân Thám, 2000) [8].
Nguyễn Thị Chính (2005) cho thấy ở nấm hương có hoạt tính thủy phân tinh bột, cellulose, gelatin và nấm hương có hoạt tính kháng vi khuẩn B.subtilis và E.coli [2].
41
Tác giả Bùi Thị Kim Tuyền (2010) lên men dịch thể nấm hương và xác định hàm lượng polysaccharide tổng số ở sợi nấm. Hoạt tính sinh học và cấu trúc hóa học của polysaccharide của nấm này chưa được nghiên cứu [12].
Hiện nay, ở Việt Nam chưa có công trình khoa học nghiên cứu chất có hoạt tính từ nấm hương.
1.4. Mô hình nuôi cấy tế bào ung thư ba chiều (3-D) trong nghiên cứu ung thư
Nghiên cứu thử nghiệm thuốc trước lâm sàng thường ít thành công, chỉ với 5% số chất qua được thử nghiệm giai đoạn III cho độ an toàn và hiệu quả. Nhiều hệ thống mẫu, với những ưu nhược điểm riêng, được dùng để nghiên cứu các thành phần phức tạp của khối u và cách chữa trị. Hệ thống mẫu tốt yêu cầu phải rẻ tiền, thích hợp sàng lọc nhiều mẫu, và quan trọng nhất là phản ánh sinh học ung thư ở người. Mô hình nuôi cấy 2 chiều (2D) đơn giản là nuôi cấy chìm các dòng tế bào (tách từ khối u người hay động vật) trong môi trường và tế bào phát triển một lớp phẳng (flat monolayer), liên hệ với nhau qua tiếp xúc ngoại vi. Phương pháp nuôi cấy tế bào kiểu 2 chiều (2D) thiếu tổ hợp cần thiết. Trong khi thử nghiệm ở động vật là đắt tiền và mất thời gian và hay thất bại khi phản ánh sinh học ung thư ở người. Nuôi cấy tế bào 3 chiều (3D) được cho là cấu nối giữa thí nghiệm in vitro nhằm phát hiện và sàng lọc và thí nghiệm in vivo để đánh giá tính hiệu quả và sự an toàn trước khi thử nghiệm lâm sàng
thuốc. Sự cùng phát triển của nhiều loại tế bào trong khối u sẽ cho phép phân tích tế bào có kiểm soát và lặp lại được nhằm đưa ra phác họa thật sự về các phản ứng in vivo đối với xử lý thực nghiệm.
Nuôi cấy tế bào 3 chiều (3D) có thể giúp tăng nhanh sự tìm kiếm và tiết kiệm chi phí khi phát triển các mô hình sàng lọc trước khi thử lâm sàng, kiểm tra cũng như trong nghiên cứu và phát triển các liệu pháp chữa bệnh. Ngoài việc giúp ta hiếu sâu hơn về tính nội cân bằng, sự biệt hóa tế bào và tổ chức mô, phương pháp nuôi cấy 3D còn cung cấp môi trường xác định (chủ động) để nghiên cứu hơn là môi trường phức tạp của cơ thể (in vivo) (Thoma và cs,
42
2014) [155]. Khối u phát triển 3D là tập hợp nhiều loại tế bào gồm tế bào ung thư bị biến gen và cùng với các tế bào tổ tiên không biến đổi gen (biểu mô), các tế bào miễn dịch xâm nhập, các nguyên bào sợi v.v... Sự phát triển và duy trì của các mô phụ thuộc vào chuỗi các tương tác giữa các tế bào trong một vi môi trường chứa các yếu tố phát triển, hocmon và các phân tử đính cũng như các hệ thống phân tử ngoại bào phức tạp khác. Việc đồng thời nuôi cấy tế bào điều kiện 3D cho phép nghiên cứu sự tương tác tế bào với tế bào, tế bào với hệ thống ngoài, sự biệt hóa tế bào, sinh sản, chết theo chương trình và biểu hiện gen (Kim, 2005) [74]. Nuôi cấy 3D tế bào ung thư là gần giống với chúng ở dạng in vivo xét về hình dạng tế bào và môi trường. Điều này quan trọng bởi
bởi hình dạng tế bào và môi trường sẽ xác định tính chất và biểu hiện gen của
tế bào.
