ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA VÀ KHÁNG VIÊM IN VITRO CỦA CAO CHIẾT HUYẾT GIÁC (DRACAENAE CAMBODIA PIERRE EX GAGNEP) VÀ BỒ KẾT (GLEDITSIA FERA (LOUR ) MERR )

CacĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  - CHUYÊN ĐỀ LUẬN VĂN ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HĨA VÀ KHÁNG VIÊM IN VITRO CỦA CAO CHIẾT HUYẾT GIÁC (DRACAENAE CAMBODIA PIERRE EX GAGNEP) VÀ BỒ KẾT (GLEDITSIA FERA (LOUR.) MERR.) Sinh viên thực : Mai Kiều Tiên Mã số sinh viên : 1613508 Giảng viên hướng dẫn : TS Phạm Thị Kim Trâm ThS Trần Trúc Thanh TPHCM, tháng 01 năm 2021 ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  - CHUYÊN ĐỀ LUẬN VĂN ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HĨA VÀ KHÁNG VIÊM IN VITRO CỦA CAO CHIẾT HUYẾT GIÁC (DRACAENAE CAMBODIA PIERRE EX GAGNEP) VÀ BỒ KẾT (GLEDITSIA FERA (LOUR.) MERR.) TPHCM, tháng 01 năm 2021 Sinh viên thực : Mai Kiều Tiên Mã số sinh viên : 1613508 Giảng viên hướng dẫn : TS Phạm Thị Kim Trâm ThS Trần Trúc Thanh MỤC LỤC I Mở đầu 1.1 Lý chọn đề tài 1.2 Mục tiêu đề tài .3 1.3 Đối tượng phạm vi đề tài 1.4 Các nghiên cứu nước II Nội dung nghiên cứu III Phương pháp nghiên cứu 3.1 Quy trình đánh giá khả kháng oxy hóa kháng viêm in vitro cao chiết Huyết giác Dracaena cambodiana Pierre ex Gagnep Bồ kết Gleditsia fera (Lour.) Merr .9 3.2 Đánh giá khả kháng oxy hóa .9 3.3 Định lượng hợp chất cao chiết 12 3.3.1 Tổng hàm lượng Polyphenol 12 3.3.2 Tổng hàm lượng Flavonoid 14 3.4 Đánh giá khả gây độc tế bào: Phương pháp MTT 17 3.5 Đánh giá khả tiết NO 19 IV Dự kiến nội dung luận văn .23 TÀI LIỆU THAM KHẢO 25 I Mở đầu I.1 Lý chọn đề tài Việt Nam quốc gia thuộc khu vực Đơng Nam Á, nước có khí hậu nhiệt đới gió mùa, nóng ẩm Với đặc điểm khí hậu nên dẫn đến khả mắc bệnh nhiễm trùng nặng viêm cao Ngày nay, với phát triển Y học, nhiều loại thuốc kháng viêm nghiên cứu ứng dụng rộng rãi, nhiên đa số loại thuốc kháng viêm có nguồn gốc tổng hợp hóa dược Các loại thuốc kháng viêm sử dụng điều trị thuộc hai nhóm có chất steroid không steroid Chúng mang lại hiểu cao điều trị có tác dụng khơng mong muốn làm suy giảm miễn dịch, teo cơ, xốp xương, loét dày, tá tràng, … sử dụng thời gian dài Vì vậy, việc tìm kiếm loại thuốc kháng viêm có nguồn gốc từ thảo dược thiên nhiên đóng vai trị quan trọng giải pháp sinh học an toàn thay cho loại thuốc kháng viêm tổng hợp Việt Nam đánh giá quốc gia có tiềm lớn dược liệu khu vực Đông Nam Á toàn giới Với nguồn dược liệu phong phú, đa dạng, theo thống kê Viện Dược liệu, Việt Nam ghi nhận có 5000 lồi thực vật nấm, 408 lồi động vật khoảng 75 loại khống vật có cơng dụng làm thuốc Điều cho thấy tiềm to lớn nguồn dược liệu Việt Nam, sử dụng nghiên cứu sàng lọc tìm chất có hoạt tính dược học q hiếm, có nhóm chất chống viêm có hiệu không gây phản ứng phụ Nhiều kết nghiên cứu cho thấy hợp chất kháng oxy hóa tự nhiên ngăn ngừa số bệnh ung thư, tim mạch, suy giảm hệ thần kinh lão hóa sớm – bệnh có nguyên nhân stress oxy hóa (sự cân gốc tự hoạt động chất