0998 nghiên cứu chiết tách các chất có hoạt tính kháng u và điều biến miễn dịch từ hai loài nấm hầu thủ (hericium erinaceus) và nấm hư

Nấmdược liệu và ứng dụngtrong yhọcdântộc

Giớithiệuvềnấmdược liệu

Trong nhiều thế kỷ, nấm lớn đã được con người sử dụng làm nguồn thứcăn và dược liệu chữa bệnh Nấm lớn được hiểu làcó quả thể rõ ràng xuất hiệntrên cây, trên hoặc dưới mặt đất và có thể nhìn thấy bằng mắt thường, hái bằngtay(Chang và Miles, 1992) [28] Nấm lớn được sử dụng trong y dược gọi lànấmdược liệu.

Hiện nay việc nuôi trồng nấm lớn phục vụ thương mại chủ yếu là nấmđảm (Basidiomycetes), vì nấm túi (Ascomycetes) thường khó nuôi trồng. Nấmđược con người sử dụng bởi giá trị dinh dưỡng và giá trị dược học của chúng.Nấm cung cấp ít calor và chất béo nhưng rất giầu protein, chất xơ, vitamin vàchất khoáng(Crisanvà Sands,1978)[40].

Các nấm có thểăn được dùng làm thực phẩm và thực phẩm chức năngnhư các loài thuộc chiLentinula,Hericium,Grifola,Flammulina,Pleurotus,Tremella… Một số nấm như linh chi (Ganoderrma lucidum), nấm vân chi(Trametesversicolor)chỉsửdụng làmthuốcbởi chúng có vịđắngvàrất cứng.

Hiện nay, khoảng hơn 200 loài nấm đã được thu hái và dùng cho chữabệnh;35 loài nấm được nuôi trồng cho mục đích thương mại, trong đó 20 loàiđược sản xuất ở qui mô công nghiệpl à m t h ự c p h ẩ m v à d ư ợ c l i ệ u ( C h a n g , 1999) [27] Sản lượng nấm nuôi trồng trên thế giới năm

1994 là 490910 3 tấnvà tăng 615810 3 tấn năm 1997 với giá trị ước tính 14 tỉ đô la Mỹ Sáu trong số10 loài nấm được trồng nhiều nhất(chiếm tới 92% tổng sản lượng nấm) gồm:Agaricusbisporus(nấmmỡ,chiếm31.8%),Lentinusedodes(nấmhương,25,4%),

Pleurotus spp (thuộc nấm sò, 14,2%),Auricularia auricular(7,9%),Flammulina velutipes(kim châm, 4,6%) vàVolvariella volvaceae(nấm rơm,7,9%)(Chang,1999)[27]. Ở Việt Nam, các nghiên cứu về nấm dược liệu chủ yếu tập trung vào kỹthuật nuôi trồng (Nguyễn Thị Chính, 2005 và 2011; Lê Minh Tuấn, 2009) [2,3,11] Nguyễn Thị Chínhcũng là một trong những nhà khoa học đầu tiên ởViệt Nam thí điểm nuôi trồng nấm sò và nấm linh chi bằng phương pháp lênmen dịch thể để sản xuất thực phẩm chức năng, nhưng không tách chiết lấypolysaccharide hay các thành phần có hoạt tính mà dùng sản phẩm hỗn hợp(Chính, 2005 và 2011) [2,3] Hoạt tính chống ung thư, tăng cường sức khỏe chobệnh nhân mắc AIDS của polysaccharide từ nấm linh chi cũng được tác giảNguyễn Thị Chính

(2005) thử nghiệm [2] Tác giả Nguyễn Cửu Khoa cũng đãbước đầu nghiên cứu tách chiết polysaccharide từ nấm linh chi, nấm hầu thủnuôi trồng ở Việt Nam và xác định hoạt tính chống oxy hoá của chúng [5].Nhóm nghiên cứu của chúng tôi (đứng đầu làP G S T S L ê M a i H ư ơ n g ) l à những người đi tiên phong trong nghiên cứu tách chiết các hoạt chất từ một sốnấm dược liệu nuôi trồng tại Việt Nam và đã đạt được những thành tựu đáng kểnhư tách chiết và sản xuất thực phẩm chức năng chứa β-glucan và một số hoạtchấttừnấmdược liệu.

Ứngdụngtrong yhọcdântộc

Các nước châu Á như Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc đã sử dụng nấmđểp h ò n g v à c h ữ a m ộ t s ố b ệ n h , k é o d à i t u ổ i t h ọ N h ữ n g n ă m g ầ n đ â y , t h ị trường Mỹ đãmởcửađể đón nhận nhữngsản phẩm thuốc từ nấm dượcl i ệ u , đặcbiệtnấmlinhchivànấmmaitake.Năm1994thếgiớitiêuth ụnấmdượcliệu và các sản phẩm từ nấm với ước tính tới 3,8 tỉ USD và tăng lên tới 6 tỉ năm1999 với thị trường chính (chiếm tới 99%)l à c h â u Á v à c h â u  u C á c s ả n phẩmquantrọngtừnấmdượcliệuthườngcónguồngốctừcácn ấ mGanoderma sp.,L.edodes,S.commune,Tremellafusiformis,Trametesversicolor,Grifola frondosa, và gần đây là từPhellinussp (thượng hoàng) vàHericiumerinaceus(hầu thủ)(bảng 1.1-WasservàWeis,1999)[166].

K há ng n ấm K há ng v iê m C hố ng un g t hư C hố ng vir ut( vd an t-H IV ) K há ng v ik hu ẩn v àk ísi nh Đ iề uh òa hu yế tá p Đ iề uh òa tim m ạc h C hố ng ch ole ste ro l,m ỡm áu C hố ng tiể u đ ườ ng T ăn g m iễ nd ịc h B ổth ận B ảo v ệg an T ốtc ho th ần kin h T ốtc ho si nh lý C hữ av iê m ph ổi

Dendropolyporus umbellatus(Pers.:Fr.)Jul X X X X

Inonotusobliquus(Pers.:Fr.)Bond.et

Agrocibeaegerita(Brit.)Sing + + + + x:Sản phẩm nấm đãđượcthươngmại(thuốchaythựcphẩm chứcnăng)

Nhữngnghiêncứutrênthếgiớivềcácchấtcóhoạttínhsinhhọccủanấmdư ợcliệu

Cáchợp chất cóphântửlượng nhỏ

Nhiều terpenoids có khả năng ức chế sự phát triển tế bào ung thư Helainvitrođã được phát hiện ở nấmG.lucidum(linh chi), trong đó chủ yếu là các loạiganodeic acid (Mizuno, 1995) [112] Các chất steroids gây độc tế bào ung thư(hợpchất1,2và3) còn thấy ởnấmT versicolor( v â n c h i ) , n ấ m Agaricusblazei(nấmthái dương,ABM);CáchợpchấtphenoliclàhericenoneA(4)vàB

(5) ức chế hoàn toàn tế bào ung thư Hela là tương ứng tại 100 và 6,3 àg/mL.Ngoài ra, axit bộo (6) từ nấmH erinaceus(hầu thủ) và hợp chất lampterol(illudin-S) (7) ở nấmLampteromyces japonicascũng thể hiện hoạt tính vớidòng tếbàoHela (Mizuno,1995) [112].

Han và cs (2004) [50] đã phân lập từ nấmPaecilomyces tenuipes(đôngtrùngh ạ t hả ot ằ m dâu)h o ạ t c h ấ t a c e t o x y s c i r p e n e d i o l t h ể h i ệ n h o ạ t t í n h g â y chếttheochươngtrình(apoptosis)ởtếbàomáubệnhbạchcầu.Chấtlanostanoids từG. concinnumcó tác dụng gây ra sự chết theo chương trình ở tếbào HL-60

(Gonzalez và cs, 2002) [49] Các triterpenes applanoxidic acid A, B(39,40), phân lập từ nấmG applanatum, có hoạt tính chống lại yếu tố thúc đẩyung thư da, trong đó applanoxidic acid B là hiệu quả nhất (Chairul và cs., 1991) [25].CácdẫnxuấttừilludinS(7)hiệnđangpháttriểnthửnghiệmlâmsànggia i đoạn 2 ở người (Murgo, 1999) [118] Ganoderic acid A (12) và C (14) từnấm linh chi là chất ức chế enzyme farnesyl protein transferase, chất ức chếtiềm năng này chứng tỏ chiến lược điều trị bệnh ung thư (Lee, 1998) [94] ỞnấmPhellinus linteus(thượng hoàng) có chứa hoạt tính ức chế tạo mạch máukhối u và ức chế enzyme có liên quan đến ung thư như kinase (Kim và cs.,2004; Cho, 2002 [79,38] Chất sesquiterpenoid cryptoporic acids A (41) từ nấmCryptoporus volvatusức chế sự phát triển khối u của okadaic acid (Hashimoto&Asakawa,1998)[53].

Ganosporeric acid X-Me: R 1 =α-OH, R 2 =H, R 3 =OAc,

Nhiều chất trao đổi thứ cấp khác thuộc các nhóm quinine, cerebroside,isoflavone, catechols, amine, triacylglycerols cũng thể hiện hoạt tính chống ungthư( F e r r e i r a v à c s , 2 0 1 0 )

[ 4 5 ] M ộ t s ố c h ấ t t r a o đ ổ i t h ứ c ấ p t ừ n ấ m v à t á c dụng kháng u của chúngđược thống kê như sau (bảng1 2 ) ( F e r r e i a v à c s , 2010)[45].

Bảng 1.2 Các chất phân tử lượng nhỏ có hoạt tính kháng u (Ferreira và cs.,2010)[45]

Lớpchất Chấtchốngungthư Loài nấm Phântửđích

P rudis,Lentinuscr initus ỨcchếNF-KB

Clitocybeclavipes Ức chế tyrosinekina se

490 Quinone (-L-glutaminyl- 4-hydroxy-2,5-benzoquinone) Agaricusbisporus ỨcchếDNAp olymerase

(4E,8E)-N-D-2’- hydroxypalmitoyl-1-O D- glucopyranosyl-9-methyl- 4,8sphingadienine Ganoderm alucidum ỨcchếDNAp olymerase (4E,8E)-N-D-2’-hydroxystearoyl-

Isoflavones Genistein Flammulin avelupites ĐiềuhòaCdc2ki nase

P linteus, Gymnopilusmargi natus, G.patriae, G.parvisporus,Ion otushispidus ỨcchếPKC

Không xác định(cảmứnglàmc hếttheo chu trình vàhoạitử)

5,8-Epidioxy-24(R)- methylcholesta-6,22-dien-3-D- glucopyranoside 5,6-Epoxy-24(R)-methylcholesta-

Ergosterol Grifola frondosa,Agaricus blazei Ức chếcyclooxyge nase

Grifola frondosa,Ganoderma applanatum, G.neojaponicum Ức chếCyclooxyge nase

Lucidenic acid OLucidenic lactoneCerevisterol LucidumolAandBG anoderiolFGanoderma nondiolGanoderma nontriol Ganoderic acids A, F, H, W,

Ganoderma lucidum Ức chế DNApolymeras e,v à RT ỨcchếDNApolymeras e ỨcchếNF- KBvàAP-1 Ức chế DNAtopoiso merase PolyporenicacidC

Piptoporusbetulin us,Daedaleadickin sii ỨcchếMMPs

Agaricus bisporus,Boletus edulis,Flammulinavel utipes,

Pleurotus ostreatus Ức chếDNAcytosinemet hyltransferase

1.2.1.2 Các chất có hoạt tính sinh học khácChống xơvữađộngmạchvàlàmgiảmmỡmáu

Nhiềunấm ănvà nấm dược liệucó tác dụng phòngx ơ v ữ a đ ộ n g m ạ c h bởi chúng chứa nhiều chất xơvà ít chất béo.Các triterpene khác từ linh chicũng góp phần ngăn ngừa bệnh xơ vữa động mạch bằng cách ức chế enzymechuyểnhóaangiotensin(enzymegâyxơvữamạchmáu)nhưganoderic acidF

(16)(Komodavàcs.,1989)[83],haygiảmsựvóntiểucầunhưganodericacidS (19) (Morigiwa, 1986) [116] Các nucleotit AMP và GMP từ dịch chiết nướccủa nấm linh chi có tác dụng chống kết vón tiểu cầu Ngoài ra, các chất nhưlenthinacin, deoxylenthinacin, 5AMP và 5GMP ở nấm hương có tác dụngchống kếtvóntiểucầu mạnh[83,116].

Cácbệnhvềtim mạch,huyết ápt hư ờn g cól iê nquant ới tìnhtrạ ng x ơvữa động mạch, cholesterol tăng, lipo-protein tỉ trọng thấp bị oxi hóa (LDLoxidation) Vì vậy việc điều khiển và duy trì mức cholesterol về mức cho phéplà rất quan trọng nhằm phòng và chữa bệnh Các gốc tự do hoạt động (reactiveoxygen species, ROS) và sự tăng lipid trong máu là yếu tố dẫn tớibệnh xơ vữađộngmạch.Điềuchỉnhlượngmỡmáuvềmứcchophép,đặcbiệtl à cholesterol, đóng vai trò quan trọng làm giảm sự phát triển của bệnh Một sốloài nấm thể hiện khá tốt vai trò này.N ấ mP ostreatus(nấm sò) tác dụngchống xơ vữa động mạch, ức chế peroxit mỡ ở chuột và thỏ nhờ hoạt chấtlovastatin(8)

(còngọimevinolin),làchấtứcchếHMG-CoAreductase.Lovastatin còn phổ biến ở nhiều loài nấm thuộc chi nấm sòPleurotusvà cũngdượctìmthấyởcácnấmAuriculariaauricularia-judaevàTremellafuciformis.

Hợp chất lentinacin (9)(thường gọi là eritadenine hay lentysine) từ nấm hươngcó tác dụng giảm cholesterol và các chất béo trung tính (Su, 1999) [150], hoạtchất eritadenine ảnh hưởng không những tới chuyển hóa cholesterol mà còn cácphospholipid và axit béo. Eritadenine ức chế chuyển hóa lipid (linoleic axit) donó ức chế hoạt tính enzyme6-desaturase Năm

1995, Hobbs và các cộng sựcũng đã chỉ ra rằng nhiều hợp chất phân lập từ nấm hương cũng có khả nănglàm giảm cholesterol ở phụ nữ trẻ và người già hơn 60 tuổi ở Nhật Bản (Hobbs,1995) [56] Chất grifolin (10) và neogrifolin (11) từ nấmPolyporous confluenscó tác dụng làm giảm huyết áp máu (Mizuno, 1995)

[109] Ngoài ra, một vàitriterpene từG lucidum(linh chi) như chất ganoderic acid C (14) và các dẫnxuấtlà cókhả năngứcchếquátrìnhsinhtổnghợp cholesterol.

Các nấm lớn là nguồn cung cấp phong phú các chất có hoạt tính chốngoxi hóa Các chất này hoạt động dựa trên một số cơ chế như: (i) chống oxi hóatrực tiếp bằng duy trì mức độ chống oxi hóa nhằm ngăn chặn quá trình sản xuấtyếu tố ROS (reactive oxygene species), (ii) tác dụng chống oxi hóa gián tiếpthông qua cảm ứng và điều khiển hệ thống enzymechống oxi hóa của cơ thểchủ (SOD, GPx, catalase), (iii) baovây gốc tự do đích Hoạt tính chống oxihóa của nấm chủ yếu là do sự có mặt của các hợp chất phenolic Nấm hương vànấm rơm cóhoạt tínhchống oxi hóa và baovây gốc tự do Nấm hươngs i n h chất cảm ứng tổng hợp SOD và GPx, là 2 enzyme chống oxi hóa (Cheung vàcs.,2003)[35].

P- terphenyl từ nấmThelephora ganbajun,T. aurantiotincta,Boletopsisgriseacũng nhưPaxillus curtissiicó hoạt tính chống oxi hóa rất mạnh Chấtbetulinan A (20) từ nấmLenzites betulinuscó hoạt tính bao vây gốc tự do mạnhhơnvitaminE4lầntrongviệcgiảmperoxitmỡ(Lee,1996) [91].SterinsAvàBtừnấmStereumhirsutumcũngcóhoạttínhnày.

Hoạt tính chống oxi hóa mạnh được phát hiện ở dịch chiết methanol vàchiết nước của 3 nấm ăn thông thường là nấm hương (L edodes),nấm sò(Pleurotus tuber-regium) và nấm rơm (V volvacea) Hoạt tính được đánh giábằng phương pháp mất mầu β-carotene, bao vây gốc tự do (DPPH) và phản ứngtan máu (Cheung, 2001, 2003) [34,35] Nấm rơm có chứa các chất chống oxihóa điển hình như ascorbic acid, to-copherol (vitamin E), và β- carotene, vàlượng đángkểcáchợp chấtphenolic[109].

Bệnh tiểu đường xuất phát từ sự mất cân bằng chuyển hóa đường. Theothống kê trên thế giớicó tới250 triệu ngườim ắ c b ệ n h t r ọ n g , đ a s ố l à t i ể u đường type 2 Nhiều phương thức điều trị hiệu quả và an toàn đối với tiểuđườngtype2chủyếutậptrungkhánginsulinngoạivi.Hợpchấtdehydrotrametenolic acid

(25) tìm thấy ở nhiều nấm lỗ bao gồmWolfiporiacocos,Laricifomesofficinalis,Laetiporussulphureuslàmgiảmhiện tượngđườngcaotrongmáuởbệnhtiểuđườngkhôngphụthuộcinsulin.Ganod eranA, B và C từ nấm linh chi (quả thể) có khả năng làm giảm lượng đường máu(Kimvà cs.,1997;Smithvà cs.,2002) [75,146].

Koyama và cs (1972) thấy rằng dịch chiết ethanol từ nấmP linteus(nấm thượng hoàng) có hoạt tính kháng viêm khớp (cảm ứng bởi collagen) vàgiảm đau Các chất làm giảm đau quặn cũng có mặt trong nấmG. lucidumnhưganoderic acid A (12), B (13), G (21) và H (22) Các chất này có hiệu lực giảmđauởđộngvậthơn làchấtmẫu acetylsalicylicacid (Koyama,1997) [84].

Hoạttínhcủapolysaccharidetừnấmdược liệu

Trong số các hoạt tính y dược của polysaccharide từ nấm, hoạt tính tăngcường miễn dịch và kháng u được quan tâm nhiều hơn cả Polysaccharide cóhoạt tính sinh học thường là glucan (polymer của đường glucose) với các kiểuliên kết glucoside khác nhau Một số là heteroglucan, một số gắn vớip r o t e i n tạothànhphứcproteoglucan(bảng1.3)[187].

Bảng 1.3 Nguồn gốc, kiểu và hoạt tính polysaccharide từ một số nấm dượcliệu[187]

Sclerotium, (sợinấm) β-D-glucan Bảovệ gan, chữaungthư vú

Chống tăng đường huyết, tăngcường miễn dịch, kháng u,chốngoxihóa

Quả thể Glucan Chống tăng đường huyết, tăngcường miễn dịch, kháng u,khángviêm, chốngbức xạ

Quả thể,sợinấm Heteroglycan,hetero glycanpeptide

Chống tăng đường huyết, tăngcườngmiễn dịch, khángu

Mannoglucan,polysac charide-proteincomplex, glucan,lentinana

Tăng cường miễn dịch, khángu,khángvirút

Sclerotium Glucan,scleroglucan(SSG) Khángu

Quả thể, dịch nuôivà sợinấm

Heteroglycan,glycopeptide,kr estin(PSK)

Chống tăng đường huyết, tăngcường miễn dịch, kháng u,khángviêm, chốngbức xạ

Quả thể Proteoglycan,glucan, galatomannan, heteroglycan,grifolan

Tăng cường miễn dịch, bảo vệgan,khángu,khángvirút

Quả thể,sợinấm Glucan Tăngcườngmiễn dịch, khángu

Quả thể,sợinấm Glucan,heteroglycan,glucan protein, Glucomannan- proteincomplex

Quả thể,sợinấm Glucaneprotein complex,glycoprotein

Kháng u, Kháng viêm, tăngcườngmiễn dịch, khángvirút

Sợinấm Glucan Khángu,tăngcường miễndịch

Sợinấm Proteoglycan Kháng u, tăng cường miễndịch,giảiđộc gan

Quả thể, sợi nấm,dịch nuôi

Heteroglycan Chống mỡ máu, chống tăngđường huyết, kháng u, tăngcườngmiễndịch,chốnglão hóa,chốngtụ huyết

Quả thể,sợinấm Heteroglycan Chống tăng đường huyết, tăngcườngmiễn dịch

Quả thể Glycoprotein Chống tăng đường huyết,khángu,chốngoxihóa

Quả thể Heteroglycan Chống tăng đường huyết,khángu

Quả thể Glucan Kháng viêm, tăng cường miễndịch

Quả thể,sợinấm Heteroglycan Khángu

Quả thể Heteroglycan, mannan,glucan

Các glucan tập trung chủ yếu ở vách tế bào nấm (chiếm 1545% trọnglượng khô) Vách tế bào được cấu tạo bởi chủ yếu làβ-glucan,α- mannan(polymercủamannose),chitin(polymercủaN-acetylglucoamine),1,3α- glucan, galactomannanprotein, cellulose (hình 1.1) (Leung và cs., 2006) [96].Chitin tạo thành một mạng lưới sợi và không tan trong nước, kiềm Trong đó,β-1,3 glucan (có thể phân nhánh), tạo vách tế bào, có các dạng tan khác nhaumột số tan được trong nước, kiềm (S-glucan) và không tan trong kiềm (R- glucan) Cácβ-1,3 glucan, có chứa các liên kết nhánh hoặcβ-1,4 hoặcβ- 1,6glucoside, liên kết với chitin và khoảng trống được lấp đầy bởi protein Các sợiliên kếtβ-1,4 glucoside trong mạch chính cũng có thể hiện diện ở trong vách tếbàonấm.Ởváchtếbàonấm,chitinchiếm1,47,9%,mannan(dạngmanoprotein chủ yếu là mannan) chiếm 2867%,β-1,3 glucan chiếm2846%vàβ-1,6 glucan chiếm 511%, và các polymer này nối với nhau tạo thành mộtđơn vịthốngnhấtcủathànhtếbàonấm(hình1.1).

Các polysaccharide có hoạt tính tăng cường miễn dịch hay chống u cómặt chủ yếu ở vách tế bào nấm, trong đóβ- 1,3/1,6-D glucan vàα-1,3 mannan(liên kếtvới protein) là hai chấtcó hoạt tínhc h í n h C h i t i n v à c e l l u l o s e k h ô n g có hoạt tính này.β-1,3-glucan là polymer gồm các đơn phân tử là glucose nốivớinhaubằngliềnkếtβ-glucosidetrongmạchchínhtạivịtríC-1vàC-3.Ởđa số nấm, polymer này còn có các liên kết mạch nhánhβ- 1,6 glucoside Ở nấmlớn, mạch nhánh thường ngắn (1 đơn vị glucose).G i ữ a c á c n ấ m c ũ n g c ó s ự khác biệt về cấu trúcβ-1,3-glucan Ngoài ra, cácβ-1,3 glucan có nguồn gốckhác nhausẽ khác nhau ở mức độ polymer hóa (hay trọng lượng phân tử), độphân nhánh (degree of branching, DB) Hoạt tính tăng cường miễn dịch sẽ phụthuộc vàomứcđộphứctạpvề cấutrúc hóahọc và lýhọc củamỗig l u c a n Ngoàin ấ m ,β-

1,3g l u c a n c ũ n g đ ư ợ c p h á t h i ệ n ở v i k h u ẩ n , t ả o n â u , v ớ i m ứ c phân nhánh kém (tảo nâu) hoặc không phân nhánh (vi khuẩn) Cấu trúc của mộtβ-1,3 glucan điển hình với phân nhánhβ- 1,6 glucoside được trình bày tại hình1.2.

Cácβ-1,3/1,6 glucan với hoạt tính tăng cường miễn dịch tốt, được nghiêncứu kỹ, là từ các nấmL edodes (nấm hương),Grifola frondosa(maitake),SchizophillumcommunevàScleroniniasclerotiorum.

Cácβ -glucan có hoạt tính chống u có sự khác nhau về thành phần hóahọc, mức độ phân nhánh, cấu trúc không gian và các đặc tính vật lý khác.Hoạttính chống u được thấy ở các glucan từ dạng homoglucan tới dạng phức hợpheteroglucan.Mặcdùrấtkhócóthểđưaramốiliênquancấutrúcvàhoạttính của các glucan phức tạp, tuy nhiên vẫn có mối liên quan chung giữa cấu trúc vàhoạt tính Các cấu trúc với liên kếtβ-1,3 glucan trong mạch chính và có nhánhbênliên kết qua cầu nốilàβ -1,6 glucoside làcần thiết đểcácg l u c a n n à y c ó hoạt tính tốt Trong khi đó,β -1,6-glucan thì hoạt tính yếu hơn hẳn (Yanaki.,1985; Pangvà cs.,2005)[175,126] Ảnhhưởng củatrọnglượngphântử

Khi xử lý nhiệtβ -1,3 glucan từ nấmG frondosaở 150 o C với thời giankhác nhau, Sakaki (1976) [135] thu được các β-glucan có trọng lượng phân tửkhác nhau Thử nghiệm hoạt tính kháng u dẫn đến kết luận phân đoạn có trọnglượng cao nhất (800 kDa) luôn luôn có hoạt tính chống u, tăng cường miễn dịchtốt nhất. PSK (polysaccharide K: polysaccharides 30%, nitơ 6%, protein 15%)từ nấm vân chi được lọc và chia 4 phân đoạn: 50 kDa, 50100 kDa, 100200kDa và >200 kDa Hoạt tính kháng u và tăng miễn dịch tốt nhất ở phân đoạn cóMw >200 kDa Sakaki (1976) xử lý lentinan (β -1,3/1,6 glucan từ nấm hương,Mw>1.000kDa) bằng axit formic thành 7 phân đoạn với

Mw2,870110 kDa.Hoạt tính kháng u của các phân đoạn có Mw100 kDa) là cầnthiết đểβ-glucan có hoạt tính tốt nhất (Yanaki, 1983) [175]. Tuy nhiên, một sốoligoβ-1,3 glucan có hoạt tính tốt hơn hẳn so với cácβ-1,3 glucan mạch dài(Miyanishi và cs.,2003;Pangvàcs.,2005)[108,126]. Ảnhhưởng củađộphânnhánh Ở nấm, cácβ -glucan có độ phân nhánh khác nhau, dọc theo mạch chính.Lentinan (DB 2/5),β -1,3/1,6 glucan với 2 phân nhánh cho mỗi 5 đơn vị glucosemạch chính; schizophyllan (DB 1/3) làβ -1,3/1,6 glucan với mỗi phân nhánhcho mỗi 3 đơn vị glucose mạch chính Mối liên hệ giữa độ phân nhánh và hoạttính củaβ - glucan là rất phức tạp.β -1,3-glucan mạch chính là cần thiết và hoạttính tốt nhất khi có mức độ phân nhánh (DB) khoảng từ 0,20,4 (Zang và cs.,2007)[184]

Xoắn ba Vô định hình

Xoắn đơn Trung hòa Ảnhhưởngcủacấutrúctớihoạttính

Cấu trúc của β-glucan gồm các dạng xoắn đơn (single helix), xoắn ba(triple helix) và vô định hình (random coil) Cấu trúc xoắn ba thường bền vữnghơn xoắn đơn bởi luôn có xu hướng xoắn đơn chuyển thành dạng xoắn ba Cácphân tửβ -glucan được nghiên cứu nhiều như lentinan, schizophyllan và PSKđều ở dạng xoắn ba Các dạng cấu trúc củaβ -glucan có thể chuyển đổi lẫn nhaubởi các yếu tố như nhiệt độ, hóa chất v.v…( h ì n h 1 3 ) ( A d a c h i v à c s ,

Cấu trúc dạng xoắn cũng ảnh hưởng tới hoạt tính của polysaccharide.Yanaki(19 83) đãph át hi ện ra schizophyllan khiởtrạ ng th á ixoắnba(t ươ ng ứngv ớ i Mw>910 4 Da)t h ì h o ạ t t í n h t ố t nh ất C ấ u tr ú c xo ắnđ ơn l à m giảm hoạt tính và mất hoàn toàn khi không còn trạng thái xoắn (Mw< 510 3 Da) (Yanaki,1983)[175].

Một số sản phẩm β-glucan tiêu biểu có hoạt tính tăng cường miễn dịch,khángu

Lentinantừquảthểnấmhương(L.edodes)cóhoạttínhkhánguvàtăng cườngmiễndịchrấttốt.Cấutrúccơbảncủalentinangồmmạchchínhβ -1,3 glucan trong đó cứ 5 liên kếtβ -1,3 glucoside mạch chính có 2 liên kết nhánhβ -

1,6 glucoside, tạo nên cấu trúc xoắn ba (độ phân nhánh0 , 4 ) ( h ì n h 1 4 )

[20].Lentinanthươngmạicótrọnglượngphântửkhoảng40080010 3 Da [186]. Khả năng kéo dài đời sống bệnh nhân ung thư củaLentinan đã được chứng minh, đặc biệt đối với ung thư dạ dày, ung thư đườngruột Ngoài ra, lentinan có tác dụng thúc đẩy hoạt động của các enzyme chốngoxi hóa Lentinan cũng có tác dụng tăng cường miễn dịch ở bệnh nhân AIDS(Sobieralski, 2012) [148]. Hiện nay, lentinan đã được thử nghiệm lâm sàng ởTrung Quốc và

Liên kếtβ1,3 glucoside ở mạch chính vàβ1,6 glucoside tại mạch nhánh Cứ mỗi 5 đơn vịglucosemạch chính, sẽcó 2 liên kết nhánh

Schizophyllan(SPG)làpolysaccharidechínhtừnấmS.c o m m u n e Glucan này có gồm mạch chính chứa liên kếtβ-1,3 glucoside và mạch nhánhliên kết β-

1,6 glucoside theo tỉ lệc ứ 3 đ ơ n v ị g l u c o s e m ạ c h c h í n h t h ì c ó 1 đ ơ n vị glucose mạch nhánh (độ phân nhánh 0,33) (hình 1.5).SPG có cấu trúc xoắnba, với MWnguyên thủy là 610 6 và có độ nhớt cao.Do có khối lượng phân tửcao,khảnăngtancủaSPGkémdầndẫnđếnkhảnăngứngdụngtrongđiềutrịbị hạn chế Để khắc phục nhược điểm này, SPG được cắt nhỏ bằng siêu âm tớitrọnglượngkhoảng45010 3 SPGđượcdùngđiềutrịungthưđườngsinhdục, bàng quang, biểu mô, phổi, đầu, cổ v.v Ở Nhật Bản, SPG được điều trị lâmsàng với bệnh ung thư bắt đầu từ năm 1986 và hiện nay được sử dụng chobệnh nhân ung thư giai đoạn 2 và 3, phối hợp với xạ trị Kết quả là SPG kéodàituổithọ ởbệnh nhânungthưphổivàungthưdạdày(Kogan,2000)[82].

Mạch chính cấu tạo bởi 3 đơn vị glucose liên kếtβ1,3 glucosidic và glucose mạch nhánhliênkếtβ1,6 glucosidic.

Pleuran cũng là một polysaccharide được tách chiết từ nấmPleurotusostreatus(nấm sò) Mạch chính của nó gồm các đơn vị glucose liên kếtβ-1,3glucoside và cứ mỗi 4 đơn vị glucose mạch chính có 1 nhánh đơn liên kếtβ-1,4glucosidehoặcβ-1,6 glucoside Phân tử lượng của pleuran từ 60070010 3 Polysaccharide này có hoạt tính kháng u, giảm mỡ máu và ổn định quá trìnhđồngh ó a c a r b o h y d r a t e H ơ n n ữ a , c h ú n g c ó h o ạ t t í n h k h á n g n ấ m , c h ố n g o x i hóa Pleuran tăng giúp các thực bào và bạch cầu hạt tập trung tới vùng viêm,chống lạivisinhvật(Radzkivà cs.,2010)[131].

Mayell (2001) đã tách grifolan (GRN) từ nấmG frondosa(maitake).β- 1,3glucannàycóMwkhoảng45010 3 ,vớicấutrúctươngt ự v ớ i schizophyllan và scleroglucan, là cấu trúc xoắn ba GRN có hoạt tính tăngcường miễn dịch và kháng ung thư cao, dùng cho bệnh nhân ung thư vú, bệnhAIDS,mỡmáu,cao huyếtáp vàviêmganvi rút[104].

Từnấmlinhchi(G.lucidum),ganoderan(GPP)đượcphânlập,vớiMw

10 3 D a P r o t e o g l u c a n n à y đ ư ợ c h ì n h t h à n h b ở i s ự k ế t h ợ p g i ữ a β-1,3 glucan với protein, trong đó proteinchiếm 4% GPP có hoạt tínhc h ố n g u n g thư.Nghiêncứusâuhơnvềpolysaccharidetừnấmlinhchichothấypolysacchari de tổng của nó (GPL-T) gồm 3 loại, trong đó cóβ-1,3/1,6 glucan(GPL)làhomoglucan,chiếm31,6%vàcóMwlớntới2.08010 3 Haipolysacc haride còn lại (heteroglucan) chứa cả galactose và manose Cả 3 phânđoạn đều có hoạt tính kích thích bạch cầu đơn nhân người sản xuất TNF-α,trong đóβ- 1,3/1,6 glucan là mạnh nhất (Chang và cs., 2004) [29] GPL có hoạttính chống ung thư ổ bụngin vivo, và có hoạt tính kháng viêm (Joseph và cs.,2011) [64]. GLPs được cho là chất hoạt tính chủ chốt của linh chi, polymer nàythể hiện hoạt tính tăng cường miễn dịch bao gồm hỗ trợ chức năng các tế bàomiễn dịch, sản xuất các cytokine như IL, TNF-α, INF-ϒv.v Ngoài ra, GLPscòn làm giảm bệnh tim mạch,và chống di căn tế bào ung thư (Xu và cs., 2011)[173].

Cácβ-glucan ở nấm là chất điều hòa đáp ứng sinh học (BRM) bởi chúngkhông gây tổn thương và tạo stress lên tế bào, cơ thể, nhưng chúng giúp cơ thểthích nghi với môi trường và stress sinh học và thể hiện các hoạt động khôngđặc hiệu lên cơ thể chủ.Cácβ-glucan hỗ trợ một vài hoặc toàn hệ thống chínhcủa cơ thể, bao gồm cả thần kinh và hệ miễn dịch cũng như chức năng điềukhiển Các glucan không trực tiếp tấn công tế bào ung thư hoặc tế bào lạ trựctiếp, mà chúng kích thích các đáp ứng miễn dịch trong cơ thể chủ (Wasser,2002)[167].

Về mặt cơ chế, glucan gây đáp ứng miễn dịch ở động vật nhờ vào sựtương tác giữa glucan với các thụ thể màng của tế bào miễn dịch như đại thựcbào (macrophage), bạch cầu trung tính (neutrophile) và tế bào giết tự nhiên(naturalkiller,NK).Ởđộngvậtcó4thụthểđặchiệuvớiβ- glucan,đólàthụthể của bổ thể (complementreceptor 3, CR3), lactosylceramide, thụt h ể d ọ n dẹp (scavenger receptor), và dectin-1 (Leung và cs., 2006) [96].

Tình hìnhnghiên cứu vềnấmhầuthủ vànấmhương

Nấmhầu thủ (Hericiumerinaceus)

Nấm hầu thủ thuộc giới nấm (fungi), ngành nấm đảm Basidiomycota,phân ngành nấm agaricomycotina, lớp nấm tán Agaricomycetes, bộRussulales,họ nấm tuaHericiaceae, chiHericiumvà loàierinaceus Đây là nấm thực phẩmvàdượcliệu,phânbốởcácvùngBắcMỹ,châuÂuvàmộtsốnướcĐông Ánhư Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc Nấm có nhiều tên gọi khác nhau nhưhầu thủ (Trung Quốc), đầu khỉ (Việt Nam), bờm sư tử (lion’s mane, châu Âu),yamabushitake (Nhật Bản), v.v Trong tự nhiên, nấm thường tạo quả thể ở cáccây lá to bản đang sống hoặc gỗ mục như cây sồi và hồ đào Hiện nay, nấmđượct r ồ n g n h â n t ạ o r ộ n g r ã i , s ử d ụ n g k h ú c g ỗ m ụ c h o ặ c m ù n c ư a v v Ở Trung Quốc sử dụng nấm hầu thủ phổ biến để kích thích đường tiêu hóa, tăngsinh lực và cung cấp chất bổ dưỡng Các polysacharide từ nấm này có hiệu lựclên bệnh ung thư dạ dày, gan, da, thực quản…(Armone và cs., 1994; Georges,2007)[17,48].

Trong vài thập kỷ qua, nhiều nghiên cứu khoa học đã chỉ rằng nấm hầuthủ có hoạt tính chống ung thư, tăng cường hệ miễn dịch Mizuno và cs.(1995)tách 7 phân đoạn polysaccharide từ nấm hầu thủ có hoạt tính ức chế khối uSarcoma 180 ở chuột từ 40.3 – 75.9% [112] Đáng chú ý, phân đoạnFIII-2b (làβ-1,3/1,6 glucan) giúpchuộtsốngsót 100%, trong khiđó tấtc ả c h u ộ t đ ố i chứng bịchết.Dịchchiếtnấmhầuthủlàmgiảmkhốiutrực tràng(ungthưgây bởid ò n g C T - 2 6 ) 3 841%( K i m vàc s , 2 0 1 1 )

[ 7 8 ] D ị c h c h i ế t n ấ m làmtăngđộc tính của các tế bào giết tự nhiên (NK), phục hồi lượng NO và sự thực bào,tăng lượng tiết chất tiền viêm cytokine TNF-α, interleukin-1β và interleukin-6từ đại thực bào Hiệu lực của dịch chiết nấm đối với dòng ung thư bạch máuU937 ở người do sự ức chế nhân lên và hoạt hóa các enzyme caspase-9 vàcaspase-3 ở tế bào U937 (Kim và cs., 2011) [77] Ngoài ra, polysaccharide thôtừ nấm hầu thủ có tác dụng hiệp lực với thuốc chống ung thư doxorubicin, tăngkhả xâm nhập của thuốc vào tế bào Hep-G2 thông qua việc giảm hoạt động củayếu tố (NF)-B của Hep-G2 Polysaccharide HEB-APFr 1 (làβ-1,3 glucan vớinhánhβ-1,2 mannan) từ dịch nuôi cấy nấm hầu thủ có khả năng hoạt hóa đạithực bào, tổng hợp NO và biểu hiện các cytokine (Il-1βvà

TNF-α) (Lee và cs.,2009)[90].Polysaccharide,β-

1,6glucanvớinhánhbênliênkếtβ-1,3glucoside, cảm ứng đại thựcb à o t ổ n g h ợ p c á c c h ấ t N O , I L - 1 βvà TNF-α(Leevà cs., 2009) [90] Dịch chiết nước nóng hầu thủ kích thích tế bào NK tổng hợpIL-12, IFN-ϒ làm tăng hoạt lực lên tế bào ung thư (Yimcs., 2007) [177], cảmứng tổng hợp IL-1β bởi đại thực bào (Son và cs., 2006) [149] Hai hợp chấtphântửnhỏlàhericinoneAvàBđượcpháthiệncóhoạttínhchốngdòng tếbào ung thư cổ tử cung (Hela cells), với giỏ trị MIC là 100 và 6,3 àg mL 1 (Kawagishi và cs., 1990) [66].Hericenone I và hericene D có hoạt tính chốngdòng tếbàoungthưEC109(Mavà cs.,2010)[102].

Nagano và cs (2010) thử nghiệm lâm sàng trên bệnh nhân có triệu chứngsuy nhược, bất an [119] Kết quả cho thấy các triệu chứng này giảm đáng kể ởbệnh nhân sử dụng 2gbột nấm trong 4tuần Polysaccharidet r o n g d ị c h n u ô i cấy nấm có tác dụng tăng cường sự phát triển và biệt hóa của tế bào thần kinhchuột (Park và cs.,

2002) [127] Mori và cs (2011) thấy rằng quả thể nấm hầuthủ có tác dụng bảo vệ và tăng cường khả năng nhận thức của chuột, ngăn chặnbấtthườngtrongnhậnthức[ 1 1 5 ] Tácgiảnàycũngđãthửnghiệmlâ msàng trênbệnh nhân, với liều 750mgn ấ m / n g à y / n g ư ờ i S a u 3 t h á n g s ử d ụ n g , n ấ m hầu thủ giúp nâng cao nhận thức, ngăn chặn tổn hại thần kinh (Mori và cs.,2009) [114] Dịch chiết nước nóng nấm hầu thủ có tác dụng hồi phục các tế bàothầnkinhbịtổnthương(ởchuột)(Wongvàcs.,2012) [171].C á c c h ấ t erinacine A, B và C thuộc nhóm diterpenoids chiết từ sợi nấm có tác dụng pháttriển hệ thần kinh(nerve growth factor,NGF),tái tạothần kinhngoại vi(Kawagishiv à c s , 1 9 9 4 ) [ 7 0 ] S a u đ ó , 3 c h ấ t e r i n a c i n e s k h á c l à E , F v à G cũng được phát hiện có hoạt tính kích thích phát triển hệ thần kinh trung ương(Kawagishivàcs.,1996) [69].Cácchấtphenolstáchchiếttừquảthểlàhericenone C,Dvà Ecũng tăng pháttriểnhệ thần kinh(Kawagishi vàc s , 1991)[66].

Gốc tự do hoạt động (reactive oxygen species, ROS) thường liên quanđến một số quá trình thoái hóa, bệnh tật và hội chứng, bao gồm ung thư, timmạch, bệnh suy giảm thần kinh, và các rối loạn liên quan đến tuổi già. Wong vàcs.(2009)nhậnthấydịchchiếtsợinấmhầuthủcóhàmlượnghợpc h ấ t phenolic cao và chúng có hoạt tính chống oxi hóa [172] Ngoài chất phenolic,polysaccharide ở nấm hầu thủ cũng có tác dụng chống oxi hóa Zhang và cs.(2012) chỉ ra rằng HEP-80 có hoạt tính bao vây gốc tự do, bảo vệ gan khỏi tácnhân CCl4nhờ đặc tính chống oxi hóa của chất này [185] Han và cs (2012) đãphát hiện rằng polysaccharide HEP tăng hoạt tính của các enzyme chống oxihóa ở chuột (CAT, GSH-Px, SOD và GR), làm giảm sự tích tụ gốc ô xi hóa tựdo trong thận [52] Polysaccharide làm tăng hoạt tính enzyme chống oxi hóa làmetaloprotease-1, tăng collagenase 1, và chống lão hóa da (Hui và cs., 2010)[59] Ba chất trao đổi thứ cấp ở nấm hầu thủ thuộc nhóm diketopiperazinealkaloids có hoạt tính chống oxi hóa (hệDPPH) với IC50~ 12 àM (Lu và cs.,2014)[101].

Nấm hầu thủ được dùng từ lâuchữacác bệnh liên quan đến mấtk i ể m soát đồng hóa lipid, có liên quan tới bệnh tim mạch Các polysaccharide ngoạibào của nấm khi được sử dụng qua đường miệng có tác dụng giảm cholesteroltổng 32,9%, giảm cholesterol LDL 45,4%, giảm triglyceride 34,3% (Yang vàcs., 2003) [115] Cặn chiết ethanol nấm hầu thủ làm cải thiện quá trình chuyểnhóa lipid (Hiwatashi và cs., 2010), ngăn chặn sự ngưng kết tiểu cầu, giảm bệnhhuyết khối (Mori và cs.,2010) [55,115] Hoạt tính chống ngưng kết tiểu cầu ởngười,chuộtdochấthericenoneBcủanấmhầuthủ.Cặnchiếtmethanolnấ mcó tác dụng giảm đường máu, triglyceride và cholesterol tổng số (Wang và cs.,2005)[163].

Cặn chiết methanol nấm ức chế một loạt các vi khuẩn nhưB. cereus,Staphylococcus aureus,Enterococcus faecalis,Salmonella typhimurium,E.colivà các nấm nhưCandida albicans,Schizosaccharomyces pombe(Wong và cs.,2009) [172] Trong số 4 chất kháng nấm, chất FD-838 kháng nấm bệnh cây làBotrytis cinereavàGlomerella cingulata, với giá trị MIC là 6,25 àM, tươngđươngvớichấtứcchếchuẩnlàcarbendazim(Luvàcs.,2014)

[ 1 0 1 ] Erinacines J và K từ sợi nấm kháng lại vi khuẩnStaphylococcus aureuskhángmethicillin (Kawagishi, 2006) [68] Chất hericirine có hoạt tính kháng viêm bởikhả năngức chế tổng hợp iNO2,COX-2 và giảm NO,TNF-α,IL-6 vàI L - 1 β(Livà cs.,2014) [97].

Huang và cs (2007), Lee và cs (2010) cũng đã tối ưu hóa điều kiện lênmen sản xuất exopolymer của nấm hầu thủ, đạt 1,241,3 g/L dịch [58,98].Exo-heteropolysaccharide (Mw~10 6 ) từ dịch lên men hầu thủ được tinh sạch 99% vàcó cấu tạotừglucose,galactose,mannose,fructose,xylose(Parkvà cs.,2002).

Mizuno và cs (1992) tinh sạch được 2 phân đoạn FIa-α và FIa-β có bảnchất hetero-polysaccharide và chứa các liên kếtβ-1,3 và 1,6 glucoside ở nấmhầu thủ [110] Nhiều tác giả khác đã tách chiết các polysaccharide hoạt tính củaquả thể hầu thủ trong phân đoạn nước nóng (Chang và cs., 2004; Kim và cs.,2012) [30,76] Seok và cs (2009) tách tinh sạch-1,6-glucan có nhánhβ - 1,3từdịch chiếtnướcnónghầuthủ[140].

