0998 nghiên cứu chiết tách các chất có hoạt tính kháng u và điều biến miễn dịch từ hai loài nấm hầu thủ (hericium erinaceus) và nấm hư

BỘGIÁO DỤC VÀĐÀOTẠO VIỆNHÀNLÂM KHOAHỌCVÀ CÔNGNGHỆVIỆTNAM HỌCVIỆNKHOAHỌCVÀCÔNG NGHỆ TRẦNTHỊHỒNGHÀ NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH CÁC CHẤT CĨ HOẠT TÍNHKHÁNGUVÀĐIỀUBIẾNMIỄNDỊCHTỪHAILỒINẤMHẦU THỦ(Hericiumerinaceus)VÀNẤMHƯƠNG(Lentinulaedodes) NITRỒNGỞVIỆTNAM Chun ngành: Hố học hợp chất thiên nhiênMãsố: 62.44.01.17 LUẬNÁNTIẾNSĨHĨAHỌC HÀNỘI,2015 i DANHMỤC CÁCKÍ HIỆUVÀCHỮVIẾTTẮT Kíhiệu Tiếnganh Tiếngviệt AST Serumaspartattransaminase ALT Serumalanintransaminase ATCC American Type Culture Ngânhàng chủnggiốngMỹ Collection BC Bạchcầu BSA Bovineserumalbumin 13 Carbon-13 C-NMR Nuclear Albuminhuyếtthanhbò Magnetic ResonanceSpectroscopy CC Phổc ộ n g h n g t h t n h â n carbon13 Sắckícột ColumnChromatography CCT Chuộtcốngtrắng CNT Chuộtnhắttrắng COSY CorrelationSpectroscopy PhổCOSY CS% Cellsurvival% %tếbàosốngsót DEPT Distortionless Enhancement by PhổDEPT PolarisationTransfer DEAE- celluloseD i e t h y l a m i n o e t h y l cellulose DMSO Dimethylsulfoxid Dimetylsulfoxit EAC EhrlichascitesCarcinoma Ungthưcổtrướng ECACC TheE u r o p e a n C o l l e c t i o n o f Cell Ngânh n g c h ủ n g g i ố n g c h â u Âu Cultures ElectronS p r a y I o n i z a t i o n M a s s Phổkhốii o n h ó a p h u n m ù EtOAc Spectra Ethylacetate điệntử Etylaxetat FBS Foetalbovineserum Huyếtthanhbàothaibò Fl Humancervicaluterinecarcinoma TếbàoUng thưtửcung ESI-MS GC γGTGT GasChromatography Serum gamma Sắckíkhí glutanin transaminase Hb Haemoglobin HC Hồngcầu Hep-G2 Hepatocellularcarcinoma HMBC Heteronuclear Tếbàoung thưganngười Multiple Bond Connectivity H-NMR Proton Phổtươngtácdịhạtnhânqua nhiềuliên kết Nuclear Magnetic ResonanceSpectroscopy Phổc ộ n g h n g t h t n h â n proton HPLC HSQC IC50 High Performance Sắck í l ỏ n g c a o p h i ệ u n ă n g liquidChromatography cao Heteronuclear single-Quantum Phổtươngtácdịhạtnhânqua Conherence mộtliênkết Inhibitoryconcentration50% Nồngđộứcchế50% KLT Khốilượngtạng KN Khángnguyên LD50 lethaldose50% Liềug â y c h ế t % đ ộ n g v ậ t thựcnghiệm Lu MIC Humanlungadenocarcinoma minimuminhibitoryconcentration NC TếbàoUngthưbiểumơphổi Nồngđộứcchếtốithiểu Nghiêncứu OD OpticalDensity Mậtđộquang OVA Ovalbumin Albuminlịngtrắngtrứng PBS Phosphat buffersaline Dungdịchđệmphosphat RD HumanRhabdomyosarcoma %scavengingcapacity Ungthư môliênkết %k h ả n ă n g t r u n g h ò a g ố c t ự SC% SGMD SRB Suygiảmmiễndịch SulforhodamineB TCA TCCS TCL