chống oxy hóa thể) gây Polyphenol nhóm chất quan tâm với đặc tính sinh học khả kháng oxy hóa, chống viêm, chống dị ứng khả kháng khuẩn [1] Do đó, chuyên đề luận văn “Đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa kháng viêm in vitro Huyết giác (Dracaenae cambodianae Pierre ex Gagnep) Bồ kết (Gleditsia fera (Lour.) Merr.)” nhằm góp phần đánh giá tìm hiểu tiềm kháng oxy hóa, định lượng số hợp chất phổ biến cao chiết thu khả điều trị kháng viêm in vitro Huyết giác Bồ kết Ý nghĩa khoa học đề tài  Kết tiền đề cho nghiên cứu ứng dụng dược liệu hợp chất kháng oxy hóa điều trị viêm tương lai  Khẳng định tiềm từ nguồn dược liệu quý Thế giới nói chung Việt Nam nói riêng, cần tiến hành nghiên cứu thêm khai thác nguồn dược liệu quý cách hiệu I.2 Mục tiêu đề tài  Đánh giá khả kháng oxy hóa cao chiết Huyết giác Dracaenae cambodianae Pierre ex Gagnep Bồ kết (Gleditsia fera (Lour.) Merr.)  Định lượng số hợp chất cao chiết Huyết giác Dracaenae cambodianae Pierre ex Gagnep Bồ kết (Gleditsia fera (Lour.) Merr.): Polyphenol Flanovoid  Đánh giá khả gây độc cao chiết Huyết giác Dracaenae cambodianae Pierre ex Gagnep Bồ kết (Gleditsia fera (Lour.) Merr.) lên dòng tế bào RAW 264.7  Đánh giá khả tiết NO cao chiết Huyết giác Dracaenae cambodianae Pierre ex Gagnep Bồ kết (Gleditsia fera (Lour.) Merr.) I.3 Đối tượng phạm vi đề tài Cao chiết từ Huyết giác giác Dracaenae cambodianae Pierre ex Gagnep Bồ kết (Gleditsia fera (Lour.) Merr.) cung cấp từ Khoa Dược – Đại học Y dược thành phố Hồ Chí Minh Được tách chiết với dung môi dichloromethane methanol Được bảo quản điều kiện -20℃ Tế bào đại thực bào chuột RAW 264.7 (Trung tâm Cơng nghệ Sinh học Tp.HCM – Phịng Cơng nghệ Sinh học Y Dược cung cấp) nuôi cấy môi trường DMEM + 5% FBS + 1% kháng sinh Penicillin + Steptomycin (PS) Được bảo quản nitơ lỏng I.4 Các nghiên cứu nước Huyết giác loại dược liệu có từ lâu đời lưu truyền qua thuốc dân gian dùng để chữa bệnh như: chống đông máu, chống tiêu chảy, kháng khuẩn, kháng viêm, tái tạo cơ,… Mặc dù biết đến lâu đời chưa có nhiều nghiên cứu tác dụng dược lý Huyết giác thành phần có Huyết giác [2] Một hợp chất chủ yếu có Huyết giác quan tâm phenolic flavonoid Theo J Sung cơng thành phần flavonoid có Huyết giác có hiệu tiềm bệnh tim mạch, giảm đau, kháng viêm, … [3] Năm 2003, Zheng cộng tìm hợp chất glycoside pregnane đặt tên dracaeenoside C D tách chiết từ thân D cochinchinensis với cấu trúc 3β, 14α – dihydroxypregna – 5, 16 (17) – diene – 20 – one – O – α – L – rhamnopyranosyl (1->2)[α – L - rhamnopyranosyl (3->4)] – β – D – glucopyranoside 3β, 14α – dihydroxypregna – 5, 16 (17) – diene – 20 – one – O – α – L – rhamnopyranosyl (1->2)[β – D - rhamnopyranosyl (3->4)] – β – D – glucopyranoside [4] Năm 2005, Gurgel cộng thực nghiên cứu “Hoạt tính kháng nấm in vitro Huyết giác từ Croton urucurana loại nấm da” Kết nghiên cứu cho thấy chiết xuất từ vỏ Huyết giác thu nhận từ Croton urucurana Bali có hoạt tính kháng nấm tương loại khuẩn gây bệnh da liễu Tricophyton