Dịch chiết axit thu được hàm lượng polysaccharide thấp hơn Cũng nhiềunghiên cứu về bảnchất polysaccharidecủa phần dịchchiếta x i t n ấ m K i m v à cs (2012) thấy rằnghàm lượng-glucan trong dịch chiết bởi axit là ít hơn 34lần so với hàm lượngβ-glucan trong dịch chiết nước nóng và chiết 50% ethanolkết hợp vi sóng [76] Mizuno và cs (1999) tách glucoxylan (Mw15510 3 ) liênkết-1,3/1,6 bằng ammonium oxalate Tác giả Mizuno đã thành công khi dùngammonium oxalate tách chiết nhiều polysaccharide trong các quả thể nấm khác[110].

Dong và cs (2006) tinh sạch-1,3/1,6-glucan từ dịch chiết kiềm quả thểnấmhầuthủgiàuliênkếtβ-1,6,khácvới-1,3/1,6-glucanchiếtbằngenzyme/ microwaveíthơnvềmạchnhánhβ-1,6(Ookoschivàcs.2008)[42,124].K i m v à c s ( 2 0 1 2 ) t á c h p o l y s a c c h a r i d e t r o n g d ị c h c h i ế t k i ề m n h ậ n thấy rằng, hàm lượng polysaccharide thấp và hơn nữa, phân đoạn này không cóhoạt tính tăng miễn dịch như trong phân đoạn chiết nước nóng của quả thể hầuthủ[76].

Cácnghiên cứuởViệtNamhầuhếtlàđềcậpđếnkỹ thuậtnuôitrồng l oài nấm này (Tamikazukume, 1998; Lê Minh Tuấn và cs., 2009; Nguyễn ThịChính,2011) [7,11,3].

TácgiảNguyễnThịChính(2005)đãnghiêncứumộtsốhoạtt í n h enzymep h â n g i ả i t i n h b ộ t , c e l l u l o s e , g e l a t i n t ừ n ấ m h ầ u t h ủ , v à t h à n h p h ầ n dinhdưỡng,khoángchấtởnấmnày[2].HoạttínhkhángvisinhvậtB a ci ll us subtilisvàE.colinấm hầuthủđượccholà rấtkém,thậmchíkhôngcó(NguyễnThị

Năm2007,CổĐứcTrọngvàcsđãthựchiệnthànhcôngDựán“Nghiêncứu quytrìnhcôngnghệ trồngnấmhầuthủ chịunhiệt”.

Nấmhương (Lentinus edodes)

NấmL edodesthuộc giới nấm (kingdom – fungi), ngành (phylum) nấmđảmBasidiomycota,lớp(class)nấmđồngđảmHomobasidiomycetes,b ộ (orde r) nấm tán Agaricales, họ (family) nấm hương Agaricaceae, chi (genus)nấm hương Lentinus và loài (species)edodes Đây là đối tượng nấm lớn dượcliệu đầu tiên cho ngành công nghệ sinh học Nấm hương được trồng phổ biếnthứ hai trên thị trường thế giới (chỉ sau nấm mỡAgaricus bisporus), đóng gópgiátrịdinhdưỡngvàgiátrịdượcliệu.Nấmhươngcònđượcgọilànấmđôngc ô (TrungQuốc),shiitake (Nhật Bản).

Nấm hương mọc ở trên thân các cây gỗ như sồi, thích, dương, thiết mộc,dâu tằm trong điều kiện khí hậu nóng và ẩm Chúng phân bố ở tự nhiên ở cácnướcthuộcvùngĐôngÁnhưTrungQuốc,NhậtBản,HànQuốc,NewGuine, ở Đông Nam Á như Việt Nam, Thái Lan Ở Việt Nam, nấm hương mọc ở cácvùng rừng núi như Tuyên Quang, Hòa Bình, Thái Nguyên, Cao bằng, v.v Trung Quốc và Nhật Bản là nước trồng nhiều loại nấm này (Chang, 1999;Changvà Miles,2004) [27,29].

Nấm hương là loại nấm ăn được có giá trị dinh dưỡng cao Quả thể khônấm rất giầu carbohydrate và protein Chúng chiếm 5860% carbohydrate,2023% protein, 910% xơ, 34% chất béo và 4-5% tro Nấm là nguồn cungcấpv i t a m i n , đặc b i ệ t t i ề n vi ta mi n D 2 ( e r g o s t e r o l ) C h ú n g c ũ n g c h ứ a v it am in nhóm B như vitamin B1, B2, B12 và pantothenic acid Hàm lượng các chấtkhoáng(mg/g)gồmK,15,1;Ca,22;Mg,4478;Mn,1,2;Cd,0,96;Fe,2,36; Ni,52,5; Cu,89,1; P,281;Zn,282;Ge,3; Br,11,4;vàSr,164[168].

Các polysaccharide tan trong nước ước tính từ 15% trọng lượng khô.Ngoài ra, các polysaccharide giống như glycogen là (1,4)-, (1,6)α-D- glucans,lentinan (β- 1,3/1,6 glucan), heterogalactan, heteromannan, xyloglucan

… cũngcó trong quả thể nấm Các polysaccharide không tiêu hóa được (chất xơ) baogồm heteroglycan,polyuronide,β- glucanvàchitin.Cácđườngtựdogồmtrehalose,glycerol,mannitol,arabinol,mannose vàarabinose[168].

Các axit béo chiếm 3,38% tổng số lipid, và gồm linoleic acid (18:2),72,8%;palmiticacid(16:0),14,7%;oleicacid(18:1),3,0%;tetradecenoic acid

Cácchấtthơm chứanhóm alcohol, ketone,s u l f i d e , a l k a n e , a c i d b é o Chấtbayhơi,cómùithơmlàmatsutakeol(octen-1-ol-3)vàethyl-n- amylketone Chất tạo vị ngon, dễ chịu gồm monosodium glutamate, 5’nucleotides,amino acid tự do, các peptide phân tử thấp, acid hữu cơ và đường Các acid hữucơ tạo nên mùi vị nấm gồm axit malic, fumaric, alpha keto glutaric, oxalic,lactic,acetic,formic vàglycolic[168].

Người Nhật Bản xưa đã coi nấm hương là “thuốc tiên của cuộc sống” bởichúng tăng cường sinh lực và năng lượng Hoạt tính sinh học ở nấm hương nhưkháng vi sinh vật, kháng ung thư, kháng vi rút, chống tiểu đường, mỡ máu, timmạch v.v… được phát hiện ở cả quả thể và sợi nấm Một vài chất có hoạt tínhđángc h ú ý ở n ấm hươngl à l e n t i n a n ( β - g l u c a n t ă n g c ư ờ n g m iễ nd ị c h , ch ốn g ung thư…), lectin (protein phân tử lượng thấp chống ung thư,tăng miễn dịch)(Nikitina và cs., 2007) và eritadenine (giảm mỡ máu) (Sugiyama và cs., 1995)[121,151].Nấmhươngđượcsửdụnglàmthuốctrịcácbệnhliênquanđếnsuy giảmmiễndịch(baogồmcảAIDS),ungthư,tiểuđường,dịứngmôitrường,nhi ễmnấm,cảmcúm,viêmnhiễm,và bệnhliênquantiếtniệu.

Khángu Lentinan( β-D-glucan),K S - 2 - α-mannan- peptide,L E M , LAP(Heteroglucan-protein),EP3. Điềuhòa miễndịch Mannoglucan,p o l y s a c c h a r i d e - p r o t e i n , g l u c a n , l e n t i n a n , polysaccharideL-II.

Khángvirút Lentinan,LEM,JL-18, EP3,EPS4

Chốngmỡmáu,xơvữa độngmạch Eriadenine(lentinacin,lentysine)

Chốngviêmgan Lentinan,LEM,dịchchiếtnướcvàdịchchiết cồn

LEM và LAP: dịch chiết nước nóng bột sợi nấm và dịch nuôi cấy nấm.Cả hai đều là glycoproteinchứa glucose, galactose, xylose, arabinose, mannose và fructose LEM chứa thêm dẫn xuất của nuleicacid,vitamin Bvà ergosterol.

Lentinan được tinh sạch và nghiên cứu hoạt tính đầu tiên bởi tác giảChihara (1970) [36] Lentinan có hoạt tính chống ung thư mạnh hơn so vớipolysaccharidetừcácnấmkhác.ỞchuộtCD-1gâynhiễmSarcoma-180,lentinan với liều 15 mg/kg10 lần sẽ ức chế 9597,5% khối u và với lượngnhỏ tới 0,2 mg/kg10, lentinan hồi phục 6/10 chuột nhiễm u (Chihara, 1970)[36]. Lentinan bám vào bề mặt tế bào bạch huyết làm hoạt hóa bạch cầu, tế bàotrợ giúp loại T (T- helper cell), tế bào giết tự nhiên (NK), và các tế bào hỗ trợkhác. Qua đó, các kháng thể, interleukin (IL-1, IL-2) và IFN-ϒ được tăng sinhtổng hợpnhằmkiểmsoátungthư.

Nấm hương có khả năng tăng cường miễn dịch cao nhờ lentinan làm tănghoạt tính tế bào giết tự nhiên (NK), tế bào độc tố T (CTL), tế bào giết hoạt hóabởi lymphokine (LAK) và đáp ứng quá mẫn muộn (DTH) đối với các khángnguyên củakhốiu.

Việc sử dụng lentinan giúp chuột giảm đáng kể mức độ nhiễm ký sinhtrùng sốt rétPlasmodium yoelii, tăng sự sống sót Nhờ đáp ứng miễn dịch,lentinan làm tăng lượng IL-12, IFN-ϒ và NO (nitric oxit) ở tế bào lá lách chuộtbịnhiễmkýsinhtrùng(Zhou,2009)[186].Lentinanđượcchochuộtt h í nghiệm uống qua đường miệng trong 7 ngày với lượng 3 mg trước khi gây ubiểu mô ruột,kết quả làm giảm 94,44% kích thước khối u (Mah-Lee, 2002)[103].

Lee(2009)đãtinhsạchđược9polysaccharidetừnấmhương,trongđó,3 loại (CPFN-G-I, CPBN-G và CPBA-G) có tác dụng tăng NO, tăng lượngTNF-αvà hoạthóa đạithực bào [90].

Ngoài lentinan, 2 loại lectin (protein) là L-1 và L-2 ở nấm hương cũngđược nghiên cứu Các lectin ở nấm nói chung được cho là có khả năng giảm sựnhân lên của các tế bào ung thưbạch cầu M1, U937, tếbào ung thư gan Hep-G2 Ngoàira, lectin từ nấm cóhoạt tínhtăngsự phân bào của tếb à o l á c h , t ế bàoT v à t ă n g sả n x u ấ t c á c c h ấ t I L - 2 , I F N - ϒ , T N F - α( N i k i t i n av à c s , 2 0 0 7 )

[121] Lectin nấm hương được sản xuất ở dịch nuôi cấy chìm sợi nấm. Lectinnày có hoạt tính tăng sự phân bào của tế bào bạch huyết lách chuột và tế bàobạch huyết ngoại vi ở người (Moon và cs., 1995) [113].Hơn nữa, lectin nấmhương cókhảnăngngưngkết các tếbàoungthưn g ư ờ i

Bêncạnhkhả năng khángu, tăng cườngm i ễ n d ị c h c ủ a n ấ m h ư ơ n g , nhiều hoạt tính sinh học khác cũng được nghiên cứu Các phân đoạn chiếtchloroform, ethyl acetate, nước nóng có hoạt tính kháng vi sinh vật gồm vikhuẩn, nấm men và nấm mốc (Bisen, 2010) [20] Các hợp chất có hoạt tínhkháng vi sinh vật gồm có lentinanmicin, lenthionine,β-ethyl phenyl alcohol(Bisen, 2010) [20] Nấm hương có hoạt tính chống virus cúm tương đương chấtamantadine hydrochloride (chất chống cúm thông dụng).Dịch chiết nước nóngnấm hương ngănc ả n s ự n h â n l ê n c ủ a v i r u s p o l i o L e n t i n a n g i ú p c ơ t h ể k h á n g lại sự nhiễm vikhuẩn, nấm, kýsinhtrùng vàvirus(gồm cảtácnhâng â y AIDS) Lentinan làm giảm độc tố của thuốc AZT (azidothymidine) cho bệnhnhân AIDS, giảm các triệu chứng ban đầu của bệnh nhân Ngoài lentinan vànhiều chất khác từ nấm hương cũng có tác dụng chống virus Chất LEM từ nấmhương ngăn chặn sự phóng thích của virus Herpes simplex ở động vật và chấtJLS-18 (dẫn xuất LEM) có tác dụng tốt trong điều trị viêm gan B và AIDS(Yamamoto,1977)[174].

Ngoài ra, nấm hương có chứa chất eritadeine làm giảm lượng cholesteroltrong máu Tác động làm giảm cholesterol trong máu của eritadenine từ nấmhương trêncơ thểđộngvậtđãđượcthửnghiệmvàchứngminh[51].

Hoạt tính chống tiểu đường của polymer từ dịch nuôi cấy nấm hương cótác dụng giảm 21,5% lượng glucose trong máu và tăng lượng insulin lên22,1%ở chuột.Polymer này còn làm giảm 25,1 và 44,5% lượng cholesterol tổng vàtriglyceride [20,75].

Một phân đoạn polysaccharide ở nấm hương có tác dụngbảo vệ gan vàtăng kháng thể chống lại vi rút viêm gan B Chất lentinan tăng chỉ số SGPT(glutamic pyruvic transaminase) và làm hồiphục mức GPT trongg a n k h i nhiễmvirus(Bisen,2010)[20].

Chihara và cs (1970) đã tách chiết được 6 loại polysaccharide trong dịchchiết nước nóng của nấm hương, trong đó có lentinan (-1,3/1,6-glucan) chiếmkhốilượngnhiềunhất.Tuynhiên,Rincaovàcs.(2012)táchđượcpolysaccharide có liên kếtβ-1,6 và 1,4 glucoside nhưng không phảiβ-1,3-glucan [134].

Môhìnhnuôicấytếbàoungthưbachiều(3D)trongnghiêncứuungthư

Nghiên cứu thử nghiệm thuốc trước lâm sàng thường ít thành công, chỉvới 5% số chất qua được thử nghiệm giai đoạn III cho độ an toàn và hiệu quả.Nhiều hệ thốngm ẫ u , v ớ i n h ữ n g ư u n h ư ợ c đ i ể m r i ê n g , đ ư ợ c d ù n g đ ể n g h i ê n cứu các thành phần phức tạp của khối u và cách chữa trị Hệ thống mẫu tốt yêucầu phải rẻ tiền, thích hợp sàng lọc nhiều mẫu, và quan trọng nhất là phản ánhsinh học ung thư ở người Mô hình nuôi cấy 2 chiều (2D) đơn giản là nuôi cấychìmcácdòngtếbào(táchtừkhốiungườihayđộngvật)trongmôitrườngvàtế bào phát triển một lớp phẳng (flat monolayer), liên hệ với nhau qua tiếp xúcngoại vi Phương pháp nuôi cấy tế bào kiểu 2 chiều (2D) thiếu tổ hợp cần thiết.Trong khi thử nghiệm ở động vật là đắt tiền và mất thời gian và hay thất bại khiphản ánh sinh học ung thư ở người Nuôi cấy tế bào 3 chiều (3D) được cho làcấu nối giữa thí nghiệmin vitronhằm phát hiện và sàng lọc và thí nghiệminvivođể đánh giá tính hiệu quả và sự an toàn trước khi thử nghiệm lâm sàngthuốc Sự cùng phát triển của nhiều loại tế bào trong khối u sẽ cho phép phântích tế bào có kiểm soát và lặp lại được nhằm đưa ra phác họa thật sự về cácphản ứngin vivođốivới xửlýthựcnghiệm.

Nuôi cấy tế bào 3 chiều (3D) có thể giúp tăng nhanh sự tìm kiếm và tiếtkiệm chi phí khi phát triển các mô hình sàng lọc trước khi thử lâm sàng,kiểmtra cũng như trong nghiên cứu và phát triển các liệu pháp chữa bệnh.N g o à i việcgiúptahiếusâuhơnvềtínhnộicânbằng,sựbiệthóatếbào vàtổchứcmô, phương pháp nuôi cấy 3D còn cung cấp môi trường xác định (chủ động) đểnghiênc ứ u h ơ n l à m ô i t r ư ờ n g p h ứ c t ạ p c ủ a c ơ t h ể (inv i v o)( T h o m a v à c s ,

2014) [155] Khối u phát triển 3D là tập hợp nhiều loại tế bào gồm tế bào ungthư bị biến gen và cùng với các tế bào tổ tiên không biến đổi gen (biểu mô), cáctế bào miễn dịch xâm nhập, các nguyên bào sợi v.v Sự phát triển và duy trìcủa các mô phụ thuộc vào chuỗi các tương tác giữa các tế bào trong một vi môitrường chứa các yếu tố phát triển, hocmon và các phân tử đính cũng như các hệthống phân tử ngoại bào phức tạp khác Việc đồng thời nuôi cấy tế bào điềukiện3 D c h o p h é p n g h i ê n c ứ u s ự t ư ơ n g t á c t ế b à o v ớ i t ế b à o , t ế b à o v ớ i h ệ thống ngoài, sự biệt hóa tế bào, sinh sản, chết theo chương trình và biểu hiệngen (Kim, 2005) [74] Nuôi cấy 3D tế bào ung thư là gần giống với chúng ởdạnginvivoxétvềhìnhdạngtếbàovàmôitrường.Điềunàyquantrọngbởib ởihìnhdạngtếbàovàmôitrườngsẽxácđịnhtínhchấtvàbiểuhiệngencủa tế bào.

Có 5 lý do để nhà nghiên cứu ung thư chọn nuôi cấy tế bào 3D (Kimlin và cs.,2011)[80]:

+K h i n u ô i c ấ y 2D,t ế b à o p h á t t r i ể n g i ố n g n h a u v à k h ô n g c ó s ự sa i khác về oxy, dinh dưỡng, tác nhân sinh trưởng Tế bào được nuôi cấy 3D sẽ tạora các vùng phát triển khác nhau và khối u có hình cầu với sự khác nhau về oxi,dinh dưỡng, tác nhân sinh trưởng trong khối Vì vậy, nuôi cấy 3D dùng nghiêncứu hình dạng khối u và sự khác biệt giữa các dòng tế bào từ khối u tách từ bộphậnhaymôkhác nhau.

+ Các tế bào nuôi cấy 3D có thể gia tăng sự kháng lại thuốc hơn so vớinuôi cấy 2D Tế bào bên trong lõi sẽ được bảo vệ bởi tế bào ngoài, giúp ngănchặnthuốcxâmnhậpvàotrong.

+ Sự đa dạng của tế bào nuôi cấy 3D là do tốc độ phát triển khác nhau,biểuhiệngenkhácnhau.Điềunàydẫntớithayđổihìnhtháivàchức năng.

+ Tế bào nuôi cấy 3D có sự biểu hiện gene khác nhau, khi so sánh vớinuôi cấy 2D Tế bào có sự giao tiếp khác nhau với hệ thống ngoàiv à t ế b à o biểu mô,dẫntớithayđổitruyềntínhiệunộibào.

+Tếbàonuôicấy3Dpháttriểngiốngvớitếbàopháttriểntrongkhốiu sống. Điều đáng chú ý nhất trong nuôi cấy 3D là khả năng điều chỉnh mỗithành phần của hệ vi môi trường khối u thử nghiệm và hiểu rõ sự điều khiểnbệnh.

Đốitượngnghiêncứu

Nấmhương

Chủngn ấ m h ư ơ n gL e n t i n u l a e d o d e s ( B e r k ) P e g l e r đ ư ợ c l ư u g i ữ t ạ i PhòngSinh họcthựcnghiệm, Viện HóahọccácHợp chất thiênnhiên.

Nấmhươngthànhphẩmkhô(quảthể)đượccungcấpbởiViệnDitruyềnNông nghiệp,Hà Nội.

Nấmhầuthủ

Chủngnấmhầuthủ((Hericiumerinaceus(Bull.:Fr.)Pers)đượclưugiữt ạiPhòng Sinh họcthựcnghiệm, Viện HóahọccácHợp chất thiên nhiên.

Dụng cụ,hóa chấtvàmôitrường

Dụng cụvàthiết bị

Tủ cấy vi sinh - Box laminar PII (Đức); Tủ ấm– Memmert (Đức); Cânđiện tử AL300 – Thụy Sỹ;Nồi khử trùng Lequenx (Pháp); Máy lắc thườngGerhardt (Đức); Kính hiển vi thường Olympus (Nhật Bản); Bình lên men 2 L, 5L;Nồilênmen15L;Tủ lạnhSanyo (NhậtBản)

Kính hiển vi soi ngược, tủ ấm CO2, tủ ấm thường, tủ lạnh sâu -80 o C,máyđọc quang dùng cho phiến 96 giếng, máy trộn vortex, các bộ lọc, bộ pipet-mancáccỡ

Môi trường

Môi trường dùng nuôi cấy nấm (g L  1 ): glucose 10, pepton 5, cao nấmmen 3, K2HPO40,5, KCl 0,5, CaCO31, nước chiết 200 gr khoai tây,pH5,56,0.Môitrườngđược khửtrùng110C,30phút.

- Môitr ư ờ n g M E M E (Minineal E ss e n t i a l Me d i u m withEa g l e ’ s s a l t s ) bổ sung 710% huyết thanh bê tươi, 1% dịch kháng sinh PSF (potassiumpenicillin-streptomycin-fungizone)và1%NAA(non- essentialaminoacid).

- Hoặc môi trường DMEM (Dullbecco’s modified Minimum EssentialMedium): 10%huyếtthanh bêtươi,1%dịch kháng sinh (PSF),1%NAA.

Dịch kháng sinh PSF: 100 đơn vị penicillin/mL, 100g streptomycinsunfat/ml,0,25gamphotericin B/mL. Đệm PBS (phosphate bufferred saline, g/L): NaCl 8; KCl 0,2;

Na2HPO41,15; KH2PO40,2;Khửtrùng 1atmtrong30phút.

Cácphươngphápphân lập cáchợp chất

Sắc ký lớpmỏng được thực hiện trên bản mỏng trángs ẵ n D C -

A l u f o l i e n 60F254(Merck1,05715),RP18F254s(Merck).Pháthiệnchấtbằngđ èntửngoạiở hai bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO410% được phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng từ từ đến khi hiện màu Phươngphápsắckýbảnmỏng(TLC) hợpchấtđường

Chấm0,20,5LdịchthủyphânlênbảnsilicagelF254,đểkhômẫu.Hệ dung môi dùng chạy sắc ký có thành phần và tỉ lệ saun -butanol : acetone :nước (50:10:20) Các thành phần đường trong mẫu được phát hiện bằng cáchnhúngb ản si li ca ge l sa u k h i c h ạ y trongd u n g d ịc hm e t h a n o l c h ứ a 5 %

H2SO4,làmkhôvà hiệnmàutại110C trong510phút.