Trichloaceticacid Axittricloaxetic ThinLayerChromatography Tiêuchuẩncơsở Sắckílớpmỏng TL(g) Trọnglượng(gam) TLCT Trọnglượngcơthể TNFα Yếutốhoại tửungthư Tumornecrosisfactor VSV WHO Visinhvật WorldHealthOrganization TổchứcYtếthếgiới MỤCLỤC DANHMỤCCÁC KÍHIỆUVÀ CHỮVIẾTTẮT ii DANHMỤCSƠ ĐỒ VÀHÌNH xiii MỞĐẦU CHƯƠNGI.TỔNGQUANTÀILIỆU .3 1.1 Nấmdược liệu ứng dụngtrong yhọcdântộc 1.1.1 Giớithiệuvềnấmdược liệu 1.1.2 Ứngdụngtrong yhọcdântộc 1.2 Nhữngnghiêncứutrênthếgiớivềcácchất cóhoạttínhsinhhọccủanấmdư ợcliệu 1.2.1 Cáchợp chất cóphântửlượng nhỏ .6 1.2.1.2.Cácchất cóhoạttínhsinhhọckhác .11 1.2.2 Hoạttínhcủapolysaccharidetừnấmdược liệu 19 1.3 Tình hìnhnghiên cứu vềnấmhầuthủ vànấmhương 30 1.3.1 Nấmhầu thủ (Hericiumerinaceus) 30 1.3.1.1 Trên thếgiới 30 1.3.1.2 ỞViệtNam 34 1.3.2 Nấmhương (Lentinus edodes) 35 1.3.2.1 Trên thếgiới 36 1.3.2.2 ỞV i ệ t Nam 40 1.4 Mơhìnhnicấytếbàoungthưbachiều(3D)trongnghiêncứuungthư 41 CHƯƠNGII.NGUYÊNLIỆUVÀPHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU 44 2.1 Đốitượngnghiêncứu .44 2.1.1 Nấmhương .44 2.1.2 Nấmhầuthủ 44 2.2 Dụng cụ,hóa chấtvàmơitrường 44 2.2.1 Dụng cụvàthiết bị 44 2.2.2 Môi trường 44 2.3 Cácphươngphápphân lập cáchợp chất 45 2.4 Phươngpháp tinh sạchβ-glucantừnấmhươngvànấmhầu thủ 46 2.4.1 Phươngpháptinhsạchβ-1,3-glucantừnấmhương 46 2.4.2 Phươngpháptinhsạchβ-1,3-glucantừnấmhầuthủ 46 2.5 Cácphương pháp xácđịnhcấu trúchoáhọc 46 2.6 Phươngphápxácđịnhhàmlượngpolysaccharide 46 2.7 Phươngphápthủyphânkhơnghồntồnβ-1,3-glucantừnấmhầuthủbằng -1,3-glucanase 47 2.8 Nghiêncứubaocurcumin(Cur)bằng β-1,3/1,6-glucan 47 2.9 Phươngphápđánhgiáhoạttínhsinhhọc 48 2.9.1 Phươngphápthửkhảnănggâyđộctếbào(cytotoxicity) 48 2.9.2 Phươngphápứcchếhìnhthànhkhốiu3chiềutrênthạchmềm(antitumorpromotingassay)invitro 50 2.10 Cácphươngpháp thửdượclý 51 2.10.1 Phươngphápđánhgiáđộctính cấp 51 2.10.2 Phươngphápđánhgiáđ ộ c tínhbán trường diễn 51 2.10.3 Phươngphápđánhgiámột sốtácdụngcủasảnphẩm 52 2.10.3.1 Nghiênc ứ u t c d ụ n g b ả o v ệ g a n c ủ a H G t r ê n m ô h ì n h g â y đ ộ c g a n bằngcarbontetracholorid 52 2.10.3.2 NghiêncứutácdụngcủaHG1đếnquátrìnhtổnghợpproteintrênđộngvậtkhi dùng bán trườngdiễn .52 2.10.3.3 Nghiêncứutácdụngtrên hệmiễndịch củaHG1thựcnghiệm 52 2.10.3.4 Phươngphápthửhiệulựckhánguthựcnghiệm 52 2.10.4 Xửlýsố liệu .52 CHƯƠNGIII.THỰCNGHIỆM 53 3.1 Nghiên cứu hóahọc vàhoạttính sinhhọccủanấmhương 53 3.1.1 Phân lập cách ợ p c h ấ t từquảthểnấmhương 53 3.1.2 Táchp o l y s a c c h a r i d e từdịch lên mennấmhương .55 3.1.3 Cách ằ n g s ố v ậ t l ý v s ố l i ệ u p h ổ c ủ a c c h ợ p c h ấ t đ ã p h â n l ậ p t n ấ m hương55 3.1.4 Tinhsạchβ-1,3/1,6 glucan (lentinan)từnấmhương (sơđồ3.3) .56 3.2 Nghiêncứu hóahọcvàhoạttính sinhhọccủanấmhầu thủ 57 3.2.1 Phân lập cáchợp chấttừquảthểnấmhầu thủ(sơđồ3.4) 57 3.2.2 Táchp o l y s a c c h a r i d e từdịch lênmen nấmhầu thủ 60 3.2.3 Cáchằngsốvậtlývàsốliệuphổcủacáchợpchấtđãphânlậptừnấmhầuthủ 60 3.2.4 Tinhsạchβ-1,3/1,6 glucan từnấmhầu thủ .61 3.2.5 Thủyphânkhơnghồntồnβ-1,3-glucantừnấmhầuthủbằngenzyme-1,3glucanase 62 3.2.6 Sửdụng β-1,3/1,6-glucantừnấmhầu thủlàmchất mangcurcumin 64 3.3 Tạochếphẩmthửnghiệm 66 3.4 Thửdượclý chếphẩm .66 3.4.1 Nghiên cứuđộctính cấp 66 3.4.3 NghiêncứumộtsốtácdụngcủasảnphẩmHG1trênđộngvậtthựcnghiệm ……………………………………………………………………………………68 3.4.4 NghiêncứuthửhiệulựckhánguthựcnghiệmtrênđộngvậtcủasảnphẩmHG2 70 CHƯƠNGIV.KẾTQUẢVÀ THẢOLUẬN 73 4.1 Nghiên cứu hóahọc vàhoạttính sinhhọccủanấmhương 73 4.1.1 Tách cácphânđoạnvà đánh giáhoạt tínhsinhhọc 73 4.1.2 Xácđịnh cấutrúc cáchợpchấtNH1,NH2vàNH3 76 4.1.2.1 HợpchấtNH1:galactiol 76 4.1.2.2 HợpchấtNH-2:Ergosterol .80 4.1.2.3 HợpchấtNH3:Ergosterolperoxide 84 4.1.2.4 HợpchấtNH-GL:β-1,3/1,6glucan(lentinan) 88 4.1.3 Đánhgiáhoạt tính sinhhọccủa cáchợp chấtphânlập từnấmhương .89 4.2 Nghiêncứu hóahọcvàhoạttính sinhhọccủanấmhầu thủ 92 4.2.1 Táchphân đoạn vàđánhgiáhoạttínhchốngungthư .92 4.2.2 Xácđịnh cấutrúccáchợp chấtphânlậptừnấmhầu thủ 94 4.2.2.1 HợpchấtHT1:axitstearic 94 4.2.2.2 HợpchấtHT2:Ergosterolperoxide 97 4.2.2.3 HợpchấtHT3-CerebrosideB 99 4.2.2.4 Hợpchất HT4 -HericenoneD 104 4.2.2.5 HợpchấtH T -Ergosterol .110 4.2.2.6 HợpchấtHT6-β-Adenosine 112 4.2.3 Đánh giáhoạt tính sinhhọccủacáchợp chấtphânlậptừnấmhầu thủ .118 4.3 Nghiêncứubiếnđổiβ-1,3glucantừnấmhầuthủthànhhoạtchấtdễtanhơnvàđánh giáhoạttínhcủachúng 121 4.3.1 Thủyphânbằng enzyme-1,3-glucanase 122 4.3.2 Dùngβ-1,3/1,6-glucantừnấmhầuthủlàmchấtmang curcumin .124 4.4 ThửnghiệmtácdụngdượclýchếphẩmHG1trênđộngvậtthựcnghiệm .128 4.4.1 Kếtquảnghiêncứu độctínhcấpcủasản phẩmtheođườnguống củachế phẩmHG1 .128 4.4.2 Độctínhbántrườngdi ễncủasản phẩmHG1khichouốngtrênđộngvật thựcnghiệm 129 4.4.2.1 ẢnhhưởngcủaHG1,choCNTuốngtrườngdiễnđốivớikhốilượnggan,lách,thậ nđộngvật 130 4.4.2.2 KếtquảnghiêncứutrọnglượngcơthểCNT,khốilượnggan,lách,thậnvà tỷsốgiữakhốilượng mỗitạng so vớitrọng lượngcơthể 131 4.4.2.3 Ảnh hưởng sản phẩm cho uống bán trường diễn đến tiêu huyếthọctrên độngvật thựcnghiệm 132 4.4.2.4 Ảnhh n g c ủ a s ả n p h ẩ m đ ế n c c t h ô n g s ố h ó a s i n h đ ộ n g v ậ t k h i c h o uốngbántrường diễn 133 4.4.2.5 