amidan, Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton rubrum, Microsporum canis Epidermophyton floccossum [5] Năm 2008, Nguyễn Hải Đăng cơng tách chiết hợp chất đặt tên dracagenin A (1), 25S – namogenin B (2) spriroconazole A (3) từ thân D cambodianae Các hợp chất đánh giá khả kháng nấm cho kết hợp chất (1) (3) ức chế hoạt động Aspergilus niger với giá trị MIC 50 µg/ml, khơng có tác dụng ức chế F oxysporum, S cerevisiae C albicans Đặc biệt hợp chất (3) có khả gây độc dòng tế bào ung thư Hep – 2, Lu RD với giá trị IC50 2.002, 4.727 4.029 µg/ml [6] Năm 2010, Y Luo công đánh giá khả kháng oxy hóa phân đoạn Hexan, ethyl acetate n – BuOH, nước hợp chất phân tách từ D cambodianae Pierre ex Gagnpep phương pháp thử nghiệm gốc tự DPPH, ABTS+ anion Superxide Kết cho thấy hợp chất có khả chống oxy hóa sử dụng làm chất chống oxy hóa tự nhiên [7][8] Năm 2011 Y Luo cộng tiến hành nghiên cứu thành phần hóa học D cambodiana phát dẫn xuất flavonoid (1 – 3) hợp chất biết (4 – 9) Tất hợp chất đánh giá khả gây độc dòng tế bào K – 562, SMMC – 7721 SGC – 7901, đánh giá hoạt động kháng khuẩn như: Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA) Kết thu hợp chất 1, 2, 5, cho thấy gây độc với dòng tế bào K – 562, SMMC – 7721 SGC – 7901 Tất hợp chất điều cho thấy khả kháng khuẩn với S aureus, riêng hợp chất từ – 4, 6, 8, cho thấy khả kháng khuẩn với MRSA [9] Hình 1.1 Thành phần hóa học D cambodia [9] Năm 2013, W Mei cộng tìm dẫn xuất flanovoid đặt tên cambodianin G cambodianin H Cả hai hợp chất đánh giá khả kháng khuẩn gây độc tế bào K – 562 SGC – 7901 Kết thu cho thấy hợp chất điều cho khả kháng khuẩn với S aureus khả gây độc dòng tế bào K – 562 SGC – 7901 [10] Ngày nghiên cứu hợp chất thiên nhiên giới Việt Nam ngày phát triển, góp phần làm đa dạng chất, cơng dụng tính nguồn dược liệu thiên nhiên, làm tiền đề cho nghiên cứu chuyên sâu, tiềm ứng dụng chế tạo loại thuốc điều trị Từ lâu Bồ kết sử dụng phổ biến đời sống với nhiều mục đích khác Các cơng trình nghiên cứu loài chi Gleditsia giới quan tâm từ sớm Tuy nhiên, nghiên cứu Bồ kết Gleditsia fera (Lour.) Merr giới Việt Nam hạn chế, lồi phân bố số khu vực Dưới vài nghiên cứu tiêu biểu năm gần liên quan đến chi Gleditsia giới Việt Nam Năm 2007, Li WH cộng phân lập triterpenoid steroids từ G sinensis LAM triterpenoid C – friedous – – en – – on tìm thấy nguồn gốc tự nhiên [8] Nhóm chất flavonoid lớn tìm thấy chi Gleditsia flavone glycoside Năm 2007, hợp chất flavones đợc phân lập từ G sinensis Zhou cộng Trong nghiên cứu khác thực Mohammed cộng phân lập hợp chất flavone glycoside flavone aglycone từ chiết xuất ethanol G triacathos Ngồi nghiên cứu cịn phát hợp chất phenolics ethyl gallate, caffeic acid, dihydrokaempferol, eridictyol, quercetin, 3,3’,5’,5,7 – pentahydroflavonone (-) – epicatechin Cũng năm đó, ellagic acid glycoside từ gai G sinesis LAM tìm thấy – O – methylellagic acid – 4’ –(5’’acetyl) – alpha – L – arabinofuranoside – O – methylellagic acid – 4’ – O – alpha – L – rhamnopyranoside