Tách phân đoạn và đánh giá hoạt tính chống ung thư

Quả thể nấm hầu thủ khô được chiết và tách phân đoạn như miêu tả ở sơ đồ 3.4 (mục 3.2.1). Từ dịch chiết ethanol, chúng tôi đã tách được 3 phần chiết (cặn n-hexan, cặn etyl axetat, cặn butanol). Từ bã nấm chiết tách được 03 phân đoạn polysaccharide (P1-HT, P2-HT, P3-HT). Ngoài ra, từ dịch lên men nấm hầu thủ tách được phân đoạn polysaccharide P4-HT (xem mục 3.2.2).

Các phân đoạn polysaccharide thô cũng được xác định hàm lượng polysaccharide. Kết quả được trình bày ở bảng 4.11.

Bảng 4.11. Hàm lượng polysaccharide trong các phân đoạn tách chiết nấm hầu thủ và nấm hương Mẫu Dịch thể (g/L) (P4) 100 g quả thể Chiết nước nóng (P1) Chiết axit (P2) Chiết kiềm (NaOH 1M) (P3) Polysaccharide* (**) 3,6 (1,52) 6 (2,5) 1,5 (1,2) 16,0 (12,1)

*: Lượng chất thô giầu polysaccharide trong 100 g mẫu nấm khô (hoặc 1L dịch thể) **: lượng polysaccharide trong 100 g mẫu nấm khô (hoặc 1L dịch thể)

Kết quả bảng 4.11 cho thấy trong dịch thể nuôi cấy nấm, có xuất hiện polysaccharide với hàm lượng là 1,52 g/L. Đây là polysaccharide do tế bào nấm tổng hợp trong quá trình phát triển, và được cho là sản phẩm thứ cấp. Ở phân đoạn chiết nước nóng, hàm lượng polysaccharide là 2,5 g/100 g nấm khô. Đa số các polysaccharide hòa tan được chiết trong phân đoạn này. Ngoài polysaccharide, các protein cũng chiếm một lượng đáng kể, có thể lên tới 4050% tổng các chất. Trong nghiên cứu của chúng tôi, phần polysaccharide

93

trong dịch chiết kiềm cũng giống như ở nấm hương chiếm hàm lượng lớn nhất (12,1 g). Các polysaccharide chiết kiềm thường ở dạng khó tan trong nước (hoặc tan hạn chế) hoặc liên kết với chất chitin, mannan, cellulose không tan.

Tất cả các phân đoạn đó được đánh giá hoạt tính gây độc tế bào và kháng u trên thạch. Kết quả được thể hiện tại bảng 4.12 và 4.13.

Bảng 4.12. Hoạt tính gây độc tế bào các phân đoạn chiết tách từ nấm hầu thủ STT Ký hiệu mẫu Nồng độ mẫu (g/mL) Tế bào sống sót (%) Hep G2 Lu RD DMSO 100,0 100,0 Chứng (+) 5 0,5  0,07 1,70,05 0,7  0,1 1 HT-Hexan 40 16,80,5 55,91,2 11,60,4 2 HT-EtOAc 40 79,31,1 80,30,7 76,90,6 3 HT-BuOH 40 95,31,5 98,50,4 90,71,3 4 P1-HT 40 99,60,7 93,31,2 95,30,4 5 P2-HT 40 92,30,09 94,50,5 100,00,0 6 P3-HT 40 84,10,5 82,50,0 80,50,09 7 P4-HT 40 92,50,7 95,20,3 88,71,1

Kết quả tại bảng 4.12 cho thấy, cặn chiết n-hexan của nấm hầu thủ biểu hiện hoạt tính gây độc với 2 dòng tế bào ung thư gan (Hep-G2) và ung thư mô liên kết (RD).

94

Bảng 4.13.Hoạt tính kháng u trên thạch của các cặn chiết nấm hầu thủ

Kí hiệu mẫu

Nồng độ mẫu thử (g/ml)

Kích thước trung bình của khối u

Độ giảm mật độ khối u so

với đối chứng(% )

Đường kính (µm) % giảm so với đối chứng Đối chứng âm (DMSO 1%) 31,220,95 0 0 HT-Hexan 40 17,330,52 44,49 47,931,36 HT-EtOAc 40 24,780,9 20,63 20,861,08 HT-BuOH 40 27,811,42 10,92 8,760,55 P1-HT 40 27,251,8 12,71 10,70,6 P2-HT 40 29,230,4 6,37 8,51,7 P3-HT 40 20,720,7 33,63 30,351,3 P4-HT 40 26,511,2 15,09 15,10,9

Bảng 4.13 cho thấy cặn n-hexan và polysaccharide P3-HT biểu hiện khả năng ức chế sự hình thành khối u với mật độ hình thành khối u giảm tương ứng là 47,93 và 30,35% và kích thước trung bình của khối u giảm tương ứng là 44,49 và 33,63% so với đối chứng.

Cặn chiết n-hexan được tiến hành phân lập bằng sắc ký cột lặp lại trên

silica gel pha thường và sephadex với các hệ dung môi thích hợp (sơ đồ 3.5) thu được 2 hợp chất HT1 và HT2.

Từ phân đoạn P3-HT tiến hành tinh chế theo sơ đồ 3.6 thu nhận được β- 1,3/1,6 glucan tinh sạch (GL-HT) (xem mục 3.2.4).