Có 5 lý do để nhà nghiên cứu ung thư chọn nuôi cấy tế bào 3D (Kimlin và cs., 2011) [80]:
+ Khi nuôi cấy 2D, tế bào phát triển giống nhau và không có sự sai khác về oxy, dinh dưỡng, tác nhân sinh trưởng. Tế bào được nuôi cấy 3D sẽ tạo ra các vùng phát triển khác nhau và khối u có hình cầu với sự khác nhau về oxi, dinh dưỡng, tác nhân sinh trưởng trong khối. Vì vậy, nuôi cấy 3D dùng nghiên cứu hình dạng khối u và sự khác biệt giữa các dòng tế bào từ khối u tách từ bộ phận hay mô khác nhau.
+ Các tế bào nuôi cấy 3D có thể gia tăng sự kháng lại thuốc hơn so với nuôi cấy 2D. Tế bào bên trong lõi sẽ được bảo vệ bởi tế bào ngoài, giúp ngăn chặn thuốc xâm nhập vào trong.
43
+ Sự đa dạng của tế bào nuôi cấy 3D là do tốc độ phát triển khác nhau, biểu hiện gen khác nhau. Điều này dẫn tới thay đổi hình thái và chức năng.
+ Tế bào nuôi cấy 3D có sự biểu hiện gene khác nhau, khi so sánh với nuôi cấy 2D. Tế bào có sự giao tiếp khác nhau với hệ thống ngoài và tế bào biểu mô, dẫn tới thay đổi truyền tín hiệu nội bào.
+ Tế bào nuôi cấy 3D phát triển giống với tế bào phát triển trong khối u sống. Điều đáng chú ý nhất trong nuôi cấy 3D là khả năng điều chỉnh mỗi thành phần của hệ vi môi trường khối u thử nghiệm và hiểu rõ sự điều khiển bệnh.
44
CHƯƠNG II. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
2.1.1. Nấm hương
Chủng nấm hương Lentinula edodes (Berk.) Pegler được lưu giữ tại Phòng Sinh học thực nghiệm, Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên.
Nấm hương thành phẩm khô (quả thể) được cung cấp bởi Viện Di truyền Nông nghiệp, Hà Nội.
2.1.2. Nấm hầu thủ
Chủng nấm hầu thủ ((Hericium erinaceus (Bull.:Fr.) Pers) được lưu giữ
tại Phòng Sinh học thực nghiệm, Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên.
Nấm hầu thủ thành phẩm khô (quả thể) được cung cấp bởi Viện Di truyền Nông nghiệp.
2.2. Dụng cụ, hóa chất và môi trường
2.2.1. Dụng cụ và thiết bị
Các thiết bị nuôi cấy vi sinh
Tủ cấy vi sinh - Box laminar PII (Đức); Tủ ấm– Memmert (Đức); Cân điện tử AL300 – Thụy Sỹ; Nồi khử trùng Lequenx (Pháp); Máy lắc thường Gerhardt (Đức); Kính hiển vi thường Olympus (Nhật Bản); Bình lên men 2 L, 5 L; Nồi lên men 15 L; Tủ lạnh Sanyo (Nhật Bản)
Các thiết bị đánh giá hoạt tính
Kính hiển vi soi ngược, tủ ấm CO2, tủ ấm thường, tủ lạnh sâu -80oC, máy đọc quang dùng cho phiến 96 giếng, máy trộn vortex, các bộ lọc, bộ pipet-man các cỡ...
2.2.2. Môi trường
Môi trường dùng nuôi cấy nấm (g L1): glucose 10, pepton 5, cao nấm men 3, K2HPO4 0,5, KCl 0,5, CaCO3 1, nước chiết 200 gr khoai tây, pH 5,56,0. Môi trường được khử trùng 110C, 30 phút.
45
Môi trường đánh giá hoạt tính gây độc tế bào
- Môi trường MEME (Minineal Essential Medium with Eagle’s salts) bổ sung 710% huyết thanh bê tươi, 1% dịch kháng sinh PSF (potassium penicillin - streptomycin - fungizone) và 1% NAA (non-essential amino acid).
- Hoặc môi trường DMEM (Dullbecco’s modified Minimum Essential Medium): 10% huyết thanh bê tươi, 1% dịch kháng sinh (PSF), 1% NAA.
Dịch kháng sinh PSF: 100 đơn vị penicillin/mL, 100 g streptomycin sunfat/ml, 0,25 g amphotericin B/mL.
Đệm PBS (phosphate bufferred saline, g/L): NaCl 8; KCl 0,2; Na2HPO4
1,15; KH2PO4 0,2; Khử trùng 1 atm trong 30 phút.
2.3. Các phương pháp phân lập các hợp chất