HG1 khi được sử dụng ở liều 10 mg/kg như biện pháp phòng chống trước khi tiêm tế bào ung thư vào chuột đã cho thấy hiệu quả ngăn chăn sự phát triển ung thư Ehrlich. Sự phát triển của khối u đã bị kìm hãm khoảng 20% so với đối chứng. Kích cỡ của mọi cơ quan và khối tế bào Ehrlich bên trong cơ thể chuột được chụp quét, quan sát và đo lại bằng kỹ thuật MRI và chọn ROI của chương trình PharmaScan
Thêm vào đó, kích cỡ của các cơ quan liên quan đến hệ miễn dịch (tuyến ức, lá lách, gan) được chụp quét và tính toán. Kích cỡ của tất cả cơ quan của chuột đều giữ nguyên. Tác dụng ức chế biểu hiện trong toàn bộ quá trình thí
145
nghiệm và cả sau 3 tuần phát triển của khối u. Do hỗn hợp không tan, chúng tôi cũng đã nghiên cứu vài dạng tan của nó. Bảng 4.40 cho thấy ảnh hưởng của hỗn hợp khi được pha trong dầu olive.
Bảng 4.40. Ảnh hưởng của HG1 (10 mg/kg) lên sự ức chế phát triển khối tế bào ung thư Ehrlich ở chuột (số trung bình ± s.e; n = 10; p<0.05).
Ngày Đối chứng (mm3) HG1 (mm3), 10mg/kg x 5 Ức chế khối u phát triển (%) 7 241 ± 0,01 245 ± 0,1 1,0 9 289 ± 0,3 267 ± 0,04 8,88 11 335 ± 0,05 299 ± 0,3 8,92 14 367 ± 0,09 311 ± 0,07 11,47 16 433 ± 0,1 332 ± 0,2 23,84 18 900 ± 0,1 746 ± 0,1 18,41
Khả năng chống u được ước định bằng chỉ số tăng tuổi thọ - so sánh với nhóm đối chứng (Bảng 4.41)
Bảng 4.41. Ảnh hưởng của HG1 lên chỉ số tăng tuổi thọ của chuột có khối tế bào ung thư Ehrlich. Ước tính tuổi thọ trung bình được xác định sau 30 ngày kể từ khi bắt đầu thí nghiệm (số trung bình ± s.e; n = 10; p<0,05)
Chất Liều Số lần tiêm Tuổi thọ Số ngày thí nghiệm Tuổi thọ trung bình (số lượng chuột sống/tổng số chuột) Tỉ lệ sống sót (%) HG1 10 mg/kg 5 3 7 14 21 24 30 10/10 10/10 10/10 8/10 8/10 6/10 100 100 100 80 80 60 Đối chứng 5 3 7 14 21 24 30 10/10 10/10 9/10 5/10 3/10 1/10 100 100 90 50 30 10
146
Sản phẩm HG1 đã cho thấy những tính chất phòng kháng u tích cực đối với khối tế bào ung thư Ehrlich. Kết quả thu được cho thấy tiềm năng nghiên cứu đối với hỗn hợp này để phát triển một loại thuốc chống ung thư mới. MRI có thể được sử dụng để tìm ra phản ứng lâm sàng chính xác trước thí nghiệm in
vitro và in vivo. Những nghiên cứu trên chuột có thể được xem xét đưa vào quá
trình xét nghiệm ung thư trên người cũng như tìm ra mục tiêu cho các loại thuốc phòng tránh ung thư giai đoạn đầu. Một trong những vai trò quan trọng nhất của mô hình thử nghiệm trên chuột là để tìm và phát triển thuốc trị ung thư cho người.
MRI cho phép một phương pháp xây dựng hình ảnh 3 chiều của cả cơ thể và theo dõi trong một thời gian và vì thế là phương pháp lý tưởng để theo dõi động vật thử nghiệm in vivo. Đây cũng là kỹ thuật chính xác nhất bởi độ
147
KẾT LUẬN
1.Hóa học và hoạt tính sinh học của nấm hương
- Từ nấm hương (L.edodes), 3 hợp chất phân tử lượng nhỏ được phân lập, gồm: galactiol (NH1), ergosterol (NH2), ergosterol peroxide (NH3);
và 01 polysaccharide là β-1,3/1,6-glucan (GL-NH).