Sắc ký lớp mỏng điều chế thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn Silica gel60G F254(Merck, ký hiệu 105875), phát hiện vệt chất bằng đèn tử ngoại haibước sóng 254 nm và 365 nm, hoặc cắt rìa bản mỏng để phun thuốc thử là dungdịch H2SO410%, hơ nóng để phát hiện vệt chất, ghép bản mỏng lại như cũ đểxác định vùng chất, sau đó cạo lớp silica gel có chất, giải hấp phụ thu được chấtcầntinhchế.

Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là silica gel pha thường vàpha đảo Silica gel pha thường có cỡ hạt là 0,0400,063 mm (240430 mesh).Silica gel pha đảo ODS hoặc YMC (3050m, Fujisilisa Chemical Ltd.).

Nhựatrao đổiionDianionHP-20(Misubishi Chem,Ind,Co.,Ltd.)

Phươngpháp tinh sạchβ-glucantừnấmhươngvànấmhầu thủ

Phươngpháptinhsạchβ-1,3-glucantừnấmhương

Phươngpháptinhsạchβ-1,3-glucantừnấmhầuthủ

Cácphương pháp xácđịnhcấu trúchoáhọc

Phổcộnghưởngtừhạtnhân(NMR) ĐượcđotrênmáyBruckerAvance 500MHz(chấtchuẩnnội làTMS

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều: HSQC,

HMBC.Dungmôi sửdụng bao gồmcácdung môi DMSO- d 6 ,CDCl3.

Việcl ự a c h ọ n r a d u n g m ô i đ o p h ụ t h u ộ c v à o b ả n c h ấ t c ủ a t ừ n g m ẫ u , t h e o n guyên tắcdung môiđophảihòatanhoàntoàn mẫuthử.

Phổ khối lượng phun mù điện tử ESI-MS được đo trên máy Agilent

Phươngphápxácđịnhhàmlượngpolysaccharide

100Lm ẫ u đ ư ợ c t r ộ n đ ề u v ớ i 1 00Ldungd ịc h5% phenol.500Ldun gdịchH2SO4đặcđượcbổsungtrựctiếpvàohỗnhợpmẫu.Đunnónghỗn

500600 hợp trong 5 phút, để nguội và so màu tại bước sóng A492nm (hình dưới). Từgiá trị mật độ quang và dựa vào đường chuẩn (dùng glucose), xác định đượchàm lượng polysaccharide trong mẫu.Màu sắc càng nâu đậm, thì hàm lượngpolysaccharidecàngcao.

Cường độ màu của poly polysaccharide với hỗn hợp dịch nhuộm (hình trái) Đồ thị chuẩndùngglucosevớinồngđộxácđịnh phảnứngtạomầuvớihỗnhợp dịchnhuộm(hình phải)

2.7 Thủy phân không hoàn toàn β -1,3-glucan từ nấm hầu thủ bằng-1,3- glucanase

Enzymeβ-1,3 glucanase (cắt liên kếtβ-1,3 glucosidemột cách đặc hiệu,hãng Sigma) được chọn làm enzyme thủy phân mạch- 1,3 glucan thành-1,3-glucan mạch ngắn hơn và các oligomer, đường glucose Enzyme này khôngcó hoạt tínhβ-1,6-glucanase nên không làm thay đổi cấu trúc mạch nhánh (liênkếtβ-1,6 glucoside) của sản phẩm sau khi được cắt, đảm bảo các cấu trúcβ- 1,3/1,6 glucanvẫnđược giữnguyên.

Dung dịch DNS (3,5 dinitrosalicylic acid) được dùng để hiện mầu nhậnbiết gốc đường khử và cường độ mầu đo ở bước sóng 540 nm (Miller, 1959)[106].

Sản phẩmβ-1,3/1,6-glucan đã tách chiết và tinh sạch từ nấm hầu thủ,được sử dụng để làm chất mang curcumin (Cur) (chiết xuất từ cây nghệ vàng),tạo phức curcumin/β-1,3/1,6-glucan (Cur-Glu) Phức Cur-Glu giúp làm tăng

O D 4 9 2 n m độtancủaCurtrongnước,tăngt í n h sinhkhảdụngcủaCur cũngnhưtăngho ạt tínhchốngung thưcủahệCur-Glu.

Nuôi tế bào ung thưin vitrotheo Skehan và cs [145] Xác định hoạt tínhgây độc các dòng tế bào ung thư theo phương pháp SRB của Likhitayawuid vàcs. đang được tiến hành tại Viện Nghiên cứu Ung thư Quốc gia của Mỹ (NCI) (Likhitwitayawidvà cs 1993) [99] Phương pháp này đã được phòng Sinh họcThực nghiệm thuộc Viện Hoá học các Hợp chất Thiên nhiên áp dụng từ năm1996.

Phản ứng dựa vào khả năng thuốc nhuộm SRB bám vào protein của tếbàođãđượccốđịnhbởitrichloroaceticacid(TCA).SRBlàchấtnhuộmaminoxanthene hồng nhạt với 2 nhóm sulfonic tác dụng gắn với các chất chứaamino acid cơ bản trong điều kiện axit nhẹ, và tách ra trong môi trường pHkiềm Lượng chất màu tách ra từ tế bào được nhuộm là tương ứng với khốilượng tế bào. Độ mạnh của sự bám dính SRB cho phép phản ứng thực hiện trong phiến96 giếng Phản ứng SRB được chứng minh là có tính ứng dụngbởi lớp tế bàosau khi cố định bởi TCA và nhuộm với SRB có thể được lưu giữ lâu dài Chấtmầu tách ra từ tế bào nhuộm SRB là bền vững Với tính nhạy cao, sử dụng vớiphiến 96 giếng và tính bền vững, phản ứng SRB là phù hợp với ứng dụng sànglọc lớn cũng như trong nghiên cứu Phản ứng này được dùng rộng rãi cho kiểmtrađộctính củathuốcvới các dòngtế bàoungthưvà không ungthư.

Dòng tế bào được lưu giữ trong nitơ lỏng, hoạt hóa và duy trì trong cácmôi trườngdinh dưỡngMEME,Eaglehoặc DMEM.

Tế bào được nuôi trong các điều kiện tiêu chuẩn (CO25%; độ ẩm 98%;nhiệt độ37 o C, vô trùng tuyệt đối), tế bào được hoạt hoá trước khi thí nghiệmtiếnhànhtừ1824giờ.

Dùng dung dịch tripsin versel 0,1% để tách tế bào sau khi đã rửa tế bàobằng đệm PBS Pha tế bào bằng môi trường sạch, đếm số lượng, tạo huyền dịchtế bào ở nồng độ thí nghiệm ( khoảng 3510 4 tế bào/mL tùy theo từng loại tếbào thửnghiệm).

Mẫuthử: Chất chiếttừthựcvậthaysinh vật nóichung

(DMSO) độc tính ở nồng độ cao, nên cần hòa loãng với môi trườngởnồngđộnhỏhơn1%.

Nhỏ vào các giếng của phiến thí nghiệm theo sơ đồ như sau:Dãyđốichứngâm:DMSO10%

Dãyđốichứngdương:chấtchuẩncó khảnăngdiệttế bào(ellipithine )phatớinồngđộ0,01mMtrongDMSO.

Dãy thí nghiệm: mẫu thử + dịch huyền phù tế bàoPhiến được ủ trong tủ CO2ở 37 o C trong 3 ngày.Kết thúc thínghiệm

Tế bào sau khi ủ 3 ngày được cố định bằng dung dịch TCA lạnh Rửa, đểkhô, nhuộm SRB 0,4% trong axit axetic 1% và rửa lại bằng axit axetic 1% đểloại màu thừa; để khô, hoà lại bằng dung dịch đệm Trisbazơ 10M trên máy lắcngang. Đọctrên máyELISAởbướcsóng515-540mm.

Giá trị CS: là khả năng sống sót của tế bào ở nồng độ ban đầu của mẫuthử,mẫunào chogiátrị CS≤50%thìđượcđánhgiá làcóhoạttính.

Trongđó:O D : mật độ quang σ: độ lệch tiêu chuẩnσđược tínhtheocôngthức:

Trong đó:x i: giá trị ODtại giếngi

: giá trị OD trung bìnhn:sốgiếng thửlặp lại

Cácmẫucóbiểuhiệnhoạttính(CS50≤50% ±)sẽđượcchọnrachothửnghiệmbước 2 để tìmgiá trịIC50.

% c ủ a 1 0 n ồ n g đ ộ , d ự a v à o c h ư ơ n g t r ì n h T a b l e c u r v e theo thang giá trị logarit của đường cong phát triển tế bào và nồng độ chất thửđểtínhgiátrịIC50.

2.9.2 Phươngphápứcchếhìnhthànhkhốiu3chiềutrênthạchmềm(anti- tumorpromotingassay) in vitro

Hoạt tính ức chế hình thành khối u trên thạch mềm là thử nghiệm sự bámdính và hình thành khối u trên thạch mềm Theo kỹ thuật này, tế bào (đã đượcxử lý bằng các chất gây ung thư hoặc các chất ức chế ung thư) được nuôi cấycùng với chất điều chỉnh thích hợp trên môi trường thạch mềm trong 1020ngày Tiếp theo giai đoạn nuôi cấy này, các khuẩn lạc hình hành có thể đượcnhuộm rồi phân tích hình thái, hoặc đếm sốlượng khuẩn lạc hìnhthànht r ê n mỗi giếng.

Chuẩn bị tế bào (như ở mục

Tế bào nuôi trong môi trườngMEM bổ sung 10% FBS ở 37C trong tủấm CO2(5% CO2) Tế bào phát triển trong bình nuôi cấy 1 lớp, đạt đến phaseLog, tế bào được tách khỏi bình và tách rời nhau bởi tripsin, đếm và hòa lại vàomôi trường thạch loãng (0,35 % với thạch mặt và 0,5% với thạch nền) với nồngđộ tế bào 3,3310 3 /mL Trộn mẫu thử với nồng độ đầu 525àg mL1 Thớnghiệm được tiến hành trờn phiến 6 giếng, lặp lại 23 lần.Sau 1020 ngày lấyra và nhuộm tế bào bằng tím kết tinh 0,005%, đọc kết quả dưới kính hiển vingượccógắncameravànốiramáytính.Hoạttínhứcchếhìnhthànhkhốiu trên thạch được tính lặp lại 35 lần so sánh % số lượng khuẩn lạc hình thànhkhối u, kíchthướckhốiusovớiđốichứng(DMSO1%).

Nghiên cứu tính độc cấp theo phương pháp của Abrham (1978) [13] vàTurner(1965).ĐượcthửnghiệmtạiBộmôn Dược lý–Học việnQuân y.

Căn cứ vào kết quả LD50dùng phép ngoại suy cho liều dùng trên độngvật,chúng tôi sử dụng cho uống chế phẩm bán trường diễn 2 mức liều thấp vàcao.

Phương pháp được mô tả bởi Abrham (1978) [13] và theo quy định củaWHO(2000)

[169]vàBộYtếvềhiệulựcvàantoàntrongnghiêncứuthuốccó nguồn gốc thiên nhiên. Được thử nghiệm tại Bộ môn Dược lý – Học việnQuân y.

2.10.3 Phươngphápđánhgiámộtsố tácdụng củasảnphẩm ĐượcthửnghiệmtạiBộmôn Dượclý–Họcviện Quâny.

2.10.3.1 Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của HG1 trên mô hình gây độc ganbằng carbontetracholorid

Theophươngphápthốngkêdùngtrongy-sinh-dượchọc.SửdụngphầnmềmMicrosoftExcel(Nguyễn XuânPhách vàcs.,1995) [5].

Nấm hương khô (2 kg) được tiến hành chiếtsiêu âm với ethanol 95% balần.Phầndịchchiết(sửdụngđểphânlậpcáchợpchấtcóphântửlượngnhỏ)và phần bã nấm sau khi chiết cồn (sử dụng để tách polysaccharide) được thuriêng.

Các dịch chiết ethanol được gộp lại và làm lạnh ở 410C thu chất kếttinhNH-1(6 g) Tiếp theo đó, phần dịch được loại dung môi dưới áp suất thấpthu được cặnchiếtethanol(65g).

Cặn chiếte t h a n o l đ ư ợ c h ò a t r o n g n ư ớ c v à t á c h p h â n đ o ạ n s ử d ụ n g 3 dung môi lần lượt làn-hexan, ethyl axetat và butanol Tiến hành cất loại dungmôi dưới áp suất giảm thu được các cặn chiết tương ứng là: cặnn-hexan (22 g),cặn ethylaxetat(15g)và cặnbutanol(18g)(sơđồ3.1).

Cặnn-hexan có hoạt tính (xem kết quả bảng 4.2 và 4.3)t i ế p t ụ c đ ư ợ c tách phân đoạn bằng sắc ký cột lặp lại trên silica gel pha thường với hệ dungmôin-hexan/axeton theo tỉ lệ 49/11/1 thu phân đoạn NH-A1 (1,5 g), NH- A2(1,3g),NH-A3(900mg).

Phân đoạn NH-A1 (1,5g) có hoạt tính (xem bảng 4.4 và 4.5) được táchchiết phân đoạn sử dụng sắc ký cột với hệ dung môin-hexan/axeton theo tỉ lệ3/1-1/1,thu được2 hợp chấtký hiệu làNH-2(150mg)vàNH-3(50 mg).

Táchc h i ế t p o l y s a c c h a r i d e ( sơ đ ồ 3 1 ) B ã n ấ m sa u k h i c h i ế t c ồ n đ ư ợ c sấy khô, bổ sung nước cất với tỉ lệ 10:1 (v/w) và trộn đều, đun 100C trong 8h, lọc thu phần dịch, lặp lại 3 lần Dịch lọc của 3 lần chiết được gộp lại và côquay chân không dưới áp suất để làm giảm thể tích, bổ sung EtOH 95 % vàodịch chiết nước với tỉ lệ 3:1

(v:v), ủ 24 tại 4C Phần cặn chứa polysaccharidethôđ ư ợ c t h u b ằ n g l y t â m v à c ặ n đ ư ợ c r ử a 2 l ầ n t r o n g e t h a n o l , l à m k h ô t h u đượccặnpolysaccharideP1(76,8g).

Lớp etyl axetat Lớp nước

Cặn BuOH (18 g) Cặn etyl axetat (15g)

Phần không tansau khi chiết nước được làm khô và hòa trong 1%ammonium oxalate, chiết tại 30 o C qua đêm Hỗn hợp được ly tâm 10.000vòng/phút,5phút.DịchnổiđượctrunghòadịchbằngNaOHvàđượcbổsu ng3 lần thể tích ethanol 95%, ủ 24 h ở 4C Ly tâm thu cặn polysaccharideP2 (50g).

Nghiêncứubaocurcumin(Cur)bằng β-1,3/1,6-glucan

Sản phẩmβ-1,3/1,6-glucan đã tách chiết và tinh sạch từ nấm hầu thủ,được sử dụng để làm chất mang curcumin (Cur) (chiết xuất từ cây nghệ vàng),tạo phức curcumin/β-1,3/1,6-glucan (Cur-Glu) Phức Cur-Glu giúp làm tăng

O D 4 9 2 n m độtancủaCurtrongnước,tăngt í n h sinhkhảdụngcủaCur cũngnhưtăngho ạt tínhchốngung thưcủahệCur-Glu.

Phươngphápđánhgiáhoạttínhsinhhọc

Phươngphápthửkhảnănggâyđộctếbào(cytotoxicity)

Nuôi tế bào ung thưin vitrotheo Skehan và cs [145] Xác định hoạt tínhgây độc các dòng tế bào ung thư theo phương pháp SRB của Likhitayawuid vàcs. đang được tiến hành tại Viện Nghiên cứu Ung thư Quốc gia của Mỹ (NCI) (Likhitwitayawidvà cs 1993) [99] Phương pháp này đã được phòng Sinh họcThực nghiệm thuộc Viện Hoá học các Hợp chất Thiên nhiên áp dụng từ năm1996.

Phản ứng dựa vào khả năng thuốc nhuộm SRB bám vào protein của tếbàođãđượccốđịnhbởitrichloroaceticacid(TCA).SRBlàchấtnhuộmaminoxanthene hồng nhạt với 2 nhóm sulfonic tác dụng gắn với các chất chứaamino acid cơ bản trong điều kiện axit nhẹ, và tách ra trong môi trường pHkiềm Lượng chất màu tách ra từ tế bào được nhuộm là tương ứng với khốilượng tế bào. Độ mạnh của sự bám dính SRB cho phép phản ứng thực hiện trong phiến96 giếng Phản ứng SRB được chứng minh là có tính ứng dụngbởi lớp tế bàosau khi cố định bởi TCA và nhuộm với SRB có thể được lưu giữ lâu dài Chấtmầu tách ra từ tế bào nhuộm SRB là bền vững Với tính nhạy cao, sử dụng vớiphiến 96 giếng và tính bền vững, phản ứng SRB là phù hợp với ứng dụng sànglọc lớn cũng như trong nghiên cứu Phản ứng này được dùng rộng rãi cho kiểmtrađộctính củathuốcvới các dòngtế bàoungthưvà không ungthư.

Dòng tế bào được lưu giữ trong nitơ lỏng, hoạt hóa và duy trì trong cácmôi trườngdinh dưỡngMEME,Eaglehoặc DMEM.

Tế bào được nuôi trong các điều kiện tiêu chuẩn (CO25%; độ ẩm 98%;nhiệt độ37 o C, vô trùng tuyệt đối), tế bào được hoạt hoá trước khi thí nghiệmtiếnhànhtừ1824giờ.

Dùng dung dịch tripsin versel 0,1% để tách tế bào sau khi đã rửa tế bàobằng đệm PBS Pha tế bào bằng môi trường sạch, đếm số lượng, tạo huyền dịchtế bào ở nồng độ thí nghiệm ( khoảng 3510 4 tế bào/mL tùy theo từng loại tếbào thửnghiệm).

Mẫuthử: Chất chiếttừthựcvậthaysinh vật nóichung

(DMSO) độc tính ở nồng độ cao, nên cần hòa loãng với môi trườngởnồngđộnhỏhơn1%.

Nhỏ vào các giếng của phiến thí nghiệm theo sơ đồ như sau:Dãyđốichứngâm:DMSO10%

Dãyđốichứngdương:chấtchuẩncó khảnăngdiệttế bào(ellipithine )phatớinồngđộ0,01mMtrongDMSO.

Dãy thí nghiệm: mẫu thử + dịch huyền phù tế bàoPhiến được ủ trong tủ CO2ở 37 o C trong 3 ngày.Kết thúc thínghiệm

Tế bào sau khi ủ 3 ngày được cố định bằng dung dịch TCA lạnh Rửa, đểkhô, nhuộm SRB 0,4% trong axit axetic 1% và rửa lại bằng axit axetic 1% đểloại màu thừa; để khô, hoà lại bằng dung dịch đệm Trisbazơ 10M trên máy lắcngang. Đọctrên máyELISAởbướcsóng515-540mm.

Giá trị CS: là khả năng sống sót của tế bào ở nồng độ ban đầu của mẫuthử,mẫunào chogiátrị CS≤50%thìđượcđánhgiá làcóhoạttính.

Trongđó:O D : mật độ quang σ: độ lệch tiêu chuẩnσđược tínhtheocôngthức:

Trong đó:x i: giá trị ODtại giếngi

: giá trị OD trung bìnhn:sốgiếng thửlặp lại

Cácmẫucóbiểuhiệnhoạttính(CS50≤50% ±)sẽđượcchọnrachothửnghiệmbước 2 để tìmgiá trịIC50.

% c ủ a 1 0 n ồ n g đ ộ , d ự a v à o c h ư ơ n g t r ì n h T a b l e c u r v e theo thang giá trị logarit của đường cong phát triển tế bào và nồng độ chất thửđểtínhgiátrịIC50.

Phươngphápứcchếhìnhthànhkhốiu3chiềutrênthạchmềm(anti- tumorpromotingassay)invitro

Hoạt tính ức chế hình thành khối u trên thạch mềm là thử nghiệm sự bámdính và hình thành khối u trên thạch mềm Theo kỹ thuật này, tế bào (đã đượcxử lý bằng các chất gây ung thư hoặc các chất ức chế ung thư) được nuôi cấycùng với chất điều chỉnh thích hợp trên môi trường thạch mềm trong 1020ngày Tiếp theo giai đoạn nuôi cấy này, các khuẩn lạc hình hành có thể đượcnhuộm rồi phân tích hình thái, hoặc đếm sốlượng khuẩn lạc hìnhthànht r ê n mỗi giếng.

Chuẩn bị tế bào (như ở mục

Tế bào nuôi trong môi trườngMEM bổ sung 10% FBS ở 37C trong tủấm CO2(5% CO2) Tế bào phát triển trong bình nuôi cấy 1 lớp, đạt đến phaseLog, tế bào được tách khỏi bình và tách rời nhau bởi tripsin, đếm và hòa lại vàomôi trường thạch loãng (0,35 % với thạch mặt và 0,5% với thạch nền) với nồngđộ tế bào 3,3310 3 /mL Trộn mẫu thử với nồng độ đầu 525àg mL1 Thớnghiệm được tiến hành trờn phiến 6 giếng, lặp lại 23 lần.Sau 1020 ngày lấyra và nhuộm tế bào bằng tím kết tinh 0,005%, đọc kết quả dưới kính hiển vingượccógắncameravànốiramáytính.Hoạttínhứcchếhìnhthànhkhốiu trên thạch được tính lặp lại 35 lần so sánh % số lượng khuẩn lạc hình thànhkhối u,kíchthướckhốiusovớiđốichứng(DMSO1%).

Cácphươngpháp thửdượclý

Phươngphápđánhgiáđộctính cấp

Nghiên cứu tính độc cấp theo phương pháp của Abrham (1978) [13] vàTurner(1965).ĐượcthửnghiệmtạiBộmôn Dược lý–Học việnQuân y.

Phươngphápđánhgiáđ ộ c tínhbán trường diễn

Căn cứ vào kết quả LD50dùng phép ngoại suy cho liều dùng trên độngvật,chúng tôi sử dụng cho uống chế phẩm bán trường diễn 2 mức liều thấp vàcao.

Phương pháp được mô tả bởi Abrham (1978) [13] và theo quy định củaWHO(2000)

[169]vàBộYtếvềhiệulựcvàantoàntrongnghiêncứuthuốccó nguồn gốc thiên nhiên. Được thử nghiệm tại Bộ môn Dược lý – Học việnQuân y.

Phươngphápđánhgiámột sốtácdụngcủasảnphẩm

2.10.3.1 Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của HG1 trên mô hình gây độc ganbằng carbontetracholorid

Xửlýsố liệu

Theophươngphápthốngkêdùngtrongy-sinh-dượchọc.SửdụngphầnmềmMicrosoftExcel(Nguyễn XuânPhách vàcs.,1995) [5].

Nghiên cứu hóahọc vàhoạttính sinhhọccủanấmhương

Phân lập cách ợ p c h ấ t từquảthểnấmhương

Nấm hương khô (2 kg) được tiến hành chiếtsiêu âm với ethanol 95% balần.Phầndịchchiết(sửdụngđểphânlậpcáchợpchấtcóphântửlượngnhỏ)và phần bã nấm sau khi chiết cồn (sử dụng để tách polysaccharide) được thuriêng.

