TỐI ƯU HÓA QUY TRÌNH LY TRÍCH CAO CHIẾT LÁ XẠ ĐEN (Celastrus hindsii) GIÀU POLYPHENOL, FLAVONOID CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA VÀ KHÁNG ĐÁI THÁO ĐƯỜNG

Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Tập 58, Số chuyên đề: Khoa học tự nhiên (2022)(2): 48-58 DOI:10.22144/ctu.jvn.2022.119 TỐI ƯU HÓA QUY TRÌNH LY TRÍCH CAO CHIẾT LÁ XẠ ĐEN (Celastrus hindsii) GIÀU POLYPHENOL, FLAVONOID CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA VÀ KHÁNG ĐÁI THÁO ĐƯỜNG in vitro Đái Thị Xuân Trang1*, Nguyễn Thúy Tố Minh2, Nguyễn Hồng Duy3, Trần Chí Linh1 Phan Ngọc Thùy Ngân4 Khoa Khoa học Tự nhiên, Trường Đại học Cần Thơ Trường THPT Nguyễn Quang Diêu, Châu Thành, Sóc Trăng Trường THPT chuyên Nguyễn Quang Diệu, Cao Lãnh, Đồng Tháp Khoa Sức khỏe, Trường Đại học Cửu Long *Người chịu trách nhiệm viết: Đái Thị Xuân Trang (email: dtxtrang@ctu.edu.vn) Thông tin chung: Ngày nhận bài: 05/04/2022 Ngày nhận sửa: 25/04/2022 Ngày duyệt đăng: 26/04/2022 Title: Optimization of extraction process of Celastrus hindsii leaf extract rich in polyphenols, flavonoids with antioxidant and antidiabetic activities in vitro Từ khóa: Đái tháo đường, flavonoid, kháng oxy hóa, polyphenol, xạ đen Keywords: Antidiabetic, antioxidant, Celastrus hindsii, flavonoids, polyphenols ABSTRACT The surveys were arranged based on the response surface methodology according to the Box-Behnken model in Design Expert 11.0 software to optimize the extraction conditions to maximize the total polyphenol and flavonoid content from the leaves of the Celastrus hindsii (CH) The study has extracted polyphenols (120.30±1.15 mg GAE/g extract) and flavonoids (302.39±1.78 mg QE/g extract) optimally by immersion method in ethanol 69% (v/v) hours, material/solvent ratio 1/36 (w/v) and extraction temperature at 60°C The polyphenol-rich and flavonoid-rich extracts were then studied for their antioxidant and antidiabetic activities in vitro The results showed that, CH leaf extract exhibited potent neutralizing and reducing activities of free radicals in the test: DPPH (EC50=26.731.16 àg/mL), NOã (EC50=55.430.78 àg/mL), ABTSã+ (EC50=7.790.01 àg/mL), RP (EC50=9.03±0.12 µg/mL), FRAP (EC50=9.20±0.30 µg/mL), and TAC (EC50=59.49±2.61 µg/mL) The CH leaf extract also significantly inhibited α-amylase and α-glucosidase enzyme activities with EC50 values of 156.03±0.43 μg/mL, 26.33±0.76 μg/mL, respectively This study shows that CH leaf extract, rich in polyphenols and flavonoids, is a promising antioxidant and antidiabetic in vitro agent TÓM TẮT Khảo sát bố trí theo phương pháp đáp ứng bề mặt dựa vào mơ hình Box-Behnken phần mềm Design Expert 11.0 để tối ưu điều kiện ly trích polyphenol flavonoid xạ đen (LXĐ) Nghiên cứu ly trích polyphenol (120,30±1,15 mg GAE/g cao chiết), flavonoid (302,39±1,78 mg QE/g cao chiết) tối ưu phương pháp ngâm ethanol 69% (v/v) giờ, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi 1/36 (w/v) nhiệt độ ly trích 60°C Cao tối ưu LXĐ giàu polyphenol flavonoid nghiên cứu hoạt động kháng oxy hóa kháng đái tháo đường in vitro Kết cho thấy, cao tối ưu LXĐ thể hoạt động trung hòa khử hiệu gốc tự thử nghiệm DPPH (EC50=26,73±1,16 µg/mL), NOã (EC50=55,430,78 àg/mL), ABTSã+ (EC50=7,790,01 àg/mL), RP (EC50=9,030,12 àg/mL) v FRAP (EC50=9,20±0,30 µg/mL) TAC (EC50=59,49±2,61 µg/mL) Cao tối ưu LXĐ ức chế đáng kể hoạt động enzyme α-amylase α-glucosidase với giá trị EC50 lần lượt 156,03±0,43 μg/mL, 26,33±0,76 μg/mL Nghiên cứu cho thấy cao tối ưu