Thủy phân không hoàn toàn β-1,3-glucan từ nấm hầu thủ bằng enzyme -

enzyme -1,3-glucanase

-1,3- glucan được hòa trong đệm Na-citrate 25 mM (pH 5,0) nồng độ 5 mg/mL, bổ sung 5% enzyme -1,3-glucanase chuẩn (1 U/mL). Hỗn hợp được ủ

Cột DEAE cellulose (Cl -) Tinh sạch 1 (40g) Cột Sapharose CL6B Tinh sạch 2, β-1,3/1,6 glucan (14,54g) P 3(160 g)

63

45C trong các khoảng thời gian 5, 15, 60 và 120 phút. Sau phản ứng, enzyme được bất hoạt tại 100C trong thời gian 15 phút.

Bảng 3.1. Kết quả thủy phân không hoàn toàn β-1,3-glucan từ nấm hầu thủ bằng enzym -1,3-glucanase

Thời gian ủ với enzyme (phút)

0 5 15 60 120

Đường khử (mg/mL)* 0,006 0,011 0,03 0,075 0,135

Tỉ lệ đường khử/glucan (%) 0,12 0,22 0,6 1,5 2,7 *: Đường khử: mỗi đơn vị đường khử có một nhóm aldehyde.

4 mẫu phản ứng được trộn lại và kết tủa lần lượt trong 25, 40 và 70% ethanol (nồng độ cuối cùng), giữ ở nhiệt độ phòng qua đêm và ly tâm thu được 3 phân đoạn cặn β-glucan. Khối lượng phân tử của 3 phân đoạn được kiểm tra qua cột Sephadex G-100, với 3 đỉnh polysaccharide riêng rẽ, chứng tỏ chúng có độ dài mạch polymer khác nhau. Kí hiệu 3 phân đoạn polysaccharide là: HT- GL1, HT-GL2, HT-GL3 có tỉ lệ về khối lượng tương ứng là 73:50:31. Trọng lượng phân tử của 3 phân đoạn được xác định bằng sử dụng cột lọc phân tử, dùng các dextran (hãng Sigma) chuẩn là T-10, T-40, T-70, T-500, và T2000 (tương ứng Mw là 10103., 40103, 70103, 500103 và 2000103 Da)

Lượng đường khử của phản ứng enzyme cũng được đo nhằm đánh giá hiệu quả thủy phân (đường khử tạo bởi nhóm aldehyde của các oligo hay polymer của glucan). Thời gian enzyme phản ứng với β-1,3/1,6-glucan càng

64

lâu, lượng đường khử tạo thành càng nhiều, do polymer bị cắt nhỏ dần. Dung dịch DNS (3,5 dinitrosalicylic acid) được dùng để hiện mầu nhận biết gốc đường và cường độ mầu đo ở bước sóng 540 nm (Miller, 1959) [87].

Sơ đồ 3.7. Sơ đồ tạo β-1,3/1,6 glucan mạch ngắn bằng emzyme 3.2.6. Sử dụng β-1,3/1,6-glucan từ nấm hầu thủ làm chất mang curcumin

Tạo hỗn hợp Cur-Glu: 100 mg curcumin tinh khiết được hòa vào 100 mL ethanol tuyệt đối. 20 mg glucan tách được từ nấm hầu thủ được hòa vào 20 mL H2O đã loại ion. Hai dung dịch curcumin và glucan được trộn vào nhau và khuấy đều trên máy khuấy từ trong điều kiện chân không tại nhiệt độ phòng trong vòng 48 giờ. Dung môi được bay hơi từ từ ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ.

Dịch -Glucan

5% β- glucan (5mg/ml) trong đệm Na-citrate 25mM

enzyme

D2 D3 D4

Bất hoạt enzyme, 100C

Tủa EtOH tới 25%

Tủa EtOH tới 40% HT-GL1 HT-GL3 HT-GL2 5’ 15’ 60’ 120’ Dịch Dịch Tủa EtOH 70% Dịch D1

65

Phức Cur-Glu (dịch nổi) được thu hồi bằng ly tâm. Phần Cur không được bao (kết lắng) được loại bỏ.

Phần dung dịch Cur-Glu thu được được đem đi đông khô thu được Cur- Glu dạng bột.

