Tách các phân đoạn và đánh giá hoạt tính sinh học

Quả thể nấm hương khô được chiết và tách phân đoạn như miêu tả ở sơ đồ 3.1 (mục 3.1.1). Từ dịch chiết cồn đã tách được: 01 chất kết tinh NH1 và 3

phần chiết gồm: cặn n-hexan, cặn ethyl axetat, cặn butanol. Từ bã nấm 03 phân đoạn polysaccharide (P1-NH, P2-NH, P3-NH) được tách chiết (xem sơ đồ 3.1 ở mục 3.1.1). Ngoài ra, từ dịch lên men nấm hương phân đoạn polysaccharide

P4-NH được tách (xem mục 3.1.2).

Hàm lượng polysaccharide các phân đoạn tách từ nấm hương cũng được trình bày ở bảng 4.1.

Bảng 4.1. Polysaccharide trong các phân đoạn tách chiết nấm hương

Nấm 100 g quả thể Dịch thể (g/L) (P4) Chiết nước nóng (P1) Chiết axit (P2) Chiết kiềm (NaOH 1M) (P3) Polysaccharide *(**) 3,84 (3,01) 2,5 (1,95) 11,08 (9,5) 5,2 (3,94) *Lượng chất thô giầu polysaccharide trong 100 g mẫu nấm khô (hoặc 1 L dịch thể) **: Hàm lượng polysaccharide trong 100 g mẫu nấm khô (hoặc 1L dịch thể)

Kết quả tại bảng 4.1 cho thấy trong dịch thể nuôi nấm, có xuất hiện polysaccharide với hàm lượng tương đối cao là 3,94 g/L. Đây là polysaccharide do tế bào nấm tổng hợp trong quá trình phát triển, và được cho là sản phẩm thứ cấp. Ở phân đoạn chiết nước nóng, hàm lượng polysaccharide là 3,01g. Đa số các polysaccharide hòa tan được chiết trong phân đoạn này. Ngoài polysaccharide, các protein cũng chiếm một lượng đáng kể, có thể lên tới 4050% tổng các chất. Trong nghiên cứu của chúng tôi, phần polysaccharide trong dịch chiết kiềm chiếm hàm lượng lớn nhất (9,5%). Các polysaccharide chiết kiềm thường ở dạng khó tan trong nước (hoặc tan hạn chế).

74

Tất cả các phân đoạn chiết tách của nấm hương được đánh giá hoạt tính gây độc tế bào và kháng u trên thạch. Kết quả được thể hiện ở bảng 4.2 và 4.3.

Bảng 4.2. Hoạt tính gây độc tế bào các cặn chiết của nấm hương

STT Ký hiệu mẫu Nồng độ mẫu (g/mL) Dòng tế bào Phần trăm sống sót (%) Hep-G2 Lu RD DMSO 100,0 100,0 100,0 Chứng (+) 5 0,04  0,02 1,2  0,04 0,4  0,1 1 NH-Hexan 40 24,80,3 65,61,1 19,50,7 2 NH-EtOAc 40 88,70,9 98,10,3 92,51,2 3 NH-BuOH 40 81,21,1 92,70,6 88,60,7 4 P1- NH 40 49,31,5 73,80,9 45,41,1 5 P2- NH 40 90,10,5 96,10,8 84,81,7 6 P3- NH 40 93,70,9 97,91,2 82,10,6 7 P4-NH 40 75,81,2 93,61,1 74,40,9

Bảng 4.3. Kết quả thử nghiệm hoạt tính ức chế tạo u trên thạch mềm của các phân đoạn polysaccharide

Kí hiệu mẫu

Nồng độ mẫu thử (g/ml)

Kích thước trung bình của khối u

Độ giảm mật độ khối u so

với đối chứng(% )

Đường kính (µm) % giảm so với đối chứng Đối chứng âm (DMSO 1%) 27,521,26 0 0 NH-hexan 40 14,220,96 48,32 45,561,12 NH-EtOAc 40 21,061,2 23,47 15,60,52 NH-BuOH 40 23,090,7 16,09 12,30,64 P1- NH 40 18,21,12 33,86 52,240,95 P2- NH 40 25,170,88 8,54 8,220,7 P3- NH 40 22,971,45 16,53 5,40,92 P4-NH 40 24,150,8 12,25 12,81,05