LXĐ giàu polyphenol flavonoid tác nhân kháng oxy hóa kháng đái tháo đường in vitro đầy hứa hẹn 48 Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Tập 58, Số chuyên đề: Khoa học tự nhiên (2022)(2): 48-58 micropipette (Thermo Labsystems), máy đo quang phổ (Thermo Scientific Multiskan GO, Phần Lan), máy cô quay chân không (Heidolph, Đức) GIỚI THIỆU Đái tháo đường (ĐTĐ) bệnh rối loạn chuyển hóa nội tiết có đặc điểm lâm sàng tăng glucose huyết mãn tính thiếu insulin, coi nguy khủng hoảng sức khỏe lớn toàn giới (Wang et al., 2013; Kaur et al., 2016) Bệnh ĐTĐ gây tổn thương bệnh lý cho gan, thận tuyến tụy, với bất thường đặc trưng q trình chuyển hóa carbohydrate, lipid protein (Kuzuya et al., 2002) Các chất tự nhiên có hoạt tính kháng oxy hóa ức chế tổn thương stress oxy hóa gây trở thành chiến lược điều trị để giảm nguy mắc bệnh ĐTĐ biến chứng (Wang et al., 2013) Polyphenol flavonoid cho thấy số hoạt động dược lý bao gồm giảm apoptosis, kháng ĐTĐ, bảo vệ tim mạch, bảo vệ gan hoạt động tăng sinh tế bào (Han et al., 2007) Polyphenol flavonoid phần thiếu chế độ ăn uống của người có chất chiết xuất từ thực vật sử dụng y học Hóa chất: ethanol (Cemaco), trolox (SigmaAldrich), K2S2O8 (Merck), Na2CO3 (Xilong), gallic acid (Merck), quercetin (Merck), Folin-Ciocalteu’s phenol reagent (Merck), K3Fe(CN)6 (Merck), Cl3CCOOH (Merck), FeCl3 (Sigma-Aldrich), NaNO2 (Xilong), AlCl3.6H2O (Xilong), 2, 2diphenyl-1-picrylhydrazyl (Sigma-Aldrich), 2,2azino-bis (3-ethylbanzthiazoline-6-sulphonic acid (Germany), 2, 4, 6-tripyridyl-s-triazine (SigmaAldrich), NH4Mo7O24.4H2O (Xilong), dimethyl sulfoxide (Merck), enzyme α-amylase (SigmaAldrich), enzyme α-glucosidase (Sigma-Aldrich), acarbose (Sigma-Aldrich) số hóa chất khác 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Điều chế bột dược liệu LXĐ LXĐ tươi (4800 g) thu rửa sạch sấy khô nhiệt độ từ 40-45oC LXĐ khô (2750 g) xay nhuyễn thành bột ray qua ray kích thước hạt 60 mesh (0,25 mm) Bột dược liệu LXĐ có độ ẩm 4,25±0,04% xác định theo mô tả Dược Điển Việt Nam V (Bộ Y Tế, 2018) 2.2.2 Phương pháp định lượng polyphenol flavonoid Các loài thực vật đóng vai trị quan trọng việc bảo vệ sức khỏe, chống lại bệnh tật cho người Các cao chiết khác ly trích từ xạ đen thể hoạt tính dược lý như: kháng oxy hóa (Ly et al., 2006), kháng virus (Luo et al., 2018), kháng ung thư (Hu et al., 2014) Bên cạnh đó, nghiên cứu thành phần hóa học chỉ rằng xạ đen có chứa alkaloid, flavonoid, phenol, steroid triterpen (Cianciosi et al., 2005; Pham et al., 2020) Các nghiên cứu hoạt tính kháng oxy hóa kháng ĐTĐ in vitro Việt Nam vẫn cịn nhiều hạn chế Do đó, nghiên cứu thực nhằm tối ưu hóa điều kiện ly trích polyphenol flavonoid từ xạ đen (LXĐ) giàu hoạt tính sinh học Định lượng polyphenol tổng thuốc thử Folin-Ciocalteu Hàm lượng polyphenol xác định theo mô tả của Singleton et al (1999) Hỗn hợp phản ứng gồm 250 µL cao chiết; 250 µL nước khử ion 250 µL thuốc thử Folin-Ciocalteu (25%) Sau phút, 250 µL dung dịch sodium carbonate 10% thêm vào lắc Độ hấp thu của hỗn hợp phản ứng đo bằng máy quang phổ bước sóng 765 nM sau ủ 30 phút 40oC Hàm lượng polyphenol xác định tương đương miligam gallic acid gram cao chiết (mg GAE/g cao chiết) PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu LXĐ thu mua vào tháng 09 năm 2020, tại tỉnh Hịa Bình Mẫu xử lý lưu giữ tại phịng thí nghiệm Nghiên cứu Phát triển Dược liệu của môn Sinh học thuộc Khoa Khoa học Tự nhiên, Trường Đại học Cần Thơ Cây xạ đen xác định dựa vào đặc điểm hình