Các dịch chiết ethanol được gộp lại và làm lạnh ở 410C thu chất kếttinhNH-1(6 g) Tiếp theo đó, phần dịch được loại dung môi dưới áp suất thấpthu được cặnchiếtethanol(65g).

Cặn chiếte t h a n o l đ ư ợ c h ò a t r o n g n ư ớ c v à t á c h p h â n đ o ạ n s ử d ụ n g 3 dung môi lần lượt làn-hexan, ethyl axetat và butanol Tiến hành cất loại dungmôi dưới áp suất giảm thu được các cặn chiết tương ứng là: cặnn-hexan (22 g),cặn ethylaxetat(15g)và cặnbutanol(18g)(sơđồ3.1).

Cặnn-hexan có hoạt tính (xem kết quả bảng 4.2 và 4.3)t i ế p t ụ c đ ư ợ c tách phân đoạn bằng sắc ký cột lặp lại trên silica gel pha thường với hệ dungmôin-hexan/axeton theo tỉ lệ 49/11/1 thu phân đoạn NH-A1 (1,5 g), NH- A2(1,3g),NH-A3(900mg).

Phân đoạn NH-A1 (1,5g) có hoạt tính (xem bảng 4.4 và 4.5) được táchchiết phân đoạn sử dụng sắc ký cột với hệ dung môin-hexan/axeton theo tỉ lệ3/1-1/1,thu được2 hợp chấtký hiệu làNH-2(150mg)vàNH-3(50 mg).

Táchc h i ế t p o l y s a c c h a r i d e ( sơ đ ồ 3 1 ) B ã n ấ m sa u k h i c h i ế t c ồ n đ ư ợ c sấy khô, bổ sung nước cất với tỉ lệ 10:1 (v/w) và trộn đều, đun 100C trong 8h, lọc thu phần dịch, lặp lại 3 lần Dịch lọc của 3 lần chiết được gộp lại và côquay chân không dưới áp suất để làm giảm thể tích, bổ sung EtOH 95 % vàodịch chiết nước với tỉ lệ 3:1

(v:v), ủ 24 tại 4C Phần cặn chứa polysaccharidethôđ ư ợ c t h u b ằ n g l y t â m v à c ặ n đ ư ợ c r ử a 2 l ầ n t r o n g e t h a n o l , l à m k h ô t h u đượccặnpolysaccharideP1(76,8g).

Lớp etyl axetat Lớp nước

Cặn BuOH (18 g) Cặn etyl axetat (15g)

Phần không tansau khi chiết nước được làm khô và hòa trong 1%ammonium oxalate, chiết tại 30 o C qua đêm Hỗn hợp được ly tâm 10.000vòng/phút,5phút.DịchnổiđượctrunghòadịchbằngNaOHvàđượcbổsu ng3 lần thể tích ethanol 95%, ủ 24 h ở 4C Ly tâm thu cặn polysaccharideP2 (50g).

Phần cặn sau khi chiết axit được sấy khô và chiết tiếp trong dịch 5%NaOH (tỉ lệ 1:10, w/v) ở 5560C trong 24 h.Dịch nổi được thu bằng ly tâm(10.000 v/p) và trung hòa bằng axit axetic 1 M, ủ 4C qua đêm, ly tâm thudịch.Bổsung3lầnthểtíchEtOH95%,ủ24hở4C.Lytâm thucặnpolysaccharideP3(221,6g).

Sơđồ 3.1:Sơđồ chiết phânđoạnmẫunấm hương

Nấm hương khô(2kg) Chiếtsiêu âmvớiEtOH95 Dịch tinh Làmlạnhở4

Silica gel CC n-hexan/axeton 49/11/1

Silica gel CC n-hexan/axeton: 3/1-1/1

Táchp o l y s a c c h a r i d e từdịch lên mennấmhương .55 3.1.3 Cách ằ n g s ố v ậ t l ý v à s ố l i ệ u p h ổ c ủ a c á c h ợ p c h ấ t đ ã p h â n l ậ p t ừ n ấ m hương55

Dịch lên mennấm hương (nuôi cấy lắc 15 ngày, 200 vòng/phút) được lytâm 5000 vòng/phút trong 5 phút để bỏ sợi nấm Phần dịch được cô tới thể tích1/10 thể tích ban đầu và được bổ sung EtOH 95% vào phần dịch (tỉ lệ 3:1, v:v),lắc đều và ủ hỗn hợp tại 4C trong 12 h tạo kết tủa Ly tâm tại 10000 vòng/phútthu cặn chứa polysaccharide thô, rửa sạch cặn bằng methanol được phân đoạnpolysaccharideP4.

3.1.3 Cáchằng số vật lý và số liệu phổ của các hợp chất đã phân lập từ nấmhương

Dạng tinh thể hình kim màu trắng.Độ nóngchảy181183 o C

Phổcộnghưởngtừhạt nhân 1 H-NMRvà 13 C-NMR(xemmục 4.1.2.1)

Kếttinh màutrắng. Độ nóng chảy167169C

Hợp chất 3 (NH2): ergosterolDạng tinh thể hình kim màu trắngĐộ nóngchảy:

Phổ cộnghưởngtừhạtnhân 1 H-NMRvà 13 C-NMR(xembảng4.7)

Tinhsạchβ-1,3/1,6 glucan (lentinan)từnấmhương (sơđồ3.3)

Phân đoạn polysaccharideP1(25,2 g) thô từ nấm hươngđược hòa tantrong 2 L nước và được làm đồng nhất tạo thành dịch có màu nâu Nhỏ từnggiọt cetyltrimethylammonium hydroxide (CTAOH) 0,2 M (pH 13,2) vào dungdịch, khuấy đều cho tới khi nhận được các sợi kết tủa trắng (tại pH 1011,5).Kết tủa được thu bằng cách ly tâm (9.000 vòng/phút trong 5 phút), rửa bằngethanol, hòa lại trong 20% axit axetic và khuấy đều trong 5 phút tại 0C 4 lầnthể tích ethanol 95% được bổ sung vào và thu nhận kết tủa Kết tủa được rửa 2lầnbằngethanolvàlàmkhô(P1-1).

PolysaccharideP1-1tiếptụcđượchòatrong50%axitaxetic,khuấyđều5 phút tại 0C, ly tâm thu kết tủa Phần kết tủa được hòa trong 6% NaOH và lytâm loại bỏ cặn Tiếp theo, bổ sung vào phần dịch 4 lần thể tích ethanol 95%.Thu kết tủa và rửa kỹ 2 lần bằng ethanol, tiếp theo rửa bằng ether (1 lần) Côquay chân không làm khô tại nhiệt độ phòng, thu bột polysaccharide Bột đượcloại bỏ protein tạp nhiễm bằng phương pháp Sevag (sử dụng chloroform vàbutanol tủa protein) Loại bỏ kết tủa protein và thu phần dịch Dịchđược bổsung 4 lần thể tích ethanol 95% tạo kết tủa Thu kết tủa, rửa bằng ethanol vàether Kết tủa được làm khôlà polysaccharide đãt i n h s ạ c h ( l e n t i n a n ) (NH-GL).Sơ đồtinhsạchđược trìnhbàyởsơ đồ3.3.

50%acetic acid Hòatan trong6% NaOH

Nghiêncứu hóahọcvàhoạttính sinhhọccủanấmhầu thủ

Phân lập cáchợp chấttừquảthểnấmhầu thủ(sơđồ3.4)

Nấm hầu thủ khô (2 kg) được tiến hành chiếtsiêu âm với ethanol ba lần.Phần dịch chiết (dùng để phân lập các hợp chất phân tử lượng nhỏ) và phần bãnấm (phần bã được sấy khô để làm nguyên liệu tách chiết polysaccharide) đượctách riêng.

Các dịch chiết ethanol được gộp lại và cất loại dung môi dưới áp suấtgiảm thu được cặn chiết ethanol (25 g) Dịch cô này được hoà tan vào 1 L nướccất sau đó được chiết lần lượt với các dung môin-hexan, ethyl axetat vàbutanol(mỗidungmôichiết3lần)vàtiếnhànhcấtloạidungmôidướiápsuất giảm thu được các cặn chiết tương ứng là: cặnn-hexan (15 g), cặn ethyl axetat(7 g)và cặnbutanol(3g) (sơđồ3.4).

Cặn chiết n-hexan (15 g) có hoạt tính (xem kết quả bảng 4.12 và 4.13)được tiến hành phân lập bằng sắc ký cột lặp lại trên silica gel pha thường, phađảo và sephadex với các hệ dung môi thích hợp (sơ đồ 3.5) thu được 2 hợp chấtHT1 (500 mg), HT2 (52 mg) Ngoài 2 chất phân lập từ phân đoạn có hoạt tínhchúng tôi còn phân lập được 4 hợp chất (HT3, HT4, HT5, HT6)t ừ c ặ n c h i ế t etylaxetat.

Bã nấm sau khi chiết cồn được sấy khô, bổ sung nước cấtvới tỉ lệ 10:1(v/ w)vàtrộnđều,đun100Ctrong8h,lọcthuphầndịch,lặplại3lần.Dịchlọc của 3 lần chiết được gộp lại và cô quay chân không dưới áp suất để làmgiảm thể tích, bổ sung EtOH 95 % vào dịch chiết nước với tỉ lệ 3:1 (v:v), ủ 24 hở4C.L y t â m t h u p h ầ n c ặ n c h ứ a p o l y s a c c h a r i d e t h ô v à c ặ n đ ư ợ c r ử a 2 l ầ n trong methanol,làmkhôthu đượccặnpolysaccharideP1(120g).

Phần không tan sau khi chiết nước được làm khô và hòa trong1%ammonium oxalate, chiết tại 30 o C qua đêm Ly tâm thu dịch, trung hòa dịchbằng NaOH Tiếp theo, bổ sung 3 lần thể tích EtOH 95%, ủ 24 h ở 4C Ly tâmthu cặnpolysaccharideP2(30 g).

Phần cặn sau khi chiết axit được sấy khô chiết tiếp trong dịch 5% NaOH(tỉ lệ 1:10, w/v) ở 5560C trong 24 h Thu lấy phần dịch, trung hòa bằng axitaxetic 1 M , ủ 4C qua đêm, ly tâm thu dịch.B ổ s u n g 3 l ầ n t h ể t í c h E t O H 95%,ủ24hở4C.LytâmthucặnpolysaccharideP3(320g).

Lớp etyl axetat Lớp nước

-Bổ sungnước -Bổsungn- hexanLớpn-hexan Lớp nước

Sơđồ 3.4:Sơđồ chiết phânđoạnmẫu nấm Hầuthủ

Silica gel CC n-hexan/axeton 9/11/1

Làm lạnh, kết tinh lại Lọc rửa nhiều lần bằng aceton lạnh Sephadex Silica gel CC n-hexan/axeton 4/1

Táchp o l y s a c c h a r i d e từdịch lênmen nấmhầu thủ

Dịch lên men nấm hầu thủ (nuôi cấy lắc 15 ngày, 200 vòng/phút) đượcly tâm 5000 vòng/phút trong 5 phút để bỏ sợi nấm Phần dịch được cô tới thểtích 1/10 thể tích ban đầu và được bổ sung EtOH 95% vào phần dịch (tỉ lệ3:1,v:v), lắc đều và ủ hỗn hợp tại 4C trong 12 h tạo kết tủa Ly tâm với tốcđộ10000vòng/phútthucặnchứapolysaccharidethô.Cặnđượcrửabằngethanol,v àlàmkhô,thuphânđoạnpolysaccharideP4.

Cáchằngsốvậtlývàsốliệuphổcủacáchợpchấtđãphânlậptừnấmhầuthủ 60 3.2.4 Tinhsạchβ-1,3/1,6 glucan từnấmhầu thủ

Hợp chất HT1: axit stearicDạng rắn, kết tinh màu trắng.Độ nóngchảy69,6C.

Phổcộnghưởngtừhạt nhân 1 H-NMRvà 13 C-NMR(xemmục4.2.2.1)

Dạngtinh thểhìnhkimmàu trắng. Độ nóng chảy181183 o C

Dạngbột màu trắng Độnóng chảy180190 o C.

Khốilượngphântử Mr7,công thứcphântửlàC41H77NO9

Phổ cộnghưởngtừhạt nhân 1 H-NMRvà 13 C-NMR(xembảng4.14)

Dạng kết tinh màu trắng.Độnóng chảy4143 o C.

Khối lượngphântử MY8,công thứcphân tửlàC37H58O6.

Phổ cộnghưởngtừhạt nhân 1 H-NMRvà 13 C-NMR(xembảng4.15)

Dạng tinh thể hình kim màu trắng.Độ nóngchảy168 o C.

Phổ cộnghưởngtừhạt nhân 1 H-NMRvà 13 C-NMR(xembảng4.16)

Hợp chất HT6: β- adenosineDạng tinh thể hình kim màu trắng.Độnóngchảy234235 o C.

Khối lượngphântử M&7,công thứcphân tửlàC10H13N5O4.

Phổ cộnghưởngtừhạt nhân 1 H-NMRvà 13 C-NMR(xembảng4.17)

Tinh sạch lần 1: 25 mL polysaccharideP3(nồng độ 4 mg/mL)từ nấmhầu thủ cho lên cột trao đổi ion DEAE cellulose (Cl  ) (cột 1,8 x 40 cm) Cácphân đoạn (5 mL) chứa polysaccharide không bám cột được đẩy bằng 3 lần thểtích

H2O Các polysaccharide axit (hấp phụ vào cột) được tách phân đoạn bằngdungdịchgradientNaCl(00.5M).Nồngđộpolysaccharide trongmỗ iphân

(14,54g) đoạn (5 mL) được xác định và các phân đoạn chứa các đỉnhpolysaccharideđược gộp lại, bổ sung 3 lần thể tích EtOH thu kết tủa polysaccharide cho bướctinh sạch lần 2.β -1,3/1,6 glucan trung tính được thu ở các phân đoạn khôngbámlêncột.

Tinh sạch lần 2: 5 mL polysaccharide (0,5%) sau tinh sạch lần 1 đưa lêncộts e p h a r o s e C L - 6 B v à d ù n g đ ệ m N a - c i t r a t e 5 0 m M p H 5 , 0 l à m p h a đ ộ n g Mỗi phân đoạn (5 mL) được thu và xác định nồng độ polysaccharide Các phânđoạn chứa từng đỉnh polysaccharide được gộp lại, làm giảm thể tích đến 1/10bằng quay cô áp suất thấp, bổ sung 3 lần thể tích ethanol tạo kết tủa,Kết tủađược làm khô chính là polysaccharide đã tinh sạch(HT-GL) Sơ đồ tinh sạchđượctrìnhbàyởsơ đồ3.6.

Thủyphânkhônghoàntoànβ-1,3-glucantừnấmhầuthủbằngenzyme -1,3- glucanase

-1,3- glucanđượchòatrongđệmNa-citrate 25mM(pH5,0) nồngđộ5mg/mL,bổ sung5%enzyme-1,3-glucanase chuẩn (1 U/mL).Hỗnhợp đượcủ

45C trong các khoảng thời gian 5, 15, 60 và 120 phút Sau phản ứng, enzymeđượcbấthoạttại100C trong thờigian15phút.

Bảng 3.1 Kết quả thủy phân không hoàn toàn β-1,3-glucan từ nấm hầu thủbằng enzym  -1,3-glucanase

*:Đườngkhử: mỗiđơn vị đườngkhử có mộtnhóm aldehyde.

4 mẫu phản ứng được trộn lại và kết tủa lần lượt trong 25, 40 và 70%ethanol (nồng độ cuối cùng), giữ ở nhiệt độ phòng qua đêm và ly tâm thuđược3 phân đoạn cặnβ-glucan Khối lượng phân tử của 3 phân đoạn được kiểm traqua cột Sephadex G-100, với 3 đỉnh polysaccharide riêng rẽ, chứng tỏ chúng cóđộ dài mạch polymer khác nhau Kí hiệu 3 phân đoạn polysaccharide là: HT-GL1, HT-GL2, HT- GL3có tỉ lệ về khối lượng tương ứng là 73:50:31 Trọnglượng phân tử của 3 phân đoạn được xác định bằng sử dụng cột lọc phân tử,dùng các dextran (hãng Sigma) chuẩn là T-10, T-40, T-70, T-500, và T2000(tương ứng

Lượng đường khử của phản ứng enzyme cũng được đo nhằm đánh giáhiệu quả thủy phân (đường khử tạo bởi nhóm aldehyde của các oligo haypolymerc ủ a g l u c a n ) T h ờ i g i a n e n z y m e p h ả n ứ n g v ớ iβ-1,3/1,6- glucanc à n g

Dịch -Glucan 5% β- glucan (5mg/ml) trong đệm Na-citrate 25mM lâu, lượng đường khử tạo thành càng nhiều, do polymer bị cắt nhỏ dần. Dungdịch DNS (3,5 dinitrosalicylic acid) được dùng để hiện mầu nhận biết gốcđườngvà cườngđộmầuđoởbướcsóng540nm(Miller, 1959) [87].

Sửdụng β-1,3/1,6-glucantừnấmhầu thủlàmchất mangcurcumin

Tạo hỗn hợp Cur-Glu: 100 mg curcumin tinh khiết được hòa vào 100 mLethanol tuyệt đối 20 mg glucan tách được từ nấm hầu thủ được hòa vào 20 mLH2O đã loại ion Hai dung dịch curcumin và glucan được trộn vào nhau

D4 D3 vàkhuấyđềutrênm á y k hu ấy từtro ng đi ều kiệnchân k hô ng t ạ i nhiệtđ ộp h ò ng trongvòng48giờ.Dungmôiđượcbayhơitừtừ ởnhiệtđộphòngtrong24giờ.

Khuấy đều tại RT, 48 giờ

PhứcCur-Glu(dịchnổi)đượcthuhồibằnglytâm.PhầnCurkhôngđượcbao(kết lắng)đượcloạibỏ.

Làm bay hơi từ từ dung môi ở nhiệtđộ trongphòngtrongthờigian 24h

Ly tâm 3 lần dung dịch Cur-Glucan, loại bỏphần Cur khôngđược baolắngxuống Đôngkhô

Sơđồ3.8.SơđồtạohỗnhợpCur-Glutừβ-1,3/1,6glucan và curcumin

Tạochếphẩmthửnghiệm

Từ phân đoạn polysaccharideP 3của nấm hầu thủ, chúng tôi tạo ra 01sản phẩm thử nghiệm ký hiệuHG1,có thành phần gồm: 35%β-1,3/1,6- glucan;0,1%làcácchấtcóhoạttínhkháctrong nấmhầu thủ; 64,9%chấtmang.

Thửdượclý chếphẩm

Nghiên cứuđộctính cấp

Thí nghiệm được tiến hành với các nhóm chuột nhắt trắng, trọng lượngtrung bình là 20 ± 2,0 g Trước khi cho chuột uống HG1, chuột được chuẩn bịtrước1 6g i ờ Chế p h ẩ m nghiên c ứ u H G 1 đ ư ợ c c h o c h u ộ t u ố n g v ớ i c á c m ứ c liều tăng dần Trong số các mức liều đem thử, khoảng cách giữa mức liều caonhất chưa gây chết một con chuột nào và mức liều thấp nhất gây chết 100% sốchuột trong nhóm được sử dụng để tính toán Sau khi cho uống HG1, chuộtđược nuôi dưỡng và theo dõi chu đáo, ăn thức ăn tổng hợp do xưởng sản xuấtthứcănđộngvậtthínghiệmcungcấp,nướcuốngadlibitum.Thờigian theodõi liêntụctrong72giờ.Số chuộtchếtđược đếmtheonhóm.

Trongđó: n: số động vật sử dụng trong từng nhóm thí nghiệmk:sốnhómđộngvật mi: số động vật chết đếm được theo từng nhóm trong 72 giờd:khoảngcáchgiữa cácmức liều xi:liềuđộMBởmứcliều cao nhất zi:hệsốphụtínhtừcôngthứczi=2k-1-2i(ilấycácgiátrịtừ1,2,3, ,k-1).

Căn cứ vào kết quả LD50dùng phép ngoại suy cho liều dùng trên độngvật, chúng tôi sử dụng cho uống chế phẩm bán trường diễn 2 mức liều thấp vàcao.

Phương pháp được mô tả bởi Abrham (1978) [13] và theo quy định củaWHO(2000)

Nghiên cứu ảnh hưởng của HG1 khi cho động vật uống bán trường diễn đối vớitrọnglượngcơthể vàkhối lượnggan,lách,thận

Dùng các nhóm chuột nhắt trắng khỏe mạnh, đủ điều kiện thí nghiệm, cótrọngl ư ợ n g t r u n g b ì n h 2 0 ± 2 , 0 g N h ó m c h ứ n g c h o u ố n g d u n g m ô i ( k h ô n g chứa HG1)0,2mL mỗi con một lần trong ngày Nhóm HG1 thử cho uống 2mức liều căn cứ vào LD50của HG1, liên tục trong 42 ngày Theo dõi bằng cácchỉ tiêu: tập tính động vật, lượng thức ăn tiêu thủ, lượng nước uống được theodõi theo từng nhóm Kết thúc đợt uống HG1, chuột được giết, phẫu tích bóctách cáctạnggan,lách,thận,đánhgiácáctổnthương đại thểbằng kínhlúp.

Khối lượng mỗi tạng được cân bằng cân phân tích Khối lượng này đượcso sánh giữa các nhóm bằng tỉ lệ so với trọng lượng cơ thể của chúng (10 gTLCTcủaCNT).Xửlýsốliệutheonghiệmphápt-

Nghiên cứu ảnh hưởng của HG1 với các chỉ tiêu huyết học của động vật thínghiệm cho uống trường diễn(Abrham,1978[13]; Turner

A.,1965[156];WHO, 2000 [169]; Bộ Y tế - Cộng hòa xã hội chủ nghĩa Việt Nam,1996;Samuel Irwin,1967)[136]

Cáclôchuộtnhắttrắngkhỏemạnh,trọnglượng20±2,0gđượcdùng cho thí nghiệm này Cho uống HG1 liều 3,0 g/kg thể trọng, liên tục trong 42ngày Trước thí nghiệm và sau khi thí nghiệm, lấy máu xét nghiệm Số lượnghồngc ầ u , l ư ợ n g h a e m o g l o b i n , s ố l ư ợ n g b ạ c h c ầ u , t i ể u c ầ u đ ư ợ c đ ị n h l ư ợ n g trên máy xét nghiệm tự động tại lab cận lâm sàng - Viện Bỏng Quốc gia -

HọcviệnQuâny.ĐánhgiáảnhhưởngcủaHG1đốivớicáctếbàomáu.Sosán h giữa các nhóm thử và nhóm chứng Xử lý theo nghiệm pháp t-Student, trước vàsaudùngHG1trongtừngnhómvà giữa cácnhómvớinhau.