Hiệu suất của phản ứng mang Cur bởi Glu là 100-20/100 = 80%

Sản phẩm khi hòa tan trong nước thể hiện tính tan tốt và tạo thành dung dịch có màu vàng trong suốt.

Sơ đồ 3.8. Sơ đồ tạo hỗn hợp Cur-Glu từ β-1,3/1,6 glucan và curcumin

Curcumin tinh khiết EtOH tuyệt đối Dịch curcumin  glucan H 2O loại ion Dịch -glucan

Khuấy đều tại RT, 48 giờ

Hỗn hợp A

Làm bay hơi từ từ dung môi ở nhiệt độ trong phòng trong thời gian 24 h

DD B

Ly tâm 3 lần dung dịch Cur-Glucan, loại bỏ phần Cur không được bao lắng xuống

Dung dịch Cur-Glu Đông khô

66

3.3. Tạo chế phẩm thử nghiệm

Từ phân đoạn polysaccharide P3 của nấm hầu thủ, chúng tôi tạo ra 01 sản phẩm thử nghiệm ký hiệu HG1, có thành phần gồm: 35% β-1,3/1,6-glucan; 0,1% là các chất có hoạt tính khác trong nấm hầu thủ; 64,9% chất mang.

3.4. Thử dược lý chế phẩm

3.4.1. Nghiên cứu độc tính cấp

Thí nghiệm được tiến hành với các nhóm chuột nhắt trắng, trọng lượng trung bình là 20 ± 2,0 g. Trước khi cho chuột uống HG1, chuột được chuẩn bị trước 16 giờ. Chế phẩm nghiên cứu HG1 được cho chuột uống với các mức liều tăng dần. Trong số các mức liều đem thử, khoảng cách giữa mức liều cao nhất chưa gây chết một con chuột nào và mức liều thấp nhất gây chết 100% số chuột trong nhóm được sử dụng để tính toán. Sau khi cho uống HG1, chuột được nuôi dưỡng và theo dõi chu đáo, ăn thức ăn tổng hợp do xưởng sản xuất thức ăn động vật thí nghiệm cung cấp, nước uống ad libitum. Thời gian theo dõi liên tục trong 72 giờ. Số chuột chết được đếm theo nhóm.

Tính toán: theo phương pháp cải tiến của Livschitz (1986) theo công thức sau:

Trong đó:

n: số động vật sử dụng trong từng nhóm thí nghiệm k: số nhóm động vật

mi: số động vật chết đếm được theo từng nhóm trong 72 giờ d: khoảng cách giữa các mức liều

xi: liều độ MB ở mức liều cao nhất

zi: hệ số phụ tính từ công thức zi = 2k - 1 - 2i (i lấy các giá trị từ 1, 2, 3, ..., k-1).

67

Căn cứ vào kết quả LD50 dùng phép ngoại suy cho liều dùng trên động vật, chúng tôi sử dụng cho uống chế phẩm bán trường diễn 2 mức liều thấp và cao.

Phương pháp được mô tả bởi Abrham (1978) [13] và theo quy định của WHO (2000) [169] và Bộ Y tế về hiệu lực và an toàn trong nghiên cứu thuốc có nguồn gốc thiên nhiên.

Nghiên cứu ảnh hưởng của HG1 khi cho động vật uống bán trường diễn đối với trọng lượng cơ thể và khối lượng gan, lách, thận

Dùng các nhóm chuột nhắt trắng khỏe mạnh, đủ điều kiện thí nghiệm, có trọng lượng trung bình 20 ± 2,0g. Nhóm chứng cho uống dung môi (không chứa HG1)  0,2mL mỗi con một lần trong ngày. Nhóm HG1 thử cho uống 2 mức liều căn cứ vào LD50 của HG1, liên tục trong 42 ngày. Theo dõi bằng các chỉ tiêu: tập tính động vật, lượng thức ăn tiêu thủ, lượng nước uống được theo dõi theo từng nhóm. Kết thúc đợt uống HG1, chuột được giết, phẫu tích bóc tách các tạng gan, lách, thận, đánh giá các tổn thương đại thể bằng kính lúp.

Khối lượng mỗi tạng được cân bằng cân phân tích. Khối lượng này được so sánh giữa các nhóm bằng tỉ lệ so với trọng lượng cơ thể của chúng (10 g TLCT của CNT). Xử lý số liệu theo nghiệm pháp t-Student; so sánh từng cặp và test trước-sau. Sự khác biệt có ý nghĩa khi p < 0,05.