Cả hợp chất lần phân lập từ loài [11] Vũ Mạnh Hùng cộng tiến hành nghiên cứu “Nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn in vitro in vivo BK01 chiết từ Bồ kết (Gleditsia australis Hemsl.) ” vào năm 2014, cho thấy in vitro BK01 có tác dụng kháng khuẩn mạnh nồng độ tương đối thấp với chủng vi khuẩn thử trực khuẩn mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa), tụ cầu vàng (Staphylococcus aureus), Escherichia coli Bacillus subtilis In vivo thử nghiệm vết bỏng thực nghiệm da thỏ, BK01 có tác dụng kháng khuẩn tương đối tối, có tác dụng ngày thứ 14 sau bị bỏng cho thấy tốt thuốc đối chứng sulfadiazin 1% thuốc chữa bỏng chổ thường dùng lâm sàng [12] Năm 2016, J Zhang cộng tìm thấy 60 hợp chất bao gồm triterpenes, sterol, flavonoid, alkaloid, phenolic phân lập từ G japonica Miq., G sinensis Lam., G caspica Desf G triacanthos L Các chiết xuất từ chi cho thấy có hoạt tính sinh học đa dạng kháng viêm, giảm đau, có khả kháng oxy hóa, có tác dụng gây độc tế bào ung thư, ức chế tăng sinh tế bào ung thư, … Trong saponin triterpenoid thành phần chi Gleditsia có nhiều triển vọng tương lai, cần quan tâm nghiên cứu thêm đặc tính dược lý nhiều tác dụng giảm đau, chống ung thư hợp chất saponin [13] II Nội dung nghiên cứu  Đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa cao chiết Huyết giác D cambodianae Pierre ex Gagnep Bồ kết (Gleditsia fera (Lour.) Merr.)  Định lượng hợp chất cao chiết Huyết giác D cambodianae Pierre ex Gagnep Bồ kết (Gleditsia fera (Lour.) Merr.)   Tổng hàm lượng Polyphenol  Tổng hàm lượng Flavonoid Đánh giá khả gây độc cao chiết từ Huyết giác Bồ kết lên dòng tế bào RAW 264.7  Đánh giá khả tiết NO Mẫu cao/ Vitamin C (𝜇l) EtOH (𝜇l) DPPH (𝜇l) Mẫu thử 100 - 100 Mẫu đối chứng - 100 100 Bảng 1.1 Phương pháp chuẩn bị mẫu cho thí nghiệm DPPH Hút 100 𝜇l dịch chiết, sau thêm 100 𝜇l dung dịch DPPH 0.3 mM, ủ điều kiện tối 30 phút máy lắc Sau tiến hành độ hấp thu quang học bước sóng 517 nm Khả trung hịa gốc tự DPPH xác định theo cơng thức sau: DPPH(%) = 100x(ACT – ASP)/ACT Trong đó:  ACT: Độ hấp thu quang học mẫu trắng không chứa dịch chiết  ASP: Độ hấp thu quang học mẫu có chứa dịch chiết Khả trung hịa gốc tự DPPH mẫu cao chiết đánh giá dựa vào giá trị IC50 Giá trị IC50 nồng độ cao chiết ức chế 50% gốc tự DPPH Giá trị nhỏ, thể khả kháng oxy hóa mạnh III.3 Định lượng hợp chất cao chiết III.3.1 Tổng hàm lượng Polyphenol Polyphenolic hợp chất có nguồn gốc tự nhiên toàn thực vật chứng minh có khả kháng oxy hóa vơ hiệu Polyphenolic bảo vệ thể, giúp thể chống lại nhiều loại bệnh khác gốc tự gây Đặc điểm chung chúng phân tử có vịng thơm (vịng benzen) chứa hay nhiều nhóm hydroxyl (OH) gắn trực tiếp vào vòng thơm Tùy thuộc vào số lượng vị trí tương hỗ nhóm OH với khung hóa học mà tính chất lý hóa học hoạt tính sinh học thay đổi 12 Tổng hàm lượng Polyphenol phân tích phương pháp Folin - Ciocalteu với số sửa đổi Nguyên tắc: Trong thành phần thuốc thử Folin - Ciocalteu có phức phospho – wolfram phosphomalypdat