Nghiên cứu ảnh hưởng của HG1 khi cho uống dài ngày đối với chức năng gan,thận qua các thông số hóa sinh(Bộ Y tế - Cộng hòa xã hội chủ nghĩa Việt

Dùng các nhóm chuột, cho uống liên tục HG1, liều 3,0 g/kg thể trọng,nhóm chứng dùng dung môi Tại các thời điểm trước và sau thí nghiệm, cácnhóm chuột được lấy máu xét nghiệm Định lượng các enzym transaminase(AST, ALT, gamma GT), định lượng creatinin để đánh giá chức năng gan, thậntheo phương pháp của Bergmeyer H.U (1986) [19] trên máy xét nghiệm tựđộng tại lab cậnlâmsàng-Viện Bỏng Quốc gia-HọcviệnQuân y.

Nghiên cứu tác dụng của HG1 đối với các biến đổi mô bệnh học ở gan,thận,láchđộngvậtthínghiệm(theophương phápcủaAbrham,1978[13]).

Các mẫu gan, thận, lách được lấy trước và sau khi cho động vật uốngHG1 bằng cách giết chuột, phẫu tích các mẫu gan, thận, lách, cố định bằngformol, đúc chuyển qua các dung dịch để loại nước, rồi đúc trong khối parafin,cắt lỏt dày 56 àm bằng mỏy Microtome Sartorius Werke Nhuộm tiờu bảnbằng phương pháp Hematoxylin - Eosin (HE) Đọc tiêu bản bằng kính hiển viquang học với độ phóng đại 100200 lần Chụp ảnh qua kính hiển vi huỳnhquangởđộphóngđại200400lần.Đánhgiácáctổnthươngtheotừngnh ómvà so sánh Xử lý số liệu thu được bằng phương pháp mô tả hình thái giải phẫubệnhlýtrênmẫu tiêubản vàtrên ảnhchụpđược từcác tiêubản trên.

NghiêncứumộtsốtácdụngcủasảnphẩmHG1trênđộngvậtthựcnghiệm

Nhóm1: Nhómchứng sinh học(không gâyđộcgan)

Nhóm 3: Dùng chế phẩm HG1 điều trị dự phòng 7 ngày liên tục liều 3,0 g/kgTLCT theo đường uống, sau đó gây độc bằng cách tiêm carbon tetrachlorid.Gâyđộc gancấpbằngtetrachlorid

Cácchỉ tiêu đánh giámứcđộ tổnthương tếbàogan vàhiệuquảđiềutrị:

Phươngph áp n g h i ê n c ứ u t á c d ụn g c ủ a H G 1 đ ế n qu át rì nh tổ ng hợ pp ro te i ntrênđộngvậtkhidùng bántrườngdiễn

Các nhóm chuột nhắt trắng nuôi trong cùng điều kiện Các nhóm nghiêncứu và nhóm chứng thức ăn tổng hợp như nhau, nhóm nghiên cứu cho uốnghàngn g à y 3 , 0 g / k g T L C T / 2 4 h c h ế p h ẩ m H G 1 s a u 6 t u ầ n d ù n g , c á c n h ó m động vật được lấy máu định lượng protein toàn phần trên máy xét nghiệm hóasinh tựđộng(WHO,2000)[169].

Tínhtoán:lượngproteintoànphầnđượcsosánhtrướcvàs a u t h ử nghiệm(ng hiệmpháptrước-sau).

Theo phương pháp của Santos và Mansour (1968) và Phạm Mạnh Hùng (1984) [138,4] Động vật thí nghiệm: CNT 68 tuần tuổi, trọng lượng 20,0g ± 2,0 g được dùngcho thínghiệmnày.

Các nhóm động vật thí nghiệm gồm: CNT được gây suy giảm miễn dịch(SGMD) thực nghiệm bằng cách chiếu xạ bằng nguồn chiếu xạ telecobalt 60( 60 Co) suất liều 7,0 Gy và được điều trị bằng chế phẩm HG1 cho uống trước đểdựphòng.

Gồmcácnhóm: Đốichứngsinhhọc(ĐCSH):CNTđượcnuôitrongđiềukiệnphòngthínghiệm(20C,1 2/12giờsáng/tối,yêntĩnh). ĐốichứngSGMD: CNTđượcgâySGMDbằngcách chiếu xạ7,0G y, sauđó khôngdùnggi,nuôinhưĐCSH.

NhómNC:được gây SGMDthựcnghiệm,chouốngHG1với2mứcliềungoại suycăn cứvào kếtquảnghiên cứuđộctính cấpvàbántrường diễn.

Tỷlệ(%) chuột sống/chếttrongvòng30 ngàykểtừsaukhichiếuxạ.

Khối lượng trung bình của tuyến ức, hạch lympho vùng nách và khốilượng của lách so với trọng lượng cơ thể (TLCT) Đánh giá sự thay đổi mô họccủatuyến ức,hạchlymphovà lách.

Sốlượngtếbàotủy,bạch cầu,coloniláchởchuộtnhắt trắng Sốlượng bạch cầu,hồng cầu,tiểucầu máungoại vi.

Phản ứng quá mẫn với kháng nguyên (KN) đặc hiệu: gây mẫn cảm chuộtnhắt bằng kháng nguyên albumin lòng trắng trứng (OVA) 4 ngày sau khi gâymẫn cảm, thử thách với kháng nguyên OVA bằng cách tiêm kháng nguyên vàodưới da gan bàn chân chuột nhắt trắng Đánh giá đáp ứng quá mẫn muộn vớikháng nguyên OVA tại các thời điểm 24 h, 48 h, 72 h và 96 h sau thời điểmtiêm.

NghiêncứuthửhiệulựckhánguthựcnghiệmtrênđộngvậtcủasảnphẩmHG2 70 CHƯƠNGIV.KẾTQUẢVÀ THẢOLUẬN

Chuộtnhắttrắngtrọnglượng2 0 , 02,0gđạttiêuchuẩnnghiêncứu. Độngv ậ t t h í n g h i ệ m đ ư ợ c n u ô i d ư ỡ n g t h e o q u y đ ị n h t r o n g p h ò n g t h í nghiệmchuyêndụngdược lý1tuầntrướckhilàmthínghiệm.

Nghiêncứu thửhiệulựckhánguthựcnghiệmcủaHG1 Đánhgiá hoạttínhtanhuyết trêntếbào ung thưcổtrướng Ehrlich

Chuẩn bị dịch tế bào hồng cầu:Thu máu từ chuột dòng CD1 (20 g): Chuộtđược gây mê bằng diethyl ether, nhanh chóng mổ ngực của chúng và lấy máubằng cách chọc nóng trong dung dịch đệm PBS 10 mM pH 7,4 lạnh (4C) -không dùng thuốc chống đông máu Hồng cầu được rửa 3 lần với PBS, dùng ítnhất 10 lần thể tích dung dịch rửa, ly tâm 5 phút ở tốc độ 1500 v/p Nồng độhồng cầu đạt mứcOD1,0 ở700nmởnhữngmẫu chưachotan huyết.

Với thử nghiệm tan huyết, 10 àL dung dịch mẫu thử nghiệm được pha với 90àL dung dịch hồng cầu 5% trờn phiến 96 giếng trong 1 giờ (37C) OD đượctheodõiliêntụcở700nm(SpecordUV-VIS). Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào in vitro trên tế bào ung thư cổ trướngEhrlich (EAC)

Dòngtếbào4NEhrlichđượcsửdụngtrongthínghiệmnày.Cáctếbàoungt hưEACđượcnuôicấytrongổbụngcủachuộtbằngphương pháptiêm vàok hoangcơthểchúng.Dòngchuột CD1đượcsửdụngtrongthínghiệmnày.

Tế bàođược thu lại sau 7 ngày nuôi cấy Chuột được gây mê với diethylethervànhanhchóngmổổbụngđểlấycáctếbàoungthư(bằngxilanh).Cáctế bào được rửa 3 lần với buffer muối (saline buffer) pH 7,4, dùng ít nhất 10 thểtíchlầndungdịchrửa,lytâm5phútởtốcđộ1000rpm;sauđótạolạidungdịc htế bàovớisalinebuffer (nồngđộ210 6 tếbào/mL).

Với thử nghiệm gõy độc tế bào, 10 àL dung dịch mẫu thử nghiệm trongDMSO được pha với 90 àL dung dịch tế bào trờn phiến 96 giếng trong 1 giờ(37C) Tổng tế bào và số tế bào sống được đếm qua kính hiển vi với thuốcnhuộmTrypanBlue0,17%.

Hoạttínhgâyđộct ế bàođượct í n h theocôngthức sau: In h i b i t i o n (% )

=A/Ao100, với Aolà tổng số tế bào khi chưa có mẫu và A là số tế bào nhuộmmàu (tức tếbàochết)cóbổsungmẫu. Đánh giá hoạt tính chống u in vivo đối với tế bào ung thưbiểu mô cổ trướngEhrlich (EAC)

Chuột đực của dòng CD1 từ 68 tuần tuổi với cân nặng 20 g được sửdụng 40 động vật thử nghiệm được dùng trong thí nghiệm này Mỗi nhóm thínghiệmgồm10độngvậtthửnghiệm.

Tế bào ung thư Ehrlich được tiêm vào khoang cơ thể của chuột với nồngđộ210 6 tếbào/mL.Chochuột dùngchếphẩmHG1bắt đầu1ngàysa ukhi cấykhốiu.Hỗnhợpphatrong1%DMSOvàdầuolivevớicácliều100,10và1 g/kg được thêm vào mỗi chuột 1 ngày 1 lần, trong 5 ngày (5 liều) Nhóm đốichứng chỉ có 1% DMSO và dầu olive Chỉ số tăng tuổi thọ (ILS, %) được tínhtheo công thức sau: ILS (T/C)100%, với T và C lần lượt là tuổi thọ trungbình (ngày) của chuộtnhómthửnghiệmvànhómđốichứng. Đánh giáhoạt tính chống u trên tế bào ung thư biểu mô cổ trướng Ehrlich(EAC)bằngMRI

Chuột BALB/c đực 68 tuần (trọng lượng khoảng 26 g) tuổi được sửdụng Tế bào Ehrlich được cấy vào chuột ở dưới xương đòn vai phải với nồngđộ510 6 tếbào/mL.Chochuộtdùngmẫuthửnghiệm1ngàysaukhicấykhối u Tác dụng chống di căn được ước tính khi sự phát triển của khối u bị kiềmhãm (so sánh với đối chứng), bắt đầu từ ngày thứ 7 sau khi thấy xuất hiện khốiu.

Sử dụng kỹ thuật MRI để ước tính khả năng kiềm hãm khối u Ehrlich saumỗi 2 ngày kể từ ngày thứ 7 sau khi cấy với tế bào ung thư (ở nhóm đối chứngvà nhóm thử nghiệm). Chuột được gây mê với xylazine (13 mg/kg trọng lượngcơ thể).

Khả năng chống u được tính bằng chỉ số kìm hãm khối u hoàn chỉnh(TGS,

Vt(mm 3 )=(axb)x1/2,vớiavàblầnlượtlàđườngkínhlớnnhấtvànhỏ nhất của khối u.Với những khối u ổ bụng, tác dụng chống u được tính bằngchỉ số tăng tuổi thọ (ILS, %), so sánh vớiđ ố i c h ứ n g t h e o c ô n g t h ứ c : I L S = (T/C) x 100%, với T và C lần lượt là tuổi thọ trung bình (ngày) của chuột nhómthửnghiệmvà nhómđốichứng.

Nghiên cứu hóahọc vàhoạttính sinhhọccủanấmhương

Tách cácphânđoạnvà đánh giáhoạt tínhsinhhọc

Quả thể nấm hương khô được chiết và tách phân đoạn như miêu tả ở sơđồ 3.1 (mục 3.1.1) Từ dịch chiết cồn đã tách được: 01 chất kết tinhNH1và

3phần chiết gồm: cặnn-hexan, cặn ethyl axetat, cặn butanol Từ bã nấm 03 phânđoạn polysaccharide (P1-NH, P2-NH, P3-NH) được tách chiết (xem sơ đồ 3.1ở mục 3.1.1) Ngoài ra, từ dịch lên mennấm hương phân đoạn polysaccharideP4-NHđượctách(xemmục 3.1.2).

Hàm lượng polysaccharide các phân đoạn tách từ nấm hương cũng đượctrìnhbàyởbảng4.1.

Nấm 100 g quả thể Dịch thể

*Lượngchất thôgiầupolysaccharidetrong100gmẫunấmkhô (hoặc1Ldịchthể)

**:Hàm lượngpolysaccharidetrong100gmẫunấm khô (hoặc1Ldịch thể)

Kết quả tại bảng 4.1 cho thấy trong dịch thể nuôi nấm, có xuất hiệnpolysaccharide với hàm lượng tương đối cao là 3,94 g/L Đây là polysaccharidedo tế bào nấm tổng hợp trong quá trình phát triển, và được cho là sản phẩm thứcấp Ở phân đoạn chiết nước nóng, hàm lượng polysaccharide là 3,01g Đa sốcácpolysaccharidehòatanđượcchiếttrongphânđoạnnày.Ngoàipolysaccharide, các protein cũng chiếm một lượng đáng kể, có thể lên tới4050% tổng các chất. Trong nghiên cứu của chúng tôi, phần polysaccharidetrong dịch chiết kiềm chiếm hàm lượng lớn nhất (9,5%) Các polysaccharidechiếtkiềmthườngởdạngkhótantrongnước (hoặc tanhạnchế).

Tấtcảcácphânđoạnchiếttáchcủanấmhươngđượcđánhgiáhoạttínhgây độc tế bào và kháng u trên thạch Kết quả được thể hiện ở bảng 4.2 và 4.3 Bảng4.2.Hoạt tính gây độc tếbàocáccặnchiết của nấmhương

Bảng 4.3 Kết quả thử nghiệm hoạt tính ức chế tạo u trên thạch mềm của cácphânđoạnpolysaccharide

Kích thước trung bình của khốiu Độgiảmmậtđ ộ khối u sovới đốichứng(% Đườngkớnh(àm) % giảm so ) vớiđốichứng Đốichứng âm

Kết quả tạibảng 4.2 và 4.3 cho thấy mẫu NH-hexan và P1- NH có hoạttính gây độctế bàotrên 2dòng tế bàoungthư gan( H e p - G 2 ) v à u n g t h ư m ô liên kết (RD) Hơn nữa cả 2 mẫu đó đều biểu hiện hoạt tính ức chế sự hìnhthànhkhốiutrênthạchvớimậtđộhìnhthànhkhốiugiảmtươngứnglà58,56 và 54,09%, kích thước trung bình của khối u giảm tương ứng là 52,01 và35,36%s o vớiđốichứng.

Theo một số công bố trước đây thì đa số các-1,3/1,6-glucan được biết làchất ức chế tế bào ung thư thông qua cơ thể chủ( t ă n g s i n h t ế b à o m i ễ n d ị c h , sản xuất kháng thể) mà rất ít gây độc trực tiếp lên tế bào ung thư (in vitro).Israilides & cs (2008) [61] cho thấy hoạt tính ức chế tế bào ung thư biểu mô vúở người (IC5073g mL 1 ) của cặn chiết polysaccharide bằng nước tại nhiệt độphòng Rincao và cs (2012) [134] nghiên cứu tính ức chế vi rút (PV1 vàBoHV-

1)củapolysaccharidevàcặnchiếtethanolnấmhươngchothấypolysaccharide có hoạt lực ức chế virus rất tốt so với cặn chiết ethanol, với giátrị IC50tương ứng với PV1 và BoHV-1 là 0,19 và 0,1g mL 1 , so với cặnethanol là 1,3 và 2,1g mL  1 Rincao (2012) cho rằng khả năng kháng vi rútchủ yếunhờ các polysaccharide[134].

Chúng tôi lựa chọn ra 2 phân đoạnn-hexan và P1-NH từ nấm hương đểphântách tiếptheo sựdẫnđường củaphépthửhoạt tính chống ungthư.

Phân đoạnn-hexan được tách thành 3 phân đoạn nhỏ NH-A1, NH- A2,NH-A3 Kết quả đánh giá hoạt tính chống ung thư thông qua thử nghiệm gâyđộc tế bào và ức chế tạo u trên thạch của các phân đoạn được trình bày trênbảng4.4và 4.5.

Bảng 4.5 Kết quả thử nghiệm hoạt tính ức chế tạo u trên thạch mềm của cácphân đoạn

Kích thước trung bình của khốiu Độgiảmmậtđ ộ khối u sovới đốichứng(% Đườngkớnh (àm) % giảm so ) vớiđốichứng Đốichứng âm

Kết quả bảng 4.4 và 4.5 cho thấy phân đoạn NH-A1 biểu hiện hoạt tínhgây độc tế bào và ức chế sự hình thành khối u trên thạch Phân đoạn NH- A1đượctiếptụclựa chọnđểnghiêncứuthànhphầnhóahọc.

Từ phân đoạn NH-A1, sắc ký cột với hệ dung môi n-hexan/axeton theo tỉlệ 3/1-1/1, thu được 2 hợp chất ký hiệu làNH-2(150 mg) vàNH-3(50 mg) (sơđồ3.2).

Từ phân đoạn polysaccharide P1-NH được tiếp tục tinh sạch qua 2 cộtDEAEcellulose(Cl-)vàSapharoseCL6Bđượcsảnphẩmchứaβ -1,3/1,6glucan(GL-NH) (xemmục 3.1.4)

Xácđịnh cấutrúc cáchợpchấtNH1,NH2vàNH3

Phổ proton cho thấy hợp chất này có 8 proton trong đó 3 proton tại các vịtrí δH: 4,40; 4,35 và 4,14 ppm Tín hiệu của các proton tại 4,40 và 4,13 ppm ởdạng doublet với hằng số tương tácJlần lượt là 5,0 và 7,5 Hz, chứng tỏ cácnhóm OH này gắn với nhóm – CH -, tín hiệu của proton xuất hiện tại 4,33 ppmở dạng triplet vớiJ = 5,5 Hz, chứng tỏ nhóm OH chứa proton này gắn vớinhóm – CH2- Còn lại 4 proton khác là các proton thuộc các nhóm: 2 nhóm - CH-và mộtnhóm-CH2-.

Sự phán đoán này càng có cơ sở khi xem xét phổ DEPT phổ 13 C-NMRcủa hợp chất NH1 Trên phổ 13 C-NMR của hợp chất này chỉ có duy nhất 3 tínhiệu carbon, trong đó có hai nhóm – CH - lần lượt có δCở 71,5 và 69,8 ppm.TínhiệucủanguyêntửcarboncònlạitạiδC:63,9ppmlàcủanhóm– CH2-.

Hình4.2.Phổ 13 C-NMR vàcácphổ DEPTcủaNH1

Cácdữliệutrênc h ứ n g tỏhợpc hấ t N H 1 códạng– CHOH–CHOH-

CH2OHvà cácphổCOSYvà HMBCcũngxácnhậnđiều này.

Tuy vậy sự lắp ghép vẫn không đủ hợp lý để đưa ra công thức của chấtcần tìm Điềunày gợi ýcho ta biết có khản ă n g p h â n t ử c ủ a c h ấ t t r ê n c ó t r ụ c đối xứng và các phổ trên chỉ phản ánh một nửa phân tử của nó và cấu trúc củahợp chất trên phải là CH2OH – CHOH – CHOH – CHOH – CHOH - CH2OHhaychínhlà galactiol.

Kết quả đo phổ ESI-MS cho thấy hợp chất này có xuất hiện một đỉnh iontạim/z182,M2 phùhợpvớicôngthức trên(Volpon,2006)[160].

Hình4.7.Phổ 13 C-NMRcủahợp chất NH2

Phổ 13 C-NMR của NH2 xuất hiện các tín hiệu đặc trưng của một steroitcó

28 carbon gồm 11 nhóm metin, 7 nhóm metylen, 6 nhóm metyl và 4 nhómcarbon bậc 4 (phổ DEPT) Trong số 11 nhóm metin có mặt trong phân tử chỉ cómột nhóm metin thuộc kiểu hydroxymetin được đặc trưng bởiδC: 70,5 ppm.Ngoài ra, tín hiệu của 4 nguyên tử carbon của 4 nhóm metin xuất hiện ở vùngtrường thấp có δClần lượt ở1 3 5 , 6 0 ; 1 3 2 , 0 ; 1 1 9 , 6 0 v à 1 1 6 , 3 0 p p m , c h ứ n g t ỏ đây là các nhóm metin thuộc các liên kết đôi và theo như suy luận là của 2 liênkết đôi biệt lập Tuy nhiên sự có mặt của 2 nghuyên tử carbon bậc 4 ở vùngtrường thấp có δClần lượt là 141,36 và 139,80 ppm, chứng tỏ đây là các nguyêntử carbon bậc 4 thuộc nối đôi Như vậy hợp chất NH2 có 3 nối đôi, trong đó2nốiđôichứanhómcarbonbậc4.

Trên phổ 1 H-NMR của hợp chất NH2 xuất hiện các tín hiệu của hai nhómmetyl ở dạng singlet tạiH: 0,94 và 0,63ppm là các nhóm metyl gắn với cácnguyênt ử c a r b o n b ậ c 4 C H3(19)v à C H3(18).H a i n h ó m m e t y l c ó t í n h i ệ u ở dạng doublet cóJ= 6,5 vàJ= 7 Hz xuất hiện lần lượt tạiH: 1,04 và 0,92 ppmđược quy cho CH3(21) và CH3(28) 2 nhóm metyl còn lại xuất hiện ở dạngtripletJ

=7,5 Hz là của nhóm isopropyl mạch ngoài CH3(26,27) Ở vùngtrường thấp hơn, 2 proton olefinic H-22 và H-23 cộng hưởng tại các vị trí cóHlần lượt là 5,23 ppm (dd,J 1 =7 Hz;J 2= 15 Hz) và 5,17 ppm (dd,J 1 =8,5 Hz;J 2= 15 HZ) Cấu hình trans của 2 protonnày cũng dễ nhận ra nhờ hiệu ứng máinhà Các proton olefinic của H-6, H-7 xuất hiện tại các vị trí cóHlần lượt là5,75và 5,38 ppm.

Cuốicùngprotoncủa nhóm metingắnvới OH ởv ị t r í

3 cộnghưởngở3,63ppm,dựavàodạngphântáchtínhiệuvàhằngsốtươngtácJcóthể kếtluậnnhóm–OHởvịtrí3cócấuhìnhβ.

Từ tất cả các phân tích đã nêu, giá trị phổ 13 C-NMR của hợp chất NH2được mang so sánh với các giá trị đã được công bố của ergosterol(Yusoo,2001) [182] Sự phù hợp hoàn toàn ở tất cả các vị trí tương ứng cho phép khẳngđịnh hợpchấtNH2 chínhlà ergosterol.

Bảng4.6.Kếtquả phổ 13 C - NMRcủa NH2

Hình4.10.Cấutrúchóa họccủaNH2 4.1.2.3 HợpchấtNH3:Ergosterolperoxide

Hợp chất NH3 có dạng tinh thể hình kim màu trắng, Tnc 181-183 o C, phổkhối lượngESI-MS:m/z429,2 [M +H] +

Phổ 1 H và 13 C-NMR của hợp chất NH3 tương tự như của hợp chấtNH2ngoạitrừsựmấtđi2tínhiệucarboncủanốiđôivàthayvàođólàsựxuấthiện2 tín hiệu của các carbon bậc bốn liên kết trực tiếp với nguyên tử ôxy ở vùngtrường thấp tại79,44 (s) và 82,17(s) Điều này gợi ý tới sự xuất hiện của mộtcầuperoxide và NH3được xemlàmộtdạng dẫnxuấtcủaNH2.