thái quan sinh dưỡng sinh sản theo hệ thống phân loại Cây cỏ Việt Nam (Hộ, 2003) Phương pháp định lượng flavonoid Hàm lượng flavonoid xác định theo mô tả của Sultana et al (2007) Hỗn hợp phản ứng gồm: 200 µL cao chiết, 200 µL nước khử ion 200 µL NaNO2 (5%) ủ phút Sau đó, 40 µL AlCl3 (10%) thêm vào ủ phút Tiếp theo, 400 µL NaOH M thêm vào hỗn hợp Thể tích cuối điều chỉnh thành 1000 µL bằng nước khử ion trộn kỹ Sau 15 phút, độ hấp thu quang phổ của hỗn hợp xác định bước sóng 510 nM Hàm lượng flavonoid xác định Thiết bị: máy ly tâm lạnh (Mikro 12-24, Hettich, Đức), cân phân tích (AB104-S, Mettler Toledo, Thụy Sỹ), tủ sấy (BE 200, Memmert, Đức), bể ủ (Memmert, Đức), máy vortex (ZX3, Velp, Ý), 49 Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Tập 58, Số chuyên đề: Khoa học tự nhiên (2022)(2): 48-58 tương đương miligam quercetin gram cao chiết (mg QE/g cao chiết) 2.2.3 Khảo sát ảnh hưởng yếu tố đơn đến trình ly trích cao chiết LXĐ giàu polyphenol flavonoid 2.2.5 Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa kháng ĐTĐ in vitro Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa in vitro Hoạt tính kháng oxy hóa in vitro của cao tối ưu LXĐ đánh giá thông qua phương pháp Khả kháng oxy hóa tổng đánh giá bằng phương pháp phosphomolybdenum theo mô tả của Prieto et al (1999) Khả trung hòa gốc tự của cao tối ưu LXĐ đánh giá thơng qua phương pháp trung hịa gốc tự 2,2'-azino-bis3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS•+) theo mơ tả của Nenadis et al (2004), 2,2-diphenyl1-picrylhydrazyl (DPPH) theo mô tả của Sharma and Bhat (2009) nitric oxide (NO•) theo mơ tả của Alisi and Onyeze (2008) Thử nghiệm khả khử của cao tối ưu LXĐ đánh giá dựa vào lực khử sắt (Reducing power, RP) theo mô tả của Oyaizu (1986) tiềm khử sắt (Ferric reducing-antioxidant power, FRAP) theo mô tả của Benzie and Strain (1996) Tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi: Bột dược liệu LXĐ ngâm với tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi là: 1/10, 1/15, 1/20, 1/25, 1/30, 1/35 1/40 (w/v) Các yếu tố thời gian ly trích với nồng độ ethanol 90% (v/v) nhiệt độ 30○C cố định Nhiệt độ: Bột dược liệu LXĐ ngâm nhiệt độ khác nhau: 30, 40, 50, 60, 70, 80 90○C Các yếu tố nồng độ ethanol 90% (v/v) với tỷ lệ nguyên liệu/dung môi 1/10 (w/v) cố định Nồng độ ethanol: Bột dược liệu LXĐ ngâm với ethanol: 40, 50, 60, 70, 80 90 99,5% (v/v) Các yếu tố thời gian ly trích với tỷ lệ nguyên liệu/dung môi 1/10 (w/v) nhiệt độ 30○C cố định Trong thử nghiệm kháng oxy hóa trên, tinh chất trolox sử dụng làm đối chứng dương Các hoạt động kháng oxy hóa của cao tối ưu LXĐ so sánh với hoạt tính của trolox cao LXĐ (cao LXĐ cao chiết xuất điều kiện bình thường theo mơ tả của Phụng (2007) Anh et al (2021), cụ thể sau: ethanol 99,5% (v/v), nhiệt độ chiết 30○C, thời gian 24 tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi 1/10 (w/v)) bằng cách tính tốn nồng độ (µg/mL) mà cao tối ưu LXĐ, cao LXĐ trolox khử trung hòa 50% gốc tự (effective concentration of 50%, EC50) 2.2.6 Khảo sát hoạt tính kháng ĐTĐ in vitro Thời gian: Bột dược liệu LXĐ ngâm mốc thời gian: 6, 12, 18, 24, 30, 36 42 Các yếu tố nồng độ ethanol 90% (v/v) với tỷ lệ nguyên liệu/dung môi 1/10 (w/v) nhiệt độ 30○C cố định Sau đó, dịch ngâm lọc cô đuổi dung môi để thu lấy cao dược liệu tương ứng Polyphenol flavonoid định lượng cao dược liệu theo mơ tả Mục 2.2.2 2.2.4 Tối ưu hóa quy trình ly trích cao chiết LXĐ giàu polyphenol flavonoid Quy trình ly trích polyphenol flavonoid