- Hoạt tính gây độc tế bào và kháng u trên thạch của các hợp chất phân lập đã được đánh giá. Kết quả cho thấy: chất NH3 có hoạt tính gây độc tế bào trên cả 4 dòng tế bào thử (Hep-G2, Fl, RD, Lu) với giá trị IC50 lần lượt là 3,84; 4,17; 7,61; và 9,21 µg mL1; Hợp chất NH3 và GL-NH ức chế sự hình thành khối u trên thạch của tế bào ung thư gan Hep-G2 với mật độ hình thành khối u giảm lần lượt là 58,33; 39,25% và kích thước trung bình của khối u giảm lần lượt là 55,18; 20,09% so với đối chứng. (Đây cũng là kết quả đầu tiên đánh giá những hoạt tính những dòng tế
bào này của polysaccharide từ nấm hương).
2.Hóa học và hoạt tính sinh học của nấm hầu thủ
- Từ nấm hầu thủ (H. erinaceus), 6 hợp chất đã được phân lập, gồm:
stearic acid (HT1), ergosterol peroxide (HT2), cerebroside B (HT3), hericenone D (HT4), ergosterol (HT5), β-adenosine (HT6) và 01 polysaccharide là β-1,3/1,6-glucan (GL-HT).
- Hoạt tính gây độc tế bào và kháng u trên thạch của các hợp được đánh giá. Kết quả cho thấy: hợp chất HT2 có hoạt tính gây độc tế bào trên cả 4 dòng tế bào thử (tế bào ung thư gan –Hep- G2, ung thư tử cung -Fl, ung thư mô liên kết -RD và ung thư phổi -Lu) với giá trị IC50 lần lượt là 4,82; 5,13; 8,79; 9,11µg.mL1; Hợp chất HT2 và GH-HT ức chế sự hình thành khối u trên thạch của dòng tế bào ung thư gan Hep-G2 với mật độ hình thành khối u giảm lần lượt là 55,78; 45,28% và kích thước trung bình của khối u giảm lần lượt là 52,31; 43,45% so với đối chứng.
148
3.Các sản phẩm chuyển hóa polysaccharide phân lập từ nấm hầu thủ
- β-1,3/1,6-glucan từ nấm hầu thủ được làm ngắn mạch bởi enzyme đặc hiệu (β-1,3-glucanase), thu được 3 phân đoạn glucan cắt ngắn mạch hơn, dễ tan trong nước, gồm: HT-GL1, HT-GL2, và HT-GL3. Sản phẩm
HT-GL1 và HT-GL2 có hoạt tính gây độc với 2 dòng tế bào ung thư gan (Hep-G2) và ung thư mô liên kết (RD) với giá trị IC50 lần lượt là 13,56 và 14,25 g.mL1, 15,73 và 17,68 g.mL1. 2 mẫu HT-GL1 và HT-GL2 ức chế rõ rệt sự hình thành khối u với mật độ khối u giảm tương ứng là 59,72 và 56,12% so với đối chứng và kích thước trung bình của khối u giảm tương ứng là 59,70 và 55,83 % so với đối chứng.
- Lần đầu tiên β-1,3/1,6-glucan từ nấm hầu thủ được sử dụng để bao curcumin, tạo hệ nano Cur-Glu. Sản phẩm này có kích thước nano (50 nm) và tan tốt trong nước. Hệ Cur-Glu có hiệu quả ức chế rõ rệt khối u của dòng tế bào ung thư gan (Hep-G2) và có thể gắn đựợc vào tế bào ung thư làm cho tế bào phát quang.
4.Thử nghiệm dược lý sản phẩm từ polysaccharide
Từ polysaccharide của nấm hầu thủ (phân đoạn P3-HT) , 01 sản phẩm thử nghiệm (HG1) được tạo thành. Sản phẩm này được thử nghiệm trên động vật, kết quả như sau:
- Sản phẩm HG1 an toàn với động vật thử nghiệm. Có tác dụng bảo vệ
gan (giảm hoạt độ enzym gan AST, ALT và γGT so sánh nhóm thử và nhóm chứng). Sản phẩm làm tăng cường quá trình tổng hợp protein trên động vật thực nghiệm ở mức liều 1,0 g/kg TLCT/24h.
- HG1 không cho làm tan huyết hay gây độc tế bào lên hồng cầu chuột và cả tế bào ung thư biểu mô cổ trướng Ehrlich nuôi cấy in vitro.
- Sản phẩm HG1 có tác dụng phòng kháng u đối với khối tế bào ung thư Ehrlich, sau 16 ngày giảm 23,84% kích thước của khối u.