Ảnhhưởngcủasảnphẩmdùnguống6tuầnđếnchứcnăngtimthỏđượcđođi ệntim 134 4.4.2.6 Ảnhhưởngcủasảnphẩmđếncácthôngsốmôbệnhhọckhidùngtrườngdiễn 135 4.4.3 Kết quảnghiêncứu số tácdụngcủasảnphẩmHG1 136 4.4.3.1 Tácd ụ n g b ả o v ệ g a n c ủ a s ả n p h ẩ m t r ê n c h u ộ t n h ắ t đ ợ c g â y đ ộ c g a n bằngcarbontetraclorid 136 4.4.3.2 Ảnhhưởngcủasảnphẩmuốngbántrườngdiễnđếnquát r ì n h tổnghợp proteintrênđộngvậtthựcnghiệm 137 4.4.3.3 Tácdụngtrênhệmiễndịch củasản phẩm 138 4.4.3.4 Kếtquảđánhgiátỷlệsống/chếtcủaCNTsauchiếuxạdướitácdụngcủasảnphẩm 139 4.4.3.5 Kếtquảnghiêncứutácdụngtêncácdịngtếbàocóchứcnăngmiễndịch .140 4.4.3.6 Kếtquảnghiêncứ uvề phảnứngquám ẫn m uộ n vớikhángnguyênđặc hiệudướitácdụng sản phẩm .141 4.4.4 Thửnghiệmtácdụng sản phẩmHG1 lêntếbàoungthư 144 4.4.4.1 TácdụngcủasảnphẩmHG1lênhồngcầuvàtếbàoungthưbiểumôcổtrướngE hrlich(EAC)invitro .144 4.4.4.2 TácdụngcủahỗnhợpHG1lêntếbàoungthưbiểumôcổtrướngEhrlich(EAC)inv ivo 144 4.4.4.1.Tácdụng củachếphẩmHG1lên khối tếbào ungthưEhrlichinvivo 144 KẾTLUẬN 147 KIẾNNGHỊ .149 CÁCCƠNGTRÌNHĐÃCƠNGBỐLIÊN QUANĐẾNLUẬNÁN .150 TÀILIỆUTHAMKHẢO 152 DANHMỤCCÁCPHỤLỤC Error! Bookmarknot defined DANHMỤCBẢNG Bảng1.1.Danh sáchnấmdượcliệutiêu biểuvàđặctính chữabệnh Bảng1.2.Cácchấtphân tửlượng nhỏ cóhoạttínhkhángu Bảng13.Nguồn gốc,kiểuvàhoạttính polysaccharidetừmộtsốnấm dượcliệu19 Bảng1.4.Cácthụthểnhậnbiếtkhnmẫuvớimộtsốpolysaccharide 28 Bảng 1.5.Giátrị yhọcvà số chất hoạttínhtừnấmhương 37 Bảng3.1.Kếtquảthủyphânkhơnghồntồnβ-1,3glucantừnấmhầuthủbằngenzym-1,3-glucanase 63 Bảng4.1.Polysaccharidetrongcácphân đoạntáchchiếtnấmhương 73 Bảng 4.2.Hoạttính gâyđộctếbàocáccặnchiết củanấmhương 74 Bảng 4.3 Kết thử nghiệm hoạt tính ức chế tạo u thạch mềm phânđoạnpolysaccharide 74 Bảng4.4.Hoạttính gâyđộctếbàocácphân đoạn 75 Bảng 4.5 Kết thử nghiệm hoạt tính ức chế tạo u thạch mềm phânđoạn .76 Bảng4.6.Kết quảphổ13C-NMRcủaNH2 83 Bảng4.7.SốliệuphổNMRcủahợp chấtNH3 vàhợp chất thamkhảo 86 Bảng4.8.Sosánhphổ13C-NMRcủalentinanvàβ-1,3/1,6tinhsạch .89 Bảng4.9.Hoạt tínhgâyđộctế bào củacáchợpchấtphân lậptừnấmhương 90 Bảng4.10.Kếtquả thửnghiệmhoạttínhứcchế tạoutếbàoungthưganHep-G2trênthạch mềmcủacáchợp chất 91 Bảng4 11 Hàm lượngpolysaccharide t r ong cá c phân đo ạn t ch ch i ế t n ấ m hầuthủvà nấmhương .92 Bảng 4.12.Hoạttínhgâyđộctếbàocácphân đoạn chiếttáchtừnấmhầuthủ 93 Bảng4.13.Hoạttínhkháng utrên thạch củacáccặn chiếtnấmhầuthủ .94 Bảng4.14.Kếtquảphổ NMRcủaHT3 103 Bảng4.15.Kếtquảphổ NMRcủaHT4 107 Bảng4.16.KếtquảphổNMRcủaHT6 113 Bảng4.17.g i trịtínhiệuphổ13C-NMRcủa-1,3/1,6glucan hầuthủ .118