Trên phổ 1 H-NMR của hợp chất NH3 cho thấy những nối đôi biệt lập củahợp chất này Các tín hiệu ởH: 6,22 (J= 8,5 Hz) và 6,43 (J= 8,5 Hz) chophép ta khẳng định nối đôi thuộc vòng (có độ bội tín hiệu và hằng sốJhoàntoànp h ù h ợ p ) g ắ n v ớ i c á c n g u y ê n t ử c a r b o n b ậ c 4 N ố i đ ô i c ò n l ạ i ở n g o à i vòng được đặc trưng bởi hai cụm tín hiệu ởH: 5,23 (dd,J 1 = 7,5 Hz,J 2 = 15Hz) và 5,16 ppm (dd,J 1 = 8,5 Hz,J 2 = 15 Hz) Dựa vào kiểu phân tách tín hiệuvà hằng số tương tácJcho phép ta kết luận hai proton của nối đôi này có cấuhìnhtransvới dạng tín hiệu là hiệu ứng mái nhà đặc trưng Các tín hiệu ở0,76;0,80(3CH3),0,89và0,97đượcquichoH-27,H-18,H-19,H-26,H-28,H-21.Tínhiệu quan sátđượcrõràngtạiH: 3,57ppmđượcquichoproton H-3.

Bảng4.7.Số liệuphổ NMRcủahợpchấtNH3vàhợpchất thamkhảo

28 17.56 17,26 CH3 0.89d(6.5) a đotrongMeOD, b 125MHz, c 500MHz, d đotrongD MS O -d 6 , e 100MHz, f 300MHz

#Sốliệuphổtheochất5  ,8  -Epidioxyergosta-6,22-dien-3  -olt à i liệusố(Yue &cs.,2001)[181]

SosánhdữliệuphổcủaNH3vớidữliệuphổcủachất5,8-Epidioxyergosta- 6,22-diene- 3-ol(Ergosterol peroxide)cho thấy chất NH3 làergosterolperoxide. Theo các tài liệu đã công bố, hợp chất này thể hiện hoạt tính khángE. colivàSalmonella typhimurium(với giỏ trị IC50tương ứng là 350 và 500 àg/ml) (Jannet, 2006) [63], chống dị ứng (Lindequist, 2005) [100] Ngoài ra hợp chấtnàycònthểhiệnhoạttínhgâyđộctếbàođốivớicácdòngtếbàoungthưdạ dày (SNU-1),ungthư gan(SNU-354), ungthư trựct r à n g v à s a r c o m a -

1 8 0 chuột với giỏ trị IC50tương ứng là 18,7, 158,2, 84,6 và 74,1 àg/ml (Nam

Hình4.14.Cấutrúchóa học của NH3

Polysaccharide tách từ phân đoạn P2-NH của nấm hương được tinh sạchnhư mô tả ở phần thực nghiệm (mục 3.1.4) Sau khi tinh sạch, polysaccharideđượcchạyphổ 13 C-

Kết quả phổ cho thấy, có 9 tín hiệu nguyên tử C chính Tín hiệu tạiC2,94chỉranguyêntửC1;tínhiệuC,145chỉranguyêntửC3;tínhiệu

C= 76,724 chỉ ra C3; tín hiệuC= 74, 813 chỉ ra C2; tín hiệuC=tín hiệu70,567 chỉ ra C6s (thaythế)và tín hiệuC= 61,199 chỉraC6.

Phổ 13 C-NMR của polysaccharide chúng tôi tinh sạch được so sánh vớiphổ 1 3 C-NMRc ủ a l e n t i n a n n ấ m h ư ơ n g ( W a n g v à c s , 2 0 0 8 )

#Số liệuphổ củalentinan từnấmhương (Wangvà cs.,2008)[139]

Qua phân tích dữ liệu phổ và sử dụng enzymeβ-1,3 glucanase đặc hiệu(Sigma) để nhận biết, sản phẩm thu được chủ yếu làβ-1,3/1,6 glucan, nhưng cóthể độ phân nhánh khác vớiβ-1,3 glucan do Wang và cs phân lập được.Đểphântích mứcđộphân nhánh (DB),cần cócác nghiên cứusâu hơn.

Đánhgiáhoạt tính sinhhọccủa cáchợp chấtphânlập từnấmhương

Các hợp chất phân lập được đánh giá hoạt tính gây độc tế bào và kháng utrên thạch mềm.Kếtquảđượctrình bàytại bảng 4.9,4.10vàhình4.16.

Bảng4.9.Hoạttínhgâyđộctếbào của cáchợp chấtphânlậptừnấmhương

Kết quả cho thấy, hợp chấtN H 3biểu hiện hoạt tính độc tế bào cả4 dòng tế bào thử (ung thư gan - Hep G2, ung thư tử cung - Fl, ung thư mô liênkết-

RD, ung thư phổi - Lu) với giá trị IC50lần lượt là 3,84; 4,17; 7,61,và9,21g/mL.Theo công bố của tác giả Nam và cs (2001) [120], hợp chất nàycòn thể hiện hoạt tính gây độc tế bào đối với các dòng tế bào ung thư dạ dày(SNU-1), ung thư gan (SNU-354), ung thư trực tràng và sarcoma-180 chuột vớigiỏtrịIC50tươngứnglà 18,7;158,2; 84,6và74,1àM.

Bảng4.10.Kết quảthửnghiệmhoạttínhứcchếtạoutếbàoungthưganHep-G2 trênthạchmềmcủa các hợpchất

Kíchthước trungbìnhcủa khối u Độgiảmmậtđ ộkhốiu (%) Đườngkính (àm)

Hình4.16.Ức chếpháttriểnkhốiutếbào Hep-G2 bởi cácchấtphânlập

Kết quả tại bảng 4.10 và hình 4.16 cho thấy hợp chất NH3 và GL-NH ứcchếs ự h ì n h t h à n h k h ố i u H ợ p c h ấ t N H 3 ứ c c h ế r õ r ệ t h ơ n c ả , m ậ t đ ộ h ì n h thành khối u giảm 58,33% và kích thước trung bình của khối u giảm5 5 , 1 8 % sovớiđốichứng.

Nghiêncứu hóahọcvàhoạttính sinhhọccủanấmhầu thủ

Táchphân đoạn vàđánhgiáhoạttínhchốngungthư

Quả thể nấm hầu thủ khô được chiết và tách phân đoạn như miêu tả ở sơđồ 3.4 (mục 3.2.1) Từ dịch chiết ethanol, chúng tôi đã tách được 3 phần chiết(cặn n-hexan, cặn etyl axetat, cặn butanol) Từ bã nấm chiết tách được 03 phânđoạn polysaccharide (P1-HT, P2-HT, P3-HT) Ngoài ra, từ dịch lên men nấmhầu thủtách đượcphân đoạn polysaccharideP4-HT(xemmục 3.2.2).

Cácphânđoạnpolysaccharidethôcũngđượcxácđịnhhàmlượngpolysacchari de.Kếtquả được trìnhbàyởbảng4.11.

Bảng 4.11 Hàm lượng polysaccharide trong các phân đoạn tách chiết nấmhầuthủvànấmhương

*:Lượngchấtthôgiầupolysaccharide trong100gmẫu nấmkhô (hoặc1Ldịchthể)

**: lượngpolysaccharidetrong100gmẫu nấm khô (hoặc1Ldịch thể)

Kết quả bảng 4.11 cho thấy trong dịch thể nuôi cấy nấm, có xuất hiệnpolysaccharidev ớ i h à m l ư ợ n g l à 1 , 5 2 g / L Đ â y l à p o l y s a c c h a r i d e d o t ế b à o nấm tổng hợp trong quá trình phát triển, và được cho là sản phẩm thứ cấp Ởphân đoạn chiết nước nóng, hàm lượng polysaccharide là 2,5 g/100 g nấm khô.Đa số các polysaccharide hòa tan được chiết trong phân đoạn này Ngoàipolysaccharide,các protein cũng chiếm mộtlượng đáng kể, có thể lên tới4050%tổngcácchất.Trongnghiêncứucủachúngtôi,phầnpolysaccha ride trong dịch chiết kiềm cũng giống như ở nấm hương chiếm hàm lượng lớn nhất(12,1 g) Các polysaccharide chiết kiềm thường ở dạng khó tan trong nước(hoặctanhạn chế) hoặcliênkết với chấtchitin,mannan,cellulosekhông tan.

Tất cả các phân đoạn đó được đánh giá hoạt tính gây độc tế bào và khángu trênthạch.Kếtquảđược thểhiệntạibảng 4.12và4.13.

Bảng 4.12 Hoạt tính gây độc tế bào cácp h â n đ o ạ n c h i ế t t á c h t ừ n ấ m h ầ u thủ

Kết quả tại bảng 4.12 cho thấy, cặn chiết n-hexan của nấm hầu thủ biểuhiện hoạt tính gây độc với 2 dòng tế bào ung thư gan (Hep-G2) và ung thư môliênkết (RD).

Bảng4.13.Hoạt tínhkháng utrênthạchcủa cáccặnchiếtnấm hầuthủ

Kíchthướctrung bìnhcủa khối u Độgiảmmậtđ ộ khối u sovới đốichứng(% Đườngkớnh(àm) % giảm so ) vớiđốichứng Đốichứng âm

Bảng 4.13 cho thấy cặnn-hexan và polysaccharide P3-HT biểu hiện khảnăng ức chế sự hình thành khối u với mật độ hình thành khối u giảm tương ứnglà 47,93 và 30,35% và kích thước trung bình của khối u giảm tương ứng là44,49và33,63%sovớiđốichứng.

Cặn chiếtn-hexan được tiến hành phân lập bằng sắc ký cột lặp lại trênsilica gel pha thường và sephadex với các hệ dung môi thích hợp( s ơ đ ồ

Từ phân đoạn P3-HT tiến hành tinh chế theo sơ đồ 3.6 thu nhận được β-1,3/1,6 glucantinh sạch(GL-HT) (xemmục 3.2.4).

Xácđịnh cấutrúccáchợp chấtphânlậptừnấmhầu thủ

Hợp chất HT1 thu được ở dạng rắn, tinh thể màu trắng có nhiệt độ nóngchảy69,6C.

Phổ 1 H-NMRcủahợpchấtHT1chothấyphântửnàycótínhiệucủa1 protonxuấthiệntrongvùngcủaaxitcacboxylic(H:11,91ppm)vớidạngpic tù.CácprotonkháccủahợpchấtHT1đềucótínhiệunằm trongvùngtừ0,83-2,18 ppm,vùng trường cao nàythuộcvềcácproton củacácnhómankyl.

Phổ proton của hợp chất HT1 cũng cho thấy hợp chất này không bị phânnhánh, chỉ có 1 nhóm - CH3duy nhất ở đầu mạch với tín hiệu là một triplet (J=6,5 Hz) 2 proton tương đương của các nhómα-metylen vàβ-metylen xuất hiệnở vùng trường thấp lần lượt là 2,18 và 1,47 ppm do hiệu ứng hút điện tử củanhóm – COOH Một Singlet với cường độ tích phân lớn tạiH: 1,23 ppm là cácnhóm – CH2– còn lại trong phân tử HT1 Như vậy HT1 là một axit no mạchthẳng vàkhôngphânnhánh.

Phổ 13 C-NMR của hợp chất HT1 cũng cho thấy phán đoán trên là hoàntoàn có cơ sở Tín hiệu cộng hưởng của carbon trong nhóm – COOH (C- 18)xuất hiện tạiC: 174,4 ppm Hai nguyên tử carbon trong các nhómα- metylen(C-2) vàβ-metylen (C-3) của hợp chất HT1 xuất hiện lần lượt tại 33,7 và 31,3ppm Một số các bon của các nhóm metylen (- CH2-)t ư ơ n g đ ư ơ n g v ề t ừ t ạ o nên 1 tín hiệu cộng hưởng lớn tạiC: 29,1 ppm 5 nhóm – CH2– nằm xa hơn sovớin h ó m –C O O H v à n h ó m –

Vị trí tín hiệu và cường độ tích phân của các tín hiệu trong các phổ 1 H- NMR và 13 C-NMRcho phép ta khẳng định đây là một axit béo, no, mạch dài,khôngphânnhánhcócông thứcdựkiếnlàCnH2n+1COOH.

Kết quả đo phổ ESI-MS của chất này cho thấy hợp chất này có M-H = 283 vàM(4.Vậyn = 17.Vậyhợpchấtphânlậpđược là axitstearic.

Hình4.20.Cấutrúchóahọccủa hợp chấtHT1 4.2.2.2 HợpchấtHT2:Ergosterolperoxide

Hợp chất HT2 thu được ở dạng tinh thể màu trắng, có điểm nóng chảy178-180 0 C.[] 0 D-29(CHCl3,c.0.8).Dữliệuphổcủahợpchấtnhưsau:

Phổ 13 C NMR của hợp chất HT2 cho thấy chất này có 28 nguyên tửcarbon Trong đó có 11 nhóm metin, 7 nhóm metylen, 6 nhóm metyl và 4nguyên tử carbon bậc 4 Trong số 11 nhóm metin có mặt trong phân tử chỉ cómột nhóm hydroxymetyl được đặc trưng bởiδC: 64,5 ppm Ngoài ra, 4 nhómmetin xuất hiện ở vùng trường thấp có δCtừ 130,0135,5 ppm thuộc hai nối đôibiệt lập bao gồm một nối đôi ngoài vòng và một nối đôi trong vòng Đặc biệt 2nguyêntử carbon bậc 4cóđộchuyểndịch hóa học lần lượt là 78,3v à 8 1 , 4 ppm,gợi ýcho tavềmột cầuperoxidenốivới hai nguyên tửcarbon này.

Từ các dữ liệu phổ 1 3 C NMR và phổ khối của HT2 chúng ta có thể dựđoán công thức của HT2 là C28H44O3và có cấu trúc bộ khung giống như bộkhung của cholesterol vớimột cầuperoxide.

Các dữ liệu phổ 1 H và 13 C-NMR của hợp chất HT2 giống hệt với hợp chấtNH3, sự trùng khớp hoàn toàn tại các giá trị tươngứ n g c h o p h é p k h ẳ n g đ ị n h cấu trúc hóa học của HT2 là 5α,8α-epidioxyergosta-6,22- dien-3β-ol (egosterolperoxide).

Cấu trúchóahọc củaHT2 được thểhiệntrênhình4.24.

Ngoài 2 hợp chất (HT1 và HT2) phân lập được từ dịch chiết n-hexan cóhoạt tính, chúng tôi còn phân lập được 04 hợp chất khác từ phân đoạn etylaxetat.Cấutrúchóa họccủa cáchợpchấtđócũngđượcxácđịnhnhưsau:

Hợp chất HT3 là chất bột màu trắng, điểm chảy 180-190 o C, phổ khốilượng ESI-MS:m/z726,6 [M-H] + ,m/z750,5 [M+Na] + ,m/z728,3 [M+H] + ,m/ z710,5[M-H2O+H] + ,m/z548,3[M-glucose+H] + (M r7).

Trênphổ 1 H-NMRxuấthiệncáctínhiệuđặctrưngcủamộtglycosphingolipid với 3 nhóm metyl tạiH0,92 (6H, t,J= 7.0 Hz) và 1,62 (3H,s), tín hiệu bị che lấp của hai mạch hydrocarbon no dài tạiH1,31 (44H, brs),một proton gắnvớicarbon anometạiH4,29 (1H,d,J=7,5Hz).

137,18,135,04,131,51và125,22;2carbongắnvớiôxytạiC73,49và73,29.Thêmvàođ ó,6tínhiệucủamộtphân tử đườngβ-D-glucopyranosidexuấthiện tạiC105,13(C-1”),78,38(C-5”),78,31(C-3”),75,39(C-2”),71,97(C-4”)và 63,08(C6”).

Trên phổ HMBC xuất hiện tương tác của píc proton anome tại H4,29(1H,d,J=7,5Hz)vớicarbonmetylenởC70,13(C-

1).TínhiệusinglettạivịtríH1,62 cho phép khẳng định có một nhóm metyl phải được gắn vào mộttrong 2 liên kết đôi Cấu hìnhtranscủa nối đôi ở vị trí 4-5 được xác định bởihằng số tương tác vicinal lớn (J 4-5= 11.5 Hz) Theo các tài liệu đã công bố(Wang & cs., 2000; Tan & Chen, 2003) [165, 154], các cerebroside từ nấmthườngchứa:đườngglucose,bazơsphingoidlà(4E,8E)-9- methyl-4,8-sphingadienine và axit béo chứa nhóm hydroxyl tại vị trí carbon số

2 với độ dàimạch từ 14-18 carbon hay từ 22-26 carbon Các phân tích chi tiết phổ 1 H-, 13 C-NMR, Dept và các tương tác trên phổ HMBC (bảng 3.5) khẳng định sự có mặtcủađườngglucose,bazơsphingoidlà(4E,8E)-9-methyl-4,8- sphingadieninevà axitbéochứanhómhydroxyltạivịtrícarbonsố2.

*số liệu NMR của cerebroside B, # số liệu NMR của catacerebroside A, a đo trong piridin-d 5 , b đo trongMeOD-d 4 , c 125 MHz, d 500MHz

NMRcủaHT3đượcsosánhtrựctiếpvớicácsốliệuđãđượccôngbốcủahợpchấtc erebrosideB(Kang&cs.,2004)[65]vàcho thấysự trungkhớp.Tuynhiênởmộtvàivịtrícósự khácbiệtđ á n g k ể , đ ặ c b i ệ t ở v ị tr í C -

5 đ ã t h a y đổ i g ầ n 2 p p m từC1 3 5 , 0 4 sa n g 132,3.Tuynhiênđiềunàycóthểđượcgi ảithíchlàdosựthayđổidungmôiđophổ từmetanolsangpiridin.Để khẳngđịnhđiều nàysố liệu 13 C-NMR của HT3ượcso sánh lại với mộthợp chất cócấu trúc tương tự vàcũng được đotrongdungmôimetanolthìchothấysựtrùngkhớphoàntoàn( Z h a n &Yue, 2003)

[183].CùngvớikhốilượngphântửcủaHT3làMr7đãđượcxácđịnhbằngphổkhốilư ợng(Hình3.10),cấutrúccủanóđượcxácđịnhlà1-O-β-D-glucopyranosyl-(2S,3R,4E,8E)- 2-[(2R)-2-hydroxyhexadecanoylami-no]-9-methyl-4,8-octadecadiene-1,3- diolđượcgọitênlàcerebrosideB.HợpchấtnàyđãđượcphânlậptừcácloàiPachyb asiumsp.,Clitocybesp.vàSchizophyllumcommune Chấtnàykíchthíchsựbiệt hóatếbào,tăngcườngsựhìnhthànhquảthể ở nấmvà cóhoạttínhkhángmộtsố chủngnấm.

Hình4.30.Cấutrúchóa học củaHT3 4.2.2.4 HợpchấtHT4-HericenoneD

Chất kếttinh màu trắng,điểmchảy41-43 o C,phổ khốilượng ESI-MS: m/z599,2[M+H] + ,m/z597,4 [M -H] - (C37H58O6,MY8)

Trên phổ 1 H-NMR của HT4 xuất hiện các tín hiệu đặc trưng của 1 protonvòng thơm tạiH6,53 (1H, s), một proton của nhóm hydroxyl, một nhómformyl và một nhóm metoxi đều gắn vào vòng thơm tạiH12,37 (1H, s), 10,11(1H, s) và 3,92 (3H, s), hai tín hiệu của 2 liên kết đôi đều bị thế ba vị trí tạiH5,32 (1H, d,J= 7,5Hz) và 6,09 (1H, t,J= 1,5Hz), 3 nhóm metyl tạiH0,88(3H, m), 1,84 (3H, d,J= 1,5Hz) và 2,12 (3H, d,J= 1,0Hz) và các tín hiệu bịchelấpcủamạchhydrocarbonno dàitạiH1,25(26H,m).

Trên phổ 13 C- NMR và các phổ DEPT xuất hiện các tín hiệu đặc trưng củamột vòng thơm tạiC105,55, 112,91, 117,33, 138,70, 162,94 và 163,49; mộtnhóm formyl tạiC193,10; một nhóm metoxy tạiC55,93, hai liên kết đôi đềuthế3tạiC126,27(CH),122,85(CH),130,35(C)và155,42(C);mộtcarb on carbonyltạiC199,54,mộtcarboncacboxylattạiC173,20;3nhómmetyltại

Hình4.34.PhổHSQCcủa HT4 Để xác định chính xác định độ dịch chuyển hoá học tương ứng của carbonvà proton, phổ HSQC đã được đo và các giá trị của chúng được đưa ra chi tiếttrên bảng4.15.

*sốliệu NMR củahericenone D, a đotrongCDCl 3 , b 125MHz, c 500 MHz

1" 3" Để xác định các vị trí nhóm thế và kiểm tra các giá trịđ ộ d ị c h c h u y ể n hoá học của các vị trí, phổ HMBC đã được đo Trên phổ HMBC, nhóm OHđược khẳng định tại vị trí C-3 bởi tương tác HMBC của H (OH,12,37) với C-2 (112,91), C-3 (162,94) và C-4 (117,33), nhóm metoxy ở vị trí C-5 bởitương tác của protonH-9 (3,91) vớiC-5(163,49).

Bằng các phân tích tương tự cho phép khâu nối các giá trị phổ, dự đoáncấutrúc hóa học củaHT4 nhưđược chỉraởhình 4.36.

Các kết quả phân tích nêu trên được đem so sánh với các dữ kiện phổcủa hợp chất hericenoneD(Kawagishi vàc s , 1 9 9 2 ) [ 7 1 ] v à s ự t r ù n g k h ớ p hoàn toàn về các giá trị phổ tương ứng kết hợp với các dữ kiện phổ khối lượngcho phép khẳng định hợp chất HT4 là hericenone D Hợp chất này đã được tìmthấy trước đó từ nấm hầu thủ và thể hiện hoạt tính kích thích mạnh sự tổng hợpnhân tố kích thích sự phát triển của tế bào thần kinh (Kawagishi và cs., 1991;Kawagishi vàcs.,1992) [71].

HợpchấtHT5códạngtinhthểhìnhkimmàutrắng,điểmchảy168 o C.Cácdữliệ uphổ 1 Hvà 13 C-NMRcủahợpchấtHT5giốnghệtvớihợpchất

NH2,sựtrùngkhớphoàntoàntạicácgiátrịtươngứngchophépkhẳngđịnhcấut rúc hóa học củaHT5là egosterol.