149
KIẾN NGHỊ
Trên cơ sở các kết quả nghiên cứu thu được, chúng tôi cho rằng tác dụng bảo vệ gan, tác dụng dự phòng trên hệ miễn dịch, tác dụng bảo vệ phóng xạ, giảm kích thước khối u của sản phẩm polysaccharide từ nấm hầu thủ có thể được ứng dụng như một chất làm tăng khả năng miễn dịch, chống khối u, bảo vệ những đối tượng có nguy cơ nhiễm độc cao do hóa chất cũng như phóng xạ. Vì vậy, sản phẩm từ nấm hầu thủ cần tiếp tục thử nghiệm lâm sàng trên người để sản phẩm có thể được xem xét đưa vào nghiên cứu sản xuất thuốc phòng và chữa ung thư trên người cũng như tìm ra mục tiêu cho các loại thuốc phòng tránh ung thư giai đoạn đầu.
150
CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
1. Nguyễn Bích Thuỷ, Lê Mai Hương, Trần Thị Như Hằng, Trần Thị Hồng Hà, Phạm Hồng hải, Cồ Thị Thùy Vân, Đinh Xuân Linh (2010). Nghiên cứu quy trình chiết tách polysaccharide giàu 1,3-β-D-glucan từ nấm Hầu thủ Hericium erinaceus Việt Nam. Tạp chí KH & CN, 2010,
Tập 48, số 4A, tr 98-104.
2. Lê Mai Hương, Cồ Thị Thùy Vân, Hà Phương Thư, Nguyễn Bích Thuỷ,
Trần Thị Hồng Hà, Trần Thị Như Hằng, Đỗ Hữu Nghị, phạm Quốc Long, Nguyễn Xuân Phúc, Rene Ullrich, Martin Hofrichter (2010). Nghiên cứu nuôi trồng một số loài nấm ăn và nấm dược liệu Việt Nam, thu nhận, chuyển hóa và khảo sát hoạt tính kháng u thực nghiệm các polysaccarit của chúng. Hội nghị khoa học kỉ niệm 35 năm Viện KH&CNV 1975-2010, tiểu ban: Các chất có hoạt tính sinh học, tr 75-82. 3. Lê Mai Hương, Nguyễn Thị Bích Thủy, Trần Thị Hồng Hà, Trần Thị
Như Hằng, Đỗ Hữu Nghị, Hà Phương Thư, Nguyễn Xuân Phúc, Mai Thu Trang, Đỗ Hùng Mạnh, Rene Ullrich, Martin Hofrichter (2010). Khảo sát hoạt tính ức chế tạo u nuôi cấy 3 chiều trên thạch mềm của sản phẩm curcumin được bao bọc bởi 1,3-β-Glucan tách chiết từ nấm Hầu thủ Việt Nam. Tạp chí KH & CN, tập 48, số 4A, tr 216-224.
4. Le Mai Huong, Ha Phuong Thu, Nguyen Thi Bich Thuy, Tran Thi Hong Ha, Ha Thi Minh Thi, Mai Thu Trang, Tran Thi Nhu Hang, Do
Huu Nghi, Nguyen Xuan Phuc and Duong Tuan Quang (2011). Preparetion and antitumor-promoting activity of Curcumin encapsulated by 1,3--Glucan isolated from medicinal mushroom Hericium erinaceum. Chemistry Letter 40 (8): 846-848.
151
Huong, Duong Tuan Quang, Tran Thi Hong Ha, Tran Dai Lam and
Nguyen Xuan Phuc (2012). Preparation and anti-cancer activity of polymer-encapsulated curcumin nanoparticles. ADVANCES IN
NATURAL SCIENCES: NANOSCIENCE AND
NANOTECHNOLOGY, Adv. Nat. Sci: Nanosci. Nanotechnol. 3 035002.
doi:10.1088/2043-6262/3/3/035002
6. Trần Thị Hồng Hà, Lê Hữu Cường, Trần Thị Như Hằng, Lưu Văn
Chính, Lê Mai Hương (2012). Phân lập các polisaccarit từ nấm hầu thủ lên men dịch thể và đánh giá hoạt tính kháng u của chúng. Tạp chí Khoa
học và Công nghệ 50(3): 327-334.