Phức bị khử hợp chất phenol tạo thành sản phẩm phản ứng có màu xanh thẫm, nhóm –OH phenolic chuyển thành nhóm quinol tạo thành phức hợp có màu Cường độ màu hỗ hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ phenolic Căn vào cường độ màu đo bước sóng 760 nm phương trình đường chuẩn acid Gallic với thuốc thử xác định hàm lượng polyphenol tổng số mẫu [14] 13 10 µl mẫu Hỗn hợp Hỗn hợp Đo OD760 50 µl Folin-Ciocalteu Giữ phút Thêm 40 µl Na2CO3 Ủ tối Nhiệt độ phịng Hình 1.5 Quy trình thực định lượng Polyphenol Cách tiến hành: Lấy 10 µl mẫu chất chuẩn thêm vào 50 µl Folin - Ciocalteu (pha lỗng 10 lần) tạo thành hỗn hợp Sau phút, thêm vào hỗn hợp 40 µl Na 2CO3 (10% w/v) tạo thành hỗn hợp Ủ tối phản ứng nhiệt độ phòng giờ, máy lắc Độ hấp thụ dung dịch sau phản ứng đo bước sóng 760 nm Acid Gallic sử dụng chất chuẩn Xây dựng đường chuẩn polyphenol với chất chuẩn acid Gallic khoảng nồng độ từ 0.5 – 64 µg/ml Bảng 1.2 Đường chuẩn acid Gallic (0.5 – 64 µg/ml) 14 Nồng độ acid 0.5 16 32 64 50 50 50 50 40 40 40 40 Gallic (µg/ml) 10 µl acid Gallic nồng độ/giếng Folin- 50 50 50 50 Ciocalteu 10% (µl) Ủ phút Na2CO3 40 40 40 40 10% (µl) Ủ 2h OD 760nm III.3.2 Tổng hàm lượng Flavonoid Những hợp chất thuộc họ Flanovoid có số lượng lớn nghiên cứu nhiều hợp chất Polyphenol Cho đến có 8000 hợp chất thuộc họ Flanovoid phát Chúng có khung hóa học C6-C3-C6’ Hình 1.6 Cấu trúc tổng quát hợp chất flavonoid Dựa vào chất cấy trúc bản, flanovoid phân chia thành nhiều phân lớp khác nhau, ví dụ: vịng dị tố (đóng mở), có khơng có liên kết đơi C2-C3 15 nhóm carbonyl C4 vị trí vịng B (ở vị trí C2 C3) Hầu hết flanovoid có nhóm OH vị trí C5 C7 cịn vịng B thường có nhóm vị trí C3’ C4’ Tổng hàm lượng Flavonoid xác định phương pháp tạo phức với nhôm Nguyên tắc: Phương pháp dựa vào có mặt Flavonoid có mẫu tạo phức màu vàng với dung dịch AlCl3, cường độ màu phản ứng tỉ lệ thuận với hàm lượng Flavonoid Phương pháp dựa việc nitrate hóa vịng thơm có chứa nhóm catechol Sau bổ sung AlCl3, dung dịch màu vàng phức hợp tạo thành, dung dịch sau phản ứng đo bước sóng 425 nm Phương pháp tiến hành: 50 µl mẫu 25 µl AlCl3 2% Ủ tối Nhiệt độ phòng 15 phút 25 µl H2O Đo OD425 25 µl HCl 1M 25 µl CH3COONH4 1M Hình 1.7 Quy trình thực định lượng flavonoid 16 Cách tiến hành: Lấy 50 µl mẫu chất chuẩn thêm vào 25 µl AlCl3 2%, 25 µl H2O, 25 µl HCl 1M, 25 µl CH3COONH4 1M Ủ tối nhiệt độ phòng 15 phút máy lắc Độ hấp thụ dung dịch sau phản ứng đo bước sóng 425 nm Quercetin sử dụng chất chuẩn Xây dựng đường chuẩn flavonoid với chất chuẩn quercetin khoảng nồng độ từ 0.5 – 64 µg/ml 17 Bảng 1.3 Đườngchuẩn Quercetin (0.5 – 64 µg/ml) Nồng độ 0.5 16 32 64 Quercetin (µg/ml) 50 µl Quercetin nồng độ/giếng AlCl3 2% (µl) 25 25 25 25 25 25 25 25 H2O (µl) 25 25 25 25 25 25 25 25 HCl 1M (µl) 25 25 25 25 25 25 25 25 CH3COONH4 25 25 25 25 25 25 25 25 1M (µl) Ủ 15 phút OD 425nm III.4 Đánh giá khả gây độc tế bào: Phương pháp MTT Độc tính cao chiết tế bào RAW 264.7 kiểm tra thử nghiệm MTT (3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide) Nguyên tắc: Phương pháp MTT phương pháp phổ biến dùng để đánh giá sống chết tế bào dựa phản ứng tạo màu thuốc thử Nguyên lý chung phương pháp vòng tetrazolium thuốc thử MTT bám chặt vào ti thể tế bào hoạt động, tác dụng enzyme dehydrogenase tế bào, màu vàng MTT biến đổi thành màu tím formazan hịa tan DMSO Kết đọc máy quang phổ, bước sóng 540 nm [15] Phương pháp tiến hành: Ni cấy tế bào RAW 264.7 Chuẩn bị tế bào Rã đơng tế bào từ bình nito lỏng Đĩa 96 giếng Mật độ 2.104 tế bào/giếng 18 Xử lý tế bào với thuốc thử Thêm 10 µl MTT mg/ml Ủ tối 3h 37℃, 5% CO2 Loại bỏ trình mơi trường Hình 1.8 Quy đánh giá khả sống sót tế bào Thực khảo sát tác động gây độc dịch chiết từ dược liệu cung cấp từ Đại học YThêm dược Tp.HCM lên dòng tế bào RAW Ủ 264.7 tối 15 phút 100 µl DMSO 100% Dịng tế bào RAW 264.7 rã đông từ ống stock tế bào nitơ lỏng, ủ bể ổn nhiệt sauởđó chuyển roux 25 cm có với ml mơi trường DMEM Đọc37℃, kết bước sóngvào 540nm + 5% FBS + 1% kháng sinh Penicillin + Steptomycin (PS), điều kiện nuôi cấy 37℃, 5% CO2 Sau 2h tiến hành thay môi trường Sau - ngày tế bào bắt đầu tăng sinh, thực quan sát kính hiển vi ước lượng mật độ quan sát tạp nhiễm Sau mật độ tế bào đạt 70 - 80% thực thu tế bào cho việc khảo sát gây độc cấy chuyền Loại bỏ môi trường khỏi roux nuôi cấy, rửa roux PBS, từ - ml để loại bỏ hồn tồn mơi trường cũ Sau loại bỏ dịch bổ sung - ml môi trường DMEM + 5% FBS + 1% kháng sinh Penicillin + Steptomycin (PS) vào roux Sử dụng que cào tiến hành cào lớp tế bào bám bề mặt roux nuôi cấy Xác định mật độ tế bào buồng đếm hồng cầu sau nhuộm thuốc nhuộm trypan blue Pha loãng tế bào với môi trường để đạt mật độ tế bào 2x10 tế bào/giếng với thể tích 100 µl Ủ 24h, 37℃, 5% CO2 Tiến hành thử thuốc nồng độ 50, 25, 10, 5, µg/µl Tế bào sau xử lý ủ 24h, 37℃, 5% CO2 Tế bào xử lý với dịch chiết 24h bổ sung 10 µl dung dịch MTT có nồng độ mg/ml tiếp tục ủ 3h Enzyme dehydrogenase tế bào sống sót chuyển hóa MTT thành tinh thể màu tím formazan khơng bị hịa tan mơi trường ni cấy Formazan hòa tan DMSO đo độ hấp thu bước sóng 540 nm Tỷ lệ tế bào sống sót biểu thị khả gây độc lên tế bào dịch chiết Khả gây độc cao số lượng tế bào sống sót thấp Tỷ lệ phần trăm tế bào 19 sống sót xác định cách so sánh giá trị đo độ hấp thụ OD 540 nm giếng thử nghiệm (có xử lý dịch chiết) với giá trị đo độ hấp thu giếng đối chứng (không xử lý với dịch chiết) Tỷ lệ % tăng trưởng tế bào ¿ OD tế bào bị xử lý ×100 OD tế bào đối chứng âm Thí nghiệm lặp lại lần III.5 Đánh giá khả tiết NO Nitric oxide chất trung gian q trình viêm, việc sản xuất nhiều NO xảy viêm cấp tính viêm mãn tính NO tổng hợp từ L-arginine isoenzyme NOS, số iNOS, biểu chủ yếu đại thực bào [16] Việc tiết NO (nitric oxide), trình tiết nitrite tế bào, đo thuốc nhuộm Griess [17] Quy trình thực sau: Nồng độ nitrite mẫu xác định dựa vào đường chuẩn natri nitrite Nuôi cấy tế bào RAW 264.7 Chuẩn bị tế bào Rã đông tế bào từ bình nitơ lỏng Đĩa 96 giếng Mật độ 2.104 tế bào/giếng Xử lý