Nghiên cứu ảnh hưởng của HG1 với các chỉ tiêu huyết học của động vật thí nghiệm cho uống trường diễn (Abrham, 1978 [13]; Turner A.,1965 [156];

WHO, 2000 [169]; Bộ Y tế - Cộng hòa xã hội chủ nghĩa Việt Nam,1996; Samuel Irwin, 1967) [136]

Các lô chuột nhắt trắng khỏe mạnh, trọng lượng 20 ± 2,0 g được dùng cho thí nghiệm này. Cho uống HG1 liều 3,0 g/kg thể trọng, liên tục trong 42 ngày. Trước thí nghiệm và sau khi thí nghiệm, lấy máu xét nghiệm. Số lượng hồng cầu, lượng haemoglobin, số lượng bạch cầu, tiểu cầu được định lượng trên máy xét nghiệm tự động tại lab cận lâm sàng - Viện Bỏng Quốc gia - Học viện Quân y. Đánh giá ảnh hưởng của HG1 đối với các tế bào máu. So sánh

68

giữa các nhóm thử và nhóm chứng. Xử lý theo nghiệm pháp t-Student, trước và sau dùng HG1 trong từng nhóm và giữa các nhóm với nhau.

Nghiên cứu ảnh hưởng của HG1 khi cho uống dài ngày đối với chức năng gan, thận qua các thông số hóa sinh (Bộ Y tế - Cộng hòa xã hội chủ nghĩa Việt Nam

1996; Samuel Irwin, 1967) [1,136].

Dùng các nhóm chuột, cho uống liên tục HG1, liều 3,0 g/kg thể trọng, nhóm chứng dùng dung môi. Tại các thời điểm trước và sau thí nghiệm, các nhóm chuột được lấy máu xét nghiệm. Định lượng các enzym transaminase (AST, ALT, gamma GT), định lượng creatinin để đánh giá chức năng gan, thận theo phương pháp của Bergmeyer H.U. (1986) [19] trên máy xét nghiệm tự động tại lab cận lâm sàng - Viện Bỏng Quốc gia - Học viện Quân y.

Nghiên cứu tác dụng của HG1 đối với các biến đổi mô bệnh học ở gan, thận, lách động vật thí nghiệm (theo phương pháp của Abrham, 1978 [13]).

Các mẫu gan, thận, lách được lấy trước và sau khi cho động vật uống HG1 bằng cách giết chuột, phẫu tích các mẫu gan, thận, lách, cố định bằng formol, đúc chuyển qua các dung dịch để loại nước, rồi đúc trong khối parafin, cắt lát dày 56 µm bằng máy Microtome Sartorius Werke. Nhuộm tiêu bản bằng phương pháp Hematoxylin - Eosin (HE). Đọc tiêu bản bằng kính hiển vi quang học với độ phóng đại 100200 lần. Chụp ảnh qua kính hiển vi huỳnh quang ở độ phóng đại 200400 lần. Đánh giá các tổn thương theo từng nhóm và so sánh. Xử lý số liệu thu được bằng phương pháp mô tả hình thái giải phẫu bệnh lý trên mẫu tiêu bản và trên ảnh chụp được từ các tiêu bản trên.

3.4.3. Nghiên cứu một số tác dụng của sản phẩm HG1 trên động vật thực nghiệm nghiệm

Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của HG1 trên mô hình gây độc gan bằng carbon tetracholorid

Chuột nhắt trắng được chia thành 3 nhóm:

Nhóm 1: Nhóm chứng sinh học (không gây độc gan)

69

Nhóm 3: Dùng chế phẩm HG1 điều trị dự phòng 7 ngày liên tục liều 3,0 g/kg TLCT theo đường uống, sau đó gây độc bằng cách tiêm carbon tetrachlorid. Gây độc gan cấp bằng tetrachlorid

Chuột nhóm 2 và 3 được tiêm phúc mạc carbon tetrachlorid liều 4,2 mL/kg TLCL.

Các chỉ tiêu đánh giá mức độ tổn thương tế bào gan và hiệu quả điều trị: Hoạt độ enzyme AST, ALT và γGT trong huyết thanh chuột

Khối lượng gan tính theo 10 g TLCT chuột.