7. Trần Thị Hồng Hà, Lưu Văn Chính, Lê Hữu Cường, Trần Thị Như
Hằng, Đỗ Hữu Nghị, Trương Ngọc Hùng, Nguyễn Thị Nga, Lê Mai Hương (2013). Đánh giá hoạt tính sinh học của polysaccharide và các hợp chất tách chiết từ nấm hương (Lentinus edodes). Tạp chí Sinh học 35 (4): 445-453.
152
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
1. Bộ Y tế - Cộng hòa xã hội chủ nghĩa Việt Nam (1996). Quy định về nghiên cứu dược lý các thuốc, QĐ 371/YT
2. Nguyễn Thị Chính (2005). Phát triển công nghệ sản xuất nấm dược liệu phục vụ tăng cường sức khỏe. Báo cáo tổng kết khoa học và kỹ thuật. Đề tài Nghị định thư Việt Nam-Hàn Quốc. 268 trang.
3. Nguyễn Thị Chính (2011). Hoàn thiện công nghệ sản xuất sinh khối một số loài nấm dược liệu theo hướng sản xuất công nghiệp để tạo ra thực phẩm chức năng trong hỗ trợ điều trị viêm gan B, tiểu đường, khối u và nâng cao sức khoẻ. Báo cáo đề tài. Nơi lưu trữ TTTTKHCNQG- 8904.
4. Phạm Mạnh Hùng, Nguyễn Thị Hường, Đặng Đức Trạch, Nguyễn Đình Hương, Pondman K.W, Wright PE (1984). Miễn dịch học, University press University of Amsterdam.
5. Nguyễn Cửu Khoa (2006). Tách chiết polysaccharide từ nấm Linh chi, nấm Hầu thủ nuôi trồng ở Việt Nam và xác định hoạt tính kháng oxy hoá của chúng. Báo cáo đề tài. Nơi lưu trữ Viện Công nghệ Hoá học. 6. Nguyễn Xuân Phách, Nguyễn Thế Minh và Trọng Thanh Lâm (1995). Toán
thống kê và tin học ứng dụng trong sinh - y - dược, Nhà xuất bản Quân đội nhân dân, pp 146-149.
7. Tamikazukume (1998). Nghiên cứu nuôi trồng nấm hầu thủ (Yamabushitake) Hericium erinaceum (Bull. Fr) Pers. Tạp chí Dược học số 7: 14-16.
8. Lê Xuân Thám, Võ Thị Phương Khanh, Nguyễn Anh Dũng (2000). Bổ sung vào nhóm nấm chống ung thư ở Việt Nam: Nấm hương (nấm Donko, nấm Shiitake). Tạp chí Dược học số 1: 17-20.
153
9. Lê Xuân Thám (2000). Nấm hương Cao Bằng – một taxon đặc biệt của chi
Lentinula Pegler. Tạp chí Dược học số 3: 6-9.
10.Lê Xuân Thám và Nguyễn Như Chương (2011). Nghiên cứu sự phân hóa sinh địa học của nấm hương (Lentinula edodes) và loài mới bạch kim hương (Lentinula platinedodes sp. nov.) phát hiện ở Cát tiên, Nam Việt Nam. Tạp chí sinh học 33(3):29-39.
11.Lê Minh Tuấn, Nguyễn Thị Chính, Nguyễn Trong Uyên và cs. (2009). Study on effect of light rare earth – isolecine chelate on Hericium erinaceum growth. Tạp chí Khoa học và Công nghệ 47(5): 27-32.
12.Bùi Thị Kim Tuyền (2010). Nghiên cứu so sánh sự phát triển sinh khối và hàm lượng beta glucan ở một số chủng nấm hương nuôi trong môi trường lỏng. Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội, khoa Công nghệ Thực phẩm, Luận văn tốt nghiệp, 51 trang.
Tài liệu tiếng Anh
13. Abrham W.B. (1978). Techniques of animal and clinical toxicology. Med. pub. Chicago pp.55–68.
14. Adachi Y., Miura N.N., Ohno N., Tamura H., Tanaka S., and Yadomae T. (1999). Enzyme immunoassay system for estimating the ultrastructure of 1,6 branched 1,3-β glucan. Carbohydrate polymer 39: 225229. 15. Agafonova I. G., Aminin D. L., and Fedorov S. N. (2002). Influence of
polyhydroxysteroids on [Ca2+]i. Steroids. 67(8), 695–701.