tế bào với thuốc thử Sau 1h bổ sung LPS nồng độ cuối 1µg/ml Ủ 37℃, 5% CO2 24h Thu dịch nuôi cấy 20 Thêm 50 µl thuốc thử Griess Ủ tối 10 phút Hình 1.9 Quy trình đánh giá khả tiết NO Đọc kết bước sóng 540nm 21 Dịng tế bào RAW 264.7 nuôi cấy roux với môi trường DMEM + 5% FBS + 1% kháng sinh Penicillin + Steptomycin (PS), mật độ tế bào đạt 70 – 80% thực thu hồi tế bào cho việc khảo sát khả tiết NO Chuẩn bị đĩa 96 giếng với mật độ tế bào 2x104 tế bào/giếng Sau 24h, tế bào xử lý với cao chiết nồng độ thích hợp (dựa vào kết đánh giá khả gây độc chọn nồng đồ mà khả sống sót tế bào 80%) ủ 37°C, 5% CO sau xử lý với cao chiết, LPS thêm vào giếng nồng độ cuối μg/ml Đối chứng âm (tế bào không xử lý cao chiết LPS), đối chứng dương (xử lý với Dexan LPS) đối chứng xử lý với LPS.Tế bào sau ủ 24 giờ, 37°C, 5% CO trước sử dụng thí nghiệm kiểm tra khả tiết NO [18] Khả tiết NO đánh giá dựa chất chuẩn NaNO Xây dựng đường chuẩn với chất chuẩn NaNO2 khoảng nồng độ từ – 100 µM Bảng 1.4 Đường chuẩn NaNO2 (µM) Nồng độ 1.5625 3.125 6.25 12.5 25 50 100 50 50 50 NaNO2 (µM) 50 µl NaNO2 nồng độ/giếng Griess 50 50 50 50 50 (µl) Ủ tối 10 phút OD 540nm 22 IV Dự kiến nội dung luận văn MỞ ĐẦU Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Khái niệm viêm 1.2 Các yếu tố tham gia vào phản ứng viêm 1.2.1 Các tế bào tham gia vào phản ứng viêm 1.2.2 Các chất trung gian phản ứng viêm 1.3 Các chất kháng viêm 1.3.1 Các chất kháng viêm chất steroid (NSAID) 1.3.2 Các chất kháng viêm có chất steroid (GC) 1.4 Huyết giác 1.4.1 Đặc điểm chung 1.4.2 Khu vực phân bố 1.4.3 Công dụng 1.4.4 Huyết giác Dracaenae cambodianae Pierre ex Gagnep 1.4.4.1 Phần loại khoa học phân bố 1.4.4.2 Thành phần hóa học Huyết giác Dracaenae cambodianae Pierre ex Gagnep 1.4.5 Tình hình nghiên cứu 1.5 Bồ kết 1.5.1 Đặc điểm chung 1.5.2 Khu vực phân bố 1.5.3 Công dụng 1.5.4 Bồ kết Gleditsia fera (Lour.) Merr 1.5.4.1 Phân loại khoa học hình thái 1.5.4.2 Thành phần hóa học Bồ kết Gleditsia fera (Lour.) Merr 1.5.5 Tình hình nghiên cứu Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 23 2.1 Vật liệu 2.2 Phương pháp Chương 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ TÀI LIỆU THAM KHẢO 24 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] C Manach, A Scalbert, C Morand, C Rémésy, and L Jiménez, “Polyphenols : food sources and bioavailability , 2,” 2004 [2] D Gupta, B Bleakley, and R K Gupta, “Dragon’s blood: Botany, chemistry and therapeutic uses,” J Ethnopharmacol., vol 115, pp 361–380, 2008 [3] J Sun et al., “Phenolic constituents, pharmacological activities, quality control, and metabolism of Dracaena species: A review,” Journal of Ethnopharmacology, vol 244 Elsevier Ireland Ltd, p 112138, 15-Nov-2019 [4] Q A Zheng and C R Yang, “Pregnane glycosides from Dracaena cochinchinensis,” J Asian Nat Prod Res., vol 5, no 4, pp 291–296, Dec 2003 [5] L A Gurgel, J J C Sidrim, D T Martins, V C Filho, and V S Rao, “In vitro antifungal activity of dragon’s blood from Croton urucurana against