Phương pháp nghiên cứu tác dụng của HG1 đến quá trình tổng hợp protein trên động vật khi dùng bán trường diễn

Phương pháp được mô tả bởi Samuel (1967) [136].

Các nhóm chuột nhắt trắng nuôi trong cùng điều kiện. Các nhóm nghiên cứu và nhóm chứng thức ăn tổng hợp như nhau, nhóm nghiên cứu cho uống hàng ngày 3,0 g/kg TLCT /24 h chế phẩm HG1 sau 6 tuần dùng, các nhóm động vật được lấy máu định lượng protein toàn phần trên máy xét nghiệm hóa sinh tự động (WHO, 2000) [169].

Tính toán: lượng protein toàn phần được so sánh trước và sau thử nghiệm (nghiệm pháp trước - sau).

Nghiên cứu tác dụng trên hệ miễn dịch của HG1 thực nghiệm

Theo phương pháp của Santos và Mansour (1968) và Phạm Mạnh Hùng (1984) [138,4]

Động vật thí nghiệm: CNT 68 tuần tuổi, trọng lượng 20,0g ± 2,0 g được dùng cho thí nghiệm này.

Các nhóm động vật thí nghiệm gồm: CNT được gây suy giảm miễn dịch (SGMD) thực nghiệm bằng cách chiếu xạ bằng nguồn chiếu xạ telecobalt 60 (60Co) suất liều 7,0 Gy và được điều trị bằng chế phẩm HG1 cho uống trước để dự phòng.

70

Đối chứng sinh học (ĐCSH): CNT được nuôi trong điều kiện phòng thí nghiệm (20C, 12/12 giờ sáng/tối, yên tĩnh).

Đối chứng SGMD: CNT được gây SGMD bằng cách chiếu xạ 7,0 Gy, sau đó không dùng gi, nuôi như ĐCSH.

Nhóm NC: được gây SGMD thực nghiệm, cho uống HG1 với 2 mức liều ngoại suy căn cứ vào kết quả nghiên cứu độc tính cấp và bán trường diễn.

Các chỉ tiêu đánh giá:

Tỷ lệ (%) chuột sống/chết trong vòng 30 ngày kể từ sau khi chiếu xạ. Khối lượng trung bình của tuyến ức, hạch lympho vùng nách và khối lượng của lách so với trọng lượng cơ thể (TLCT). Đánh giá sự thay đổi mô học của tuyến ức, hạch lympho và lách.

Số lượng tế bào tủy, bạch cầu, coloni lách ở chuột nhắt trắng. Số lượng bạch cầu, hồng cầu, tiểu cầu máu ngoại vi.

Tỷ lệ thực bào và chỉ số thực bào.

Phản ứng quá mẫn với kháng nguyên (KN) đặc hiệu: gây mẫn cảm chuột nhắt bằng kháng nguyên albumin lòng trắng trứng (OVA). 4 ngày sau khi gây mẫn cảm, thử thách với kháng nguyên OVA bằng cách tiêm kháng nguyên vào dưới da gan bàn chân chuột nhắt trắng. Đánh giá đáp ứng quá mẫn muộn với kháng nguyên OVA tại các thời điểm 24 h, 48 h, 72 h và 96 h sau thời điểm tiêm.

3.4.4. Nghiên cứu thử hiệu lực kháng u thực nghiệm trên động vật của sản phẩm HG1 phẩm HG1

Động vật thí nghiệm

Chuột nhắt trắng trọng lượng 20,0  2,0 g đạt tiêu chuẩn nghiên cứu. Động vật thí nghiệm được nuôi dưỡng theo quy định trong phòng thí nghiệm chuyên dụng dược lý 1 tuần trước khi làm thí nghiệm.

Nghiên cứu thử hiệu lực kháng u thực nghiệm của HG1

71

Chuẩn bị dịch tế bào hồng cầu: Thu máu từ chuột dòng CD1 (20 g): Chuột được gây mê bằng diethyl ether, nhanh chóng mổ ngực của chúng và lấy máu bằng cách chọc nóng trong dung dịch đệm PBS 10 mM pH 7,4 lạnh (4C) - không dùng thuốc chống đông máu. Hồng cầu được rửa 3 lần với PBS, dùng ít nhất 10 lần thể tích dung dịch rửa, ly tâm 5 phút ở tốc độ 1500 v/p. Nồng độ hồng cầu đạt mức OD 1,0 ở 700 nm ở những mẫu chưa cho tan huyết.