Hình4.39.Phổ 13 C-NMRvàcácphổ DEPTcủa HT5

Hình4.40.Cấutrúchóa học củaHT5 4.2.2.6 HợpchấtHT6-β-Adenosine

Hợp chất HT6 nhận được dưới dạng tinh thể hình kim màu trắng. Côngthức phân tử của nó được xác định là C10H13N5O4dựa trên kết quả phổ khốilượng ESI-MS (tại m/z 267,8[M+H] + và289,8 [M+Na] + ).

Trên phổ 1 H-NMR của HT6 xuất hiện các tín hiệu đặc trưng của một đơnvị đường β -D-Ribofuranosyl tại δ 5,88 (d,J =6,5 Hz, H-1’), 4,61 (dd,J =4,0và

10,5Hz, H-2’), 4,15( b r s , H - 3 ’ ) , 3 , 9 7 ( d d ,J = 3,5 và 6,5 Hz, H- 4’), 3,57(m,Ha-5’) và 3,68(m,Hb-5’).

Hình4.43.Phổ 13 C-NMRvàcácphổ DEPTcủa HT6

Trên phổ 13 C-NMR xuất hiện các tín hiệu của 10 carbon với 3 C, 6 CH vàmột1 CH2 Trong đó, các tín hiệu của 1 đơn vị đường β-D-ribofuranosyl đượckhẳng định tại87,95 (C-1), 73,47 (C-2), 70,68 (C-3), 85,92 (C-4) và 61,69(C-5)(Krugh,T.R.,1973).

Đánh giáhoạt tính sinhhọccủacáchợp chấtphânlậptừnấmhầu thủ

Các hợp chất phân lập từ nấm hầu thủ được đánh giá hoạt tính gây độc tếbào và khả năng ức chế hình thành khối uin vitro Kết quả được trình bày ởbảng4.18,4.19vàhình4.48.

Kết quả cho thấy, hợp chấtHT2biểu hiện hoạt tính độc tế bào cả 4 dòngtế bào thử (ung thư gan-Hep G2, ung thư tử cung, ung thư mô liên kết-RD,ungthưphổi-Lu)vớigiátrịIC50lầnlượtlà 4,82;5,13;8,79và 9,11g/ml.

Bảng4.19.Kết quảthửnghiệmhoạttínhứcchếtạoutếbàoungthưganHepG2trên thạchmềmcủa các hợpchất

Kíchthước trung bìnhcủa khối u Độgiảmmậtđ ộkhốiu (%) Đườngkính (àm)

GL-HT 20 17,221,15 43,45 45,280,64 Đốichứng âm Hợpchất HT1

Kết quả tại bảng 4.18 và hình 4.48 cho thấy mẫu HT2 ức chế rõ rệt sựhình thành khối u với mật độ hình thành khối u giảm là 55,78 so với đối chứngvà kích thước trung bình của khối u giảm tương ứng là 52,31% so với đốichứng.

Trong số các chất từ nấm dược liệu thì polysaccharide được quan tâmnhiều nhất bởi chúngc h i ế m h à m l ư ợ n g c a o ( k h o ả n g

1 5 45% so với trọnglượng nấm khô) và có hoạt tính như tăng cường miễn dịch và kháng u Vì vậy,chúng tôi đi sâu nghiên cứu hoạt tính kháng u và tăng cường miễn dịch Đâycũng là những kết quả đầu tiên nghiên cứu về hoạt tính này từ nấm nuôi trồng ởViệt Nam.

Nghiêncứubiếnđổiβ-1,3- glucantừnấmhầuthủthànhhoạtchấtdễtanhơnvàđánh giáhoạttínhcủachúng

Thủyphânbằng enzyme-1,3-glucanase

Enzymeβ-1,3 glucanase dùng cắt ngắn mạch của- glucan từ nấm hầuthủ thu được 3 phân đoạn (HT-GL1, HT-GL2, HT-GL3 ) (xem mục 3.2.5 phầnthựcnghiệm)

Hình 4.49 Dùng cột sephadex G-100 kiểm tra Mw phân đoạn HT-GL1, HT-GL2 vàHT-GL3saukhiủvới enzymevàtáchphânđoạnbằngEtOH25,40 và70%.

3 phân đoạn trên được kiểm tra qua cột Sephadex G-100, thấy có 3 đỉnhpolysaccharide khác nhau HT-GL1, HT-GL2 và HT-GL3 có Mw tương ứng là521,252và11210 3

Cácβ-1,3/1,6-glucan với trọng lượng phân tử khác nhau gồm HT- GL1,HT-GL2 và HT-GL3 được dùngđánh giá hoạt tính gây độc tế bào và khả năngức chế sự hình thành khối u trên thạch mềm Kết quả được trình bày tại bảng4.20và4.21.

Bảng 4.20.Hoạt tính gây độc tế bào của cácβ-1,3/1,6-glucan với trọng lượngphântửkhác nhau.

Kếtqu ảt ạ i bảng4.20c h o thấymẫuH T- G L 1 v àH T-

GL 2b iể u h i ệ n h oạ t tính gây độc với 2 dòng tế bào ung thư gan (Hep-G2) và ung thư mô liên kết(RD) với giá trị IC50lần lượt là 13,56 và 14,25g mL 1 , 15,73 và 17,68g mL 1

Bảng 4.21.Kết quả thử nghiệm hoạt tính ức chế tạo u trên thạch mềm củaβ-

Kíchthướctrung bìnhcủakhối u Độgiảmmậtđ ộ khối u sovới đối chứng(%) Đườngkớnh(àm) % giảm so vớiđốichứng Đốichứngâm

Kếtquảtạibảng4.21chothấycả3mẫuđềubiểuhiệnhoạttínhứcchếsự hình thành khối u trên thạch mềm Tuy nhiên, 2 mẫu GL1 và GL2 ức chế rõrệt sự hình thành khối u với mật độ hình thành khối u giảm tương ứng là 59,72và 56,12% so với đối chứng và kích thước trung bình của khối u giảm tươngứng là 59,70 và 55,83 %s o v ớ i đ ố i c h ứ n g Đ á n g c h ú ý h ơ n c ả l à 2 s ả n p h ẩ m nàycó độtanvàhoạttínhtốthơnsovớisảnphẩmbanđầu.

Dùngβ-1,3/1,6-glucantừnấmhầuthủlàmchấtmang curcumin

Nghiên cứu tạo phức hệ Cur-Glu mục đích làm tăng độ tan của glucan vàcurcumint r o n g n ướ c Sả np hẩ m Cur-

Glukhi h òa ta n tr o n g n ướ cđ ã t h ể h iệ ntính tan tốt và tạo thành dung dịch có màu vàng trong suốt,kích thước hạt 50nm.

Curcumin là một trong những chất chống viêm, chống ôxi hóa điển hình.Nó không chỉ điều trị đắc lực cho các bệnh ung thư, loét dạ dày, hành tá tràng,đại tràng, yếuganmật, viêm gan B, C, xơgancổchướng…, màc ò n đ i ề u t r ị vừa nhẹ nhàng vừa hiệu quả cao các bệnh rối loạn hệ miễn dịch như viêm toànthân, viêm đa khớp (bệnh gút), viêm lõi cầu khớp, viêm màng bồ đào mắt, bệnhđa xơ cứng, bệnh khô cứng (mắt, âm đạo ), bệnh cứng bì, loãng xương, nhượccơ, viêm cơ… Tuy nhiên, bản thân Cur khó tan trong nước (~0,6 ng mL 1) , nếungười bệnh tiêu thụ một lượng Cur lớn hoặc trong thời gian kéo dài thì có thểmắc phải chứng phù nề niêm mạc ruột Vì vậy, để tận dụng được tính ưu việtcủa Cur và loại trừ hiệu ứng phụ của nó, người ta dùng polymer để mang nhữnghạt Cur Polysaccharide có khả năng tương hợp về mặt sinh học để chất nàyđược đưa dẫn đến đúng vị trí cần chữa trị và không bị tiêu tốn trong quá trìnhvận chuyểntrongngườibệnh.

Cấu trúc, hình thái học của Cur-Glu ĐophổhấpthụđiệntửcủaCur-GlubằngmáyVARIANspectrophotometer Carry 5000 UV-Vis-NIR Hình 4.50 là phổ hấp thụ điện tửcủa Cur trong rượu etylic và Cur-Glu trong H2O Thấy rằng, Cur trong ethanolcó đỉnh hấp thụ cực đại tại 428 nm, trong khi đó Cur đã được bao bằng Glu cócường độ hấp thụ tăng vọt và có đỉnh hấp thụ cực đại tại 415 nm Sự dịchchuyển đỉnh hấp thụ cực đại về bước sóng ngắn và tăng cường độ hấp thụ củaphổ chứng tỏ có sự tương tác giữa Cur với Glu Trên các phân tử Cur và GluđềucónhiềunhómOH- nêncác phântửnàycóthểtươngtácvớinhautheoliênkếthydro.

Phổ huỳnh quang trên hình 4.51 cũng thể hiện tương tự như phổ hấp thụtrên hình 4.50 Dung dịch Cur có đỉnh hấp thụ cực đại tại 538 nm, trong khi đódungd ị c h C u r -

Cur-glucanGlu 540 quang tăng cao hơn so với dung dịch Cur Như vậy, phổ huỳnh quang cũng mộtlầnnữa khẳngđịnhviệcGluđãmangCur.

Hình4.50.Phổhấpthụđiệntửcủa Cur và Cur-Glu

Hình4.51.Phổhuỳnh quang củaCur vàCur-Glu

1 0 à m (hỡnh 4.52a), chứng tỏ mạch khỏ dài Cur tồn tại ở dạng hỡnh que, kớch thướckhoảng 800 nm (hỡnh 4.52b) Khi tương tác với nhau, Glu mang Cur tạo thànhnhững hạt kích thước chỉ còn 50 nm (hình 4.52c,d) Với kích thước này, sự hấpthụ của Cur-Glu vào cơ thể sẽ trở nên dễd à n g h ơ n N h ư c h ú n g t a đ ã b i ế t , nhược điểm của thuốc chống ung thư trên thị trường hiện nay là độ hòa tantrong nước kém và không có tính bám đích Hệ Cur-Glu kích thước này có ưuđiểmrấtlớnlàtan tốttrongnướcvà tăng sinhkhảdụngcủa Cur.

F lu o re sc en c e in te n s it y A b s o rb a n c e

Hình4.52.ẢnhFESEM của Glu (a),Cur(b)vàCur-Glu(c,d)

Hình 4.53 Hình ảnh minh họa độ hòa tan của hỗn hợp Glu- Cur so sánh vớiCurcumin(độtan củaGlu-Cur (a) và Cur(b))

Hình 4.54 là ảnh huỳnh quang của Cur (hình 4.54a) và Cur-Glu (hình4.54b) cho thấy những hạt Cur và Cur-Glu đều cho độ phát quang mạnh, độtương phản và độ phân giải cao Tính chất phát quang của vật liệu gợi ý khảnăngứngdụngvậtliệunàykhôngnhữngtronghỗtrợđiềutrịungthưmàcònc ó thểchoquá trìnhđánhdấusinhhọc.

Hình4.54.Ảnhhuỳnhquang của hạt Cur (a)và Cur-Glu(b)

Thửn g h i ệ m g â y đ ộ c t ế b à o c ủ a c á c s ả n p h ẩ m C u r ,β- glucanv à p h ứ c hợp Cur-Glu đều không biểu hiện hoạt tính gây độc tế bào ung thư gan (Hep-G2) khinuôi cấyinvitro.Tuynhiên,trongthửnghiệmkhảnăng ức chếsựhình thànhuthìcósựkhácbiệtrõrệtgiữacácsảnphẩmvềkhảnăngứcchếhình thànhucũngnhưkíchthướccáckhốiu.Cáckếtquảđượctổngkếttrongbảng4.22.

Bảng4.22.Kếtquảthửnghiệmhoạttínhgâyđộctế bàovàhoạttínhứcchếtạou trênthạchmềmcủa các sảnphẩmtrên dòngtếbàoHep-G2

HT gây độc tếbào (%tếbào sống sót)

Tỷ lệ tạo u trênthạch mềm sovớiđốichứng (%)

Kích thước khuẩnlạc trung bình giảmsovới đối chứng

Hiệu quả ức chế rõ rệt của hỗn hợp Cur-Glu với tỷ lệ 4:1 lên sự hìnhthành khối u của dòng tế bào ung thư gan trên thạch mềm và đáng chú ý hơn lànóđãgắnđựợcvàotếbàolàmchotếbàophátquang.

Mặc dù Cur, Glu và Cur-Glu đều không biểu hiện hoạt tính gây độc tếbào trên dòng Hep-G2, nhưng hiệu quả ức chế rõ rệt của Cur-Glu với tỷ lệ4:1lên sự hình thành khối u của dòng tế bào này trên thạch mềm, mở ra hy vọngmớitronghướngnghiêncứuứngdụngcácsảnphẩmthiênnhiêntrongph òngvàđiềutrị ungthưđườngtiêuhóa.

ThửnghiệmtácdụngdượclýchếphẩmHG1trênđộngvậtthựcnghiệm

Kếtquảnghiêncứuđộctínhcấpcủasảnphẩmtheođườnguốngcủachế phẩmHG1

Các nhóm chuột nhắt trắng 12 con được cho uống ở các mứcl i ề u t h e o thứ tự tăng dần Số chuột chết được đếm theo nhóm trong 72 giờ Kết quả đượctrình bàyởbảng 4.23.

STT Liềusửdụng gmẫuthử/kg TLCT N Số CNT chết sau72h

Nhận xét: Sau khi uống sản phẩm đến mức thể tích cao nhất có thể chứađược của dạ dày chuột nhắt tương đương với liều 24 g/kg TLCT CNT, tất cảchuột thí nghiệm ở các lô được theo dõi sau 72 giờ, đếm số chuột chết theonhóm Kết quả vói mức thể tích cao nhất có thể đưa được vào dạ dày chuột nhắttrắng trong 24 giờ, không có bất kỳ một chuột nào bị chết Như vậy, chưa tìmthấy độc tính cấp của sản phẩm theo đường uống ở chuột nhắt Nói một cáchkhác,sảnphẩmrấtítđộc.

Từ đó chúng tôi xây dựng các mứcl i ề u t r o n g n g h i ê n c ứ u t i ế p t h e o đ ố i với sảnphẩm. Đã dùng 2 mức liều 1,0 và 3,0 g/kg TLCT cho nghiên cứu độc tính bántrườngdiễntrênCNTvà trênthỏ.

Độctínhbántrườngdiễncủasản phẩmHG1khichouốngtrênđộngvật thựcnghiệm

ThínghiệmđượcthựchiệntheophươngphápcủaAbrham(1978) [13]và theo quy định của WHO (2000) [169] về an toàn hợp chất có nguồn gốc tựnhiên.

4.4.2.1 Ảnh hưởng của HG1, cho CNT uống trường diễn đối với khối lượnggan,lách,thậnđộngvật

Các nhóm chuột nhắt trắng 10 con, trọng lượng cơ thể 20,0 g ± 2,0 gđượcdùngchothínghiệmnày.

Nhóm chứng cho uống dung môi0.2 mL cho mỗi CNT một lần hàngngày Nhóm thử cho uống sản phẩm liều 3,0 g/kg thể trọng chuột, liên tục trong42 ngày Ngày thứ 42, sau liều uống cuối cùng 6 h, chuột được giết bằng cáchsau khi gây mê nhẹ bằng ether, phẫu tích nội tạng, bóc tách dạ dày, gan, lách,thận Kiểm tra đại thể bằng kính lúp cầm tay (25) để đánh giá tổn thương Sauđó dùng cân phân tích cân các tạng gan, lách, thận Khối lượng của mỗi nhómtạng trên được so sánh giữa nhóm đối chứng và nhóm thử.

Tỷ lệ khối lượng củamỗi tạng so với 10 g khối lượng cơ thể được xác định theo nhóm và so sánh vớinhau.

Với mức liều sản phẩm đã sử dụng là 3,0 g/kg TLCT trên CNT: khôngthấy có sự khác nhau có ý nghĩa thống kê về các mặt: lượng thức ăn tiêu thụ,lượng nước uống tiêu thụ Các biểu hiện về tập tính của động vật thực nghiệmvề vận động và cảm giác không thấy có sự khác nhau giữa nhóm thử nghiệm vànhómchứng,p>0.05.

Khi phẫu thuậtbóc táchcáccơ quan( d ạ d à y , g a n , l á c h , t h ậ n ) q u a n s á t đại thể bằng mắt thường và quan sát dưới kính lúp ở độ phóng đại25 lần,không thấy có sự khác nhau ở niêm mạc dạ dày về màu sắc, hình thái Màu sắc,thểchất của 3tạnglàgan,lách,thận cũngkhông cósựkhác biệt. Kếtq u ả đ ị n h l ư ợ n g t r ọ n g l ư ợ n g c ơ t h ể k h i c h o đ ộ n g v ậ t t h í n g h i ệ m u ố n g trườngdiễnsảnphẩmliều3,0 g/kgđược trìnhbàyởbảng4.24.

Bảng 4.24 Chỉ số tăng trọng lượng ở các nhóm trắng, nhóm chứng, sảnphẩm nghiên cứu khi cho uống mức liều 3,0 g/kg bán trường diễn sản phẩmtrênchuộtnhắttrắng

Nhậnxét:Cá c kếtquảởbảng4 24 chothấychỉsốtăngtrọnglượngsosánh t heo các nhóm sau 6 tuần và tỷ số này giữa các nhóm trắng, chứng, chế phẩmsản phẩm và tham chiếu khác nhau không có ý nghĩa thống kê (p>0.05), chứngtỏ sản phẩm không ảnh hưởng đến trọng lượng chuột nghiên cứu Đây là chỉ sốquantrọngđánh giá chếphẩmmớikhinghiêncứu bántrườngdiễn.

4.4.2.2 Kết quả nghiên cứut r ọ n g l ư ợ n g c ơ t h ể C N T , k h ố i l ư ợ n g g a n , l á c h , thậnvàtỷ số giữa khốilượng mỗitạngsovớitrọng lượng cơthể

Bảng4.25.Kếtquảnghiêncứuvềtrọnglượngcơthểvàkhốilượngcáctạngởmức liềusảnphẩmlà3,0g/kg/24htrong42ngày

TLCT(g) KLtạng(g) KL tạng/10g TLCT p

Nhận xét: Ở mức liều sản phẩm đã sử dụng 3,0 g/kg TLCTđộng vật thựcnghiệm không ảnh hưởng đến các chỉ tiêu khối lượng các tạng gan, lách, thận -làcácchỉ tiêuquantrọng nhất trongquátrình chuyển hóa,thảitrừthuốc.

So sánh giữanhómthửvànhómchứngsựkhácbiệt không cóýnghĩa,p>0.05.

4.4.2.3 Ảnh hưởng của sản phẩm cho uống bán trường diễn đến các chỉ tiêuhuyếthọc trênđộngvậtthựcnghiệm

Với mức liều 3,0 g/kg thể trọng cho dùng bán trường diễn, các thông số huyếthọcđượctrìnhbàyởbảng 4.26.

Bảng 4.26 Các thông số huyết học khi dùng sản phẩm cho dùng uống bántrường diễnvớimức liều 3,0g/kg/24h

Nhận xét: Với mức liều đã sử dụng (3,0 g/kg/24h) uống 42 ngày liên tục, khônglàm ảnh hưởng đến số lượng các tế bào máuđ ộ n g v ậ t t h ự c n g h i ệ m ( p > 0 0 5 ) , sảnphẩmkhôngảnhhưởngđếnchứcnăngtạomáu.

4.4.2.4 Ảnh hưởng của sản phẩm đến các thông số hóa sinh động vật khi chouống bántrườngdiễn

Bảng 4.27 Các chỉ tiêu hóa sinh về chức năng gan, thận khi dùng sản phẩmbántrườngdiễnliều3,0g/kg/24giờ

Nhận xét: Với mức liều đã sử dụng (3,0 g/kg thể trọng), các enzyme chuyển(trans) ởgan làAST vàALT thay đổirấtít, sự khác biệt khôngcóý n g h ĩ a thống kê (p> 0,05) Chỉ số creatinin cũng thay đổi không có ý nghĩa. Như vậysảnphẩmkhôngảnh hưởngđếnchứcnănggan,thậnđộngvật thí nghiệm.

4.4.2.5 Ảnh hưởng của sản phẩm dùng uống 6 tuần đến chức năng tim thỏđượcđođiệntim

Bảng 4.28 Kết quả nghiên cứu điện tim thỏ dưới tác dụng của sản phẩm liều3,0g/ kg TLCTtạicác thời điểm(n)

NhómNC Tầnsố(chukỳ/phút) Biên độ

Nhậnxét:Sosánhgiữanhómthửvànhómchứng:Các thôngsốvềdiệntim như tần số (tính bằng chu kỳ/phút) và biên độ co bóp tâm cơ (tính bằng mV), sựkhác biệt không có ý nghĩa (p>0.05), chứng tỏ sản phẩm không làm ảnh hưởngđếnchứcnăngtimthỏ.

Bảng4.29.Kếtquảnghiêncứuvềmôbệnhhọccủagan,lách,thậnkhiuốngsảnphẩmbántr ườngdiễn liều3,0g/kg/TLCT Đặcđiểm LôHG1 (n) Lôchứng (n)

2hàng tếbào nhântrònđều đặn Cáctếbào gan bìnhthường

Cácmạchmáunanhoa,mạchmá u vùng khoảng cửa bình thường

Cáctổnthương Khôngquansát thấy Khôngquansát thấy

Cấut r ú c t i ê u t h ể Malpzi Rõ ràng Rõ ràng

Cáctổnthương Khôngquansát thấy Khôngquansát thấy

Kết luận Cấutrúcmôlách bìnhthường Cấu trúc mô lách bình thường

Màusắc Màunâunhạt,2thậnđềunhau Màun â u n h ạ t , 2 t h ậ n đ ề u nhau

Cấutrúcvỏ Rõ ràng Rõ ràng

Cấu trúcvùng tủy Có ranhgiới rõ Có ranhgiới rõ

Cầu thận Cấutrúcbình thường Cấutrúcbình thường Ốngthân Bìnhthường Bìnhthường

Nhận xét: Với mức liều đã dùng uống (3,0 g/kg thể trọng) uống liên tục 42ngày,đ ộ n g v ậ t t h ự c n g h i ệ m chưat h ấ y t ổ n t h ư ơ n g g a n , l á c h , t h ậ n H ì n h t h á i gan, lách, thận của nhóm chứng so với nhóm uống sản phẩm không có sự khácbiệtvề môbệnh học.

4.4.3.1 Tác dụng bảo vệ gan của sản phẩm trên chuột nhắt được gây độc ganbằng carbontetraclorid

Bảng 4.30 Kết quả định lượng hoạt độ các enzym AST, ALT và γGT ởGT ở cácnhómchuộtnhắt nghiên cứudướitácdụngcủasản phẩm

Các nhóm gây độc gan bằng carbon tetrachlorid

76,17 ±12,26 p3-2< 0,05 p3-1> 0,05 Ở nhóm 2: Khi dùng carbon tetrachlorid gây độc gan, hoạt độ các enzyme

AST,ALT và γGTGT tăng rất cao so với nhóm chứng (sự khác biệt có ý nghĩa với p2-1