dermatophytes,” J Ethnopharmacol., vol 97, no 2, pp 409–412, Feb 2005 [6] N H Dang, P Van Kiem, C Van Minh, and T T Huong, “Antifungal constituents from the stems of Dracaenae cambodia,” 2008 [7] Y Luo, H Wang, X Xu, W Mei, and H Dai, “molecules Antioxidant Phenolic Compounds of Dracaena Cambodiana,” Molecules, vol 15, pp 8904–8914, 2010 [8] C D Z D K Larsen, “GLEDITSIA LINNAEUS, SP.,” Flora of China [9] Y Luo et al., “Cytotoxic and antibacterial flavonoids from dragon’s blood of Dracaena cambodiana,” Planta Med., vol 77, no 18, pp 2053–2056, Jul 2011 [10] W L Mei, Y Luo, H Wang, H Y Shen, Y B Zeng, and H F Dai, “Two new flavonoids from dragon’s blood of dracaena cambodiana,” Bull Korean Chem Soc., 2013 [11] P Wilkin, P Suksathan, K Keeratikiat, P van Welzen, and J Wiland25 Szymańska, “A new threatened endemic species from central and northeastern Thailand, Dracaena jayniana (Asparagaceae: Tribe Nolinoideae),” Kew Bull., vol 67, no 4, pp 697–705, Dec 2012 [12] L Zhou, D Li, J Wang, Y Liu, and J Wu, “Antibacterial phenolic compounds from the spines of Gleditsia sinensis Lam,” Nat Prod Res., vol 21, no 4, pp 283–291, May 2007 [13] V M Hùng, P Kiệm, and K T Hoa, “Nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn in vitro in vivo BK01 chiết từ bồ kết (Gleditsia australis Hemsl.),” undefined, 2014 [14] A Blainski, G C Lopes, and J C P De Mello, “Application and analysis of the folin ciocalteu method for the determination of the total phenolic content from limonium brasiliense L.,” Molecules, vol 18, no 6, pp 6852–6865, Jun 2013 [15] E J Yang, E Y Yim, G Song, G O Kim, and C G Hyun, “Inhibition of nitric oxide production in lipopolysaccharide-activated RAW 264.7 macrophages by Jeju plant extracts,” Interdiscip Toxicol., vol 2, no 4, pp 245–249, 2009 [16] C A Janeway and R Medzhitov, “Innate immune recognition,” Annual Review of Immunology, vol 20 Annu Rev Immunol, pp 197–216, 2002 [17] E J Yang, J G Kim, J Y Kim, S C Kim, N H Lee, and C G Hyun, “Antiinflammatory effect of chitosan oligosaccharides in RAW 264.7 cells,” Cent Eur J Biol., vol 5, no 1, pp 95–102, Jan 2010 [18] S Bose and H Kim, “Evaluation of in vitro anti-inflammatory activities and protective effect of fermented preparations of rhizoma atractylodis macrocephalae on intestinal barrier function against lipopolysaccharide insult,” Evidence-based Complement Altern Med., 2013 26 ... Gagnep Bồ kết (Gleditsia fera (Lour. ) Merr .): Polyphenol Flanovoid  Đánh giá khả gây độc cao chiết Huyết giác Dracaenae cambodianae Pierre ex Gagnep Bồ kết (Gleditsia fera (Lour. ) Merr .) lên dòng... kháng oxy hóa cao chiết Huyết giác Dracaenae cambodianae Pierre ex Gagnep Bồ kết (Gleditsia fera (Lour. ) Merr .)  Định lượng số hợp chất cao chiết Huyết giác Dracaenae cambodianae Pierre ex Gagnep... CỦA CAO CHIẾT HUYẾT GIÁC (DRACAENAE CAMBODIA PIERRE EX GAGNEP) VÀ BỒ KẾT (GLEDITSIA FERA (LOUR. ) MERR .) TPHCM, tháng 01 năm 2021 Sinh viên thực : Mai Kiều Tiên Mã số sinh viên : 1613508 Giảng