Với thử nghiệm tan huyết, 10 µL dung dịch mẫu thử nghiệm được pha với 90 µL dung dịch hồng cầu 5% trên phiến 96 giếng trong 1 giờ (37C). OD được theo dõi liên tục ở 700 nm (Specord UV-VIS).

Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào in vitro trên tế bào ung thư cổ trướng Ehrlich (EAC)

Dòng tế bào 4N Ehrlich được sử dụng trong thí nghiệm này. Các tế bào ung thư EAC được nuôi cấy trong ổ bụng của chuột bằng phương pháp tiêm vào khoang cơ thể chúng. Dòng chuột CD1 được sử dụng trong thí nghiệm này. Tế bào được thu lại sau 7 ngày nuôi cấy. Chuột được gây mê với diethyl ether và nhanh chóng mổ ổ bụng để lấy các tế bào ung thư (bằng xi lanh). Các tế bào được rửa 3 lần với buffer muối (saline buffer) pH 7,4, dùng ít nhất 10 thể tích lần dung dịch rửa, ly tâm 5 phút ở tốc độ 1000 rpm; sau đó tạo lại dung dịch tế bào với saline buffer (nồng độ 2106 tế bào/mL).

Với thử nghiệm gây độc tế bào, 10 µL dung dịch mẫu thử nghiệm trong DMSO được pha với 90 µL dung dịch tế bào trên phiến 96 giếng trong 1 giờ (37C). Tổng tế bào và số tế bào sống được đếm qua kính hiển vi với thuốc nhuộm Trypan Blue 0,17%.

Hoạt tính gây độc tế bào được tính theo công thức sau: Inhibition (%) =A/Ao 100, với Ao là tổng số tế bào khi chưa có mẫu và A là số tế bào nhuộm màu (tức tế bào chết) có bổ sung mẫu.

Đánh giá hoạt tính chống u in vivo đối với tế bào ung thư biểu mô cổ trướng Ehrlich (EAC)

72

Chuột đực của dòng CD1 từ 68 tuần tuổi với cân nặng 20 g được sử dụng. 40 động vật thử nghiệm được dùng trong thí nghiệm này. Mỗi nhóm thí nghiệm gồm 10 động vật thử nghiệm.

Tế bào ung thư Ehrlich được tiêm vào khoang cơ thể của chuột với nồng độ 2106 tế bào/mL. Cho chuột dùng chế phẩm HG1 bắt đầu 1 ngày sau khi cấy khối u. Hỗn hợp pha trong 1% DMSO và dầu olive với các liều 100, 10 và 1 g/kg được thêm vào mỗi chuột 1 ngày 1 lần, trong 5 ngày (5 liều). Nhóm đối chứng chỉ có 1% DMSO và dầu olive. Chỉ số tăng tuổi thọ (ILS, %) được tính theo công thức sau: ILS = (T/C)  100%, với T và C lần lượt là tuổi thọ trung bình (ngày) của chuột nhóm thử nghiệm và nhóm đối chứng.

Đánh giá hoạt tính chống u trên tế bào ung thư biểu mô cổ trướng Ehrlich (EAC)bằng MRI

Chuột BALB/c đực 68 tuần (trọng lượng khoảng 26 g) tuổi được sử dụng. Tế bào Ehrlich được cấy vào chuột ở dưới xương đòn vai phải với nồng độ 5106 tế bào/mL. Cho chuột dùng mẫu thử nghiệm 1 ngày sau khi cấy khối u. Tác dụng chống di căn được ước tính khi sự phát triển của khối u bị kiềm hãm (so sánh với đối chứng), bắt đầu từ ngày thứ 7 sau khi thấy xuất hiện khối u.

Sử dụng kỹ thuật MRI để ước tính khả năng kiềm hãm khối u Ehrlich sau mỗi 2 ngày kể từ ngày thứ 7 sau khi cấy với tế bào ung thư (ở nhóm đối chứng và nhóm thử nghiệm). Chuột được gây mê với xylazine (13 mg/kg trọng lượng