Kết quả tại bảng 4.2 và 4.3 cho thấy mẫu NH-hexan và P1- NH có hoạt tính gây độc tế bào trên 2 dòng tế bào ung thư gan (Hep-G2) và ung thư mô liên kết (RD). Hơn nữa cả 2 mẫu đó đều biểu hiện hoạt tính ức chế sự hình thành khối u trên thạch với mật độ hình thành khối u giảm tương ứng là 58,56

75

và 54,09%, kích thước trung bình của khối u giảm tương ứng là 52,01 và 35,36% so với đối chứng.

Theo một số công bố trước đây thì đa số các -1,3/1,6-glucan được biết là chất ức chế tế bào ung thư thông qua cơ thể chủ (tăng sinh tế bào miễn dịch, sản xuất kháng thể) mà rất ít gây độc trực tiếp lên tế bào ung thư (in vitro). Israilides & cs. (2008) [61] cho thấy hoạt tính ức chế tế bào ung thư biểu mô vú ở người (IC50 73 g mL1) của cặn chiết polysaccharide bằng nước tại nhiệt độ phòng. Rincao và cs. (2012) [134] nghiên cứu tính ức chế vi rút (PV1 và BoHV-1) của polysaccharide và cặn chiết ethanol nấm hương cho thấy polysaccharide có hoạt lực ức chế virus rất tốt so với cặn chiết ethanol, với giá trị IC50 tương ứng với PV1 và BoHV-1 là 0,19 và 0,1 g mL1, so với cặn ethanol là 1,3 và 2,1 g mL1. Rincao (2012) cho rằng khả năng kháng vi rút chủ yếu nhờ các polysaccharide [134].

Chúng tôi lựa chọn ra 2 phân đoạn n-hexan và P1-NH từ nấm hương để

phân tách tiếp theo sự dẫn đường của phép thử hoạt tính chống ung thư.

Phân đoạn n-hexan được tách thành 3 phân đoạn nhỏ NH-A1, NH-A2,

NH-A3. Kết quả đánh giá hoạt tính chống ung thư thông qua thử nghiệm gây độc tế bào và ức chế tạo u trên thạch của các phân đoạn được trình bày trên bảng 4.4 và 4.5.

Bảng 4.4.Hoạt tính gây độc tế bào các phân đoạn

STT Ký hiệu mẫu Nồng độ mẫu (g/mL) Tế bào sống sót (%) Hep-G2 RD DMSO 100  0,0 100  0,0 Chứng (+) 5 1,2 0,3 1,5  0,09 1 NH-A1 20 19,10,08 11,20,7 2 NH-A2 20 92,30,5 95,61,3 3 NH-A3 20 94,70,9 96,80,3

76

Bảng 4.5. Kết quả thử nghiệm hoạt tính ức chế tạo u trên thạch mềm của các phân đoạn

Kí hiệu mẫu

Nồng độ mẫu thử (g/ml)

Kích thước trung bình của khối u

Độ giảm mật độ khối u so

với đối chứng(% )

Đường kính (µm) % giảm so với đối chứng Đối chứng âm

(DMSO 1%) 26,350,98 0 0

NH-A1 20 14,780,52 43,91 54,931,26 NH-A2 20 21,151,71 19,73 9,681,4 NH-A3 20 22,171,5 15,86 11,20,85

Kết quả bảng 4.4 và 4.5 cho thấy phân đoạn NH-A1 biểu hiện hoạt tính gây độc tế bào và ức chế sự hình thành khối u trên thạch. Phân đoạn NH-A1 được tiếp tục lựa chọn để nghiên cứu thành phần hóa học.

Từ phân đoạn NH-A1, sắc ký cột với hệ dung môi n-hexan/axeton theo tỉ lệ 3/1-1/1, thu được 2 hợp chất ký hiệu là NH-2 (150 mg) và NH-3 (50 mg) (sơ đồ 3.2).

Từ phân đoạn polysaccharide P1-NH được tiếp tục tinh sạch qua 2 cột DEAE cellulose (Cl-) và Sapharose CL6B được sản phẩm chứa β-1,3/1,6

glucan (GL-NH) (xem mục 3.1.4)