16. Agafonova I.G., Oleg S. Radchenko, Vyacheslav L. Novikov, Dmitry L. Aminin, and Valentin A. Stonik (2008). Magnetic resonance imaging of mouse carcinoma growth inhibition by thiacarpine, an analogue of cytotoxic marine alkaloid pilycarpine. Magnetic Resonance Imaging
26 (6): 763–769.
17. Arnone A., De Gregorio. C, Mele A., Nasini. G, de Pava. OV (1994).
154
C, new metabolites produced by the fungus Hericium erinaceus. Journal of Natural Products 57(5):602–606.
18. Bano Z., Bhagya S., and Srinivasan K.S. (1981). Essential amino acid composition and proximate analysis of the mushrooms Pleuro tuseous
and P. florida. Mushroom Newsletter for Tropics. 1(3): 6–10.
19. Bergmeyer H. U., Herder, M., and Ref R. (1986). International federation of clinical chemistry (IFCC). J Clin Chem Clin Biochem 24(7):
497510.
20. Bisen P.S., Baghel R.K., Sanodiya B.S., Thakur, G.S. and Prasad, G.B. (2010). Lentinus edodes: A macrofungus with pharmacological
activities. Current Medicinal Chemistry 17: 24192430.
21. Borches A.T., Keen C.L. and Gershwin M.E. (2004). Mushrooms, Tumors, and Immunity: An Update. Experimental and Biological Medicine
229:393-406.
22. Bradford M.M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry 72:248–254.
23. Brandt CR., Piraino F. (2000). Mushroom antivirals. Recent Res Dev Antimicrob Agents Chemothe 4:11–26.
24. Carbonero E. R., Gracher A. H. P., Smiderle F. R., Rosado F. R., Sassaki G. L., Gorin P. A., and Iacomini M. (2006). A β-glucan from the fruit bodies of edible mushrooms Pleurotus eryngii and Pleurotus ostreatoroseus. Carbohydrate Polymers 66(2): 252257.
25. Chairul SM., Tokuyama T., Hayashi Y. Nishizawa M., and Tokuda H. (1991). Applanoxidic acids A, B, C and D, biologically active tetracyclic triterpenes from Ganoderma applanatum. Phytochemistry
30:4105–4109.
26. Chan S.L (2006). Effects of polysaccharide peptide (PSP) from Coriolus versicolor on the pharmacokinetics of cyclophosphamide in the rat and
155
cytotoxicity in HepG2 cells. Food and Chemical Toxicology 44: 689–
694.
27. Chang S.T. (1999). World production of cultivated edible and medicinal mushrooms in 1997 with emphasis on Lentinus edodes (Berk.) Sing. in China. International Journal of Medicinal Mushrooms 1: 291300. 28. Chang S.T. and Miles P.G (1992). Mushroom biology – a new discipline.
Mycologist 6:6465.
29. Chang S.T. and Miles P.G. (2004). Mushroom: cultivation, nutritional value, medicinal effect, and environmental impact. CRC Press.
30. Chang Y.W., and Lu T.J. (2004). Molecular characterization of polysaccharides in hot-water extracts of Ganoderma lucidum fruiting
bodies. Journal of Food and Drug Analysis 12(1): 5967.
31. Cheng K.F. and Leung P.C. (2008). General review of polysaccharopeptides (PSP) from C. versicolor: pharmacological and
clinical studies. Cancer Therapy 6: 117130.
32. Cheung L.M. and Cheung P.C.K. (2005). Mushroom extracts with antioxidant activity against lipid peroxidation. Food Chemistry 89:
403–409.
33. Cheung P.C.K (2008). Mushroom as functional foods. A John Wiley & Sons, Inc. Chapter V. Antitumor and iImmunomodulatory activities of mushroom polysaccharides. Page 147.
34. Cheung L. M. (2001). Evaluation of the antioxidant activity and characterization of extracts from three edible Chinese mushrooms. M. Phil. thesis. Hong Kong: Chinese University of Hong Kong.
35. Cheung L. M., Cheung P. C. K., and Ooi V. E. C. (2003). Antioxidant activity and total phenolics of edible mushroom extracts. Food Chemistry 81: 249–255.
36. Chihara G., Hamuro J., Maeda Y., Arai Y., and Fukuoka F. (1970). Fractionation and purification of the polysaccharides with marked
156
antitumour activity especially lentinan from Lentinus edodes. Cancer Research 30: 27762781.
37. Chihara G., Hamuro J., Maeda Y.Y., Shiio T., Suga T., Takasuka N., and