bột dược liệu LXĐ tối ưu hóa theo mơ hình Box-behnken phần mềm Design Expert 11.0 Thí nghiệm tiến hành với yếu tố ảnh hưởng Mơ hình kết hợp với số thí nghiệm tâm thông số tối ưu xác định dựa vào thí nghiệm khảo sát đơn yếu tố số thí nghiệm cánh tay địn xoay xung quanh tâm Trong khảo sát tổng số nghiệm thức 17, có nghiệm thức trung tâm Dựa vào phương trình hồi quy đa biến, tương tác của yếu tố ảnh hưởng với hàm mục tiêu kết quả ước tính đạt cao của hàm lượng polyphenol, flavonoid tương ứng với thông số tối ưu để xác định cụ thể quy trình ly trích tối ưu cao chiết LXĐ giàu polyphenol flavonoid Hoạt tính kháng ĐTĐ in vitro của cao tối ưu LXĐ đánh giá thông qua khả ức chế hoạt động của enzyme α-amylase α-glucosidase Trong đó, khả ức chế enzyme α-amylase của cao tối ưu LXĐ thực theo mô tả của XiaoPing et al (2010) Hiệu quả ức chế enzyme αglucosidase của cao tối ưu LXĐ xác định theo mô tả của Shai et al (2011) Tinh chất acarbose sử dụng làm đối chứng dương Khả ức chế enzyme α-amylase αglucosidase của cao tối ưu LXĐ so sánh với hoạt tính của acarbose cao LXĐ bằng cách tính tốn nồng độ (µg/mL) mà cao tối ưu LXĐ, cao LXĐ acarbose có hiệu quả ức chế 50% hoạt động của enzyme (effective concentration of 50%, EC50) 50 Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Tập 58, Số chuyên đề: Khoa học tự nhiên (2022)(2): 48-58 lượng polyphenol flavonoid tăng dần từ tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi 1/10 (w/v) đến 1/35 (w/v), khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê (Hình 1A) Sau đó, hàm lượng polyphenol, flavonoid ly trích bắt đầu giảm khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê (p0,05) Hàm lượng polyphenol flavonoid tăng liên tục ly trích nhiệt độ từ 30oC (TPC=11,94±0,80 mg GAE/g cao chiết, TFC=29,53±0,90 mg QE/g cao chiết) đến 60oC (TPC=27,19±0,54 mg GAE/g cao chiết, TFC=87,52±2,17 mg QE/g cao chiết) bắt đầu giảm từ 70oC (TPC=23,51±0,48 mg GAE/g cao chiết, TFC=60,43±2,11 mg QE/g cao chiết) Như vậy, nhiệt độ ly trích (biến số độc lập) thay đổi từ 30oC đến 90oC, hàm lượng polyphenol flavonoid (biến phụ thuộc) đạt cực đại 60oC, sau giảm dần tăng nhiệt độ (Hình 1C) Nguyên nhân dẫn đến giảm hàm lượng polyphenol flavonoid bột dược liệu LXĐ ngâm nhiệt độ cao thời gian dài dẫn đến phân hủy của hợp chất thuộc nhóm polyphenol flavonoid Nghiên cứu của Nuutila et al (2002) Şensoy et al (2006) cho thấy nhiệt độ ly trích cao dẫn đến phân hủy của hợp chất thuộc nhóm polyphenol flavonoid Nồng độ ethanol, nhiệt độ tỷ lệ nguyên liệu/ dung mơi yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng polyphenol flavonoid ly trích từ LXĐ (Hình 1) Nồng độ ethanol từ 60% đến 80%, nhiệt độ từ 50oC đến 70oC, tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi từ 1/30 đến 1/40 (w/v) thời gian chọn để đưa vào mơ hình tối ưu hóa điều kiện ly trích polyphenol flavonoid 3.2 Tối ưu hóa quy trình chiết xuất polyphenol flavonoid ly trích từ LXĐ Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ ethanol, nhiệt độ, tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi đến hàm lượng polyphenol flavonoid LXĐ thực nghiệm mơ hình dự đốn trình bày Bảng Hàm lượng polyphenol flavonoid của bột dược liệu LXĐ ly trích mốc thời gian khác trình bày Hình 1D Hàm lượng polyphenol thu dao động từ 11,19±0,86 mg Bảng Kết thực nghiệm, dự đoán hàm lượng polyphenol flavonoid Nghiệm thức 10 11 12 13 14 15 16 17 Các biến độc lập A (oC) 45 65 45 65 45 65 45 65 55 55 55 55 55 55 55 55 55 B (%, v/v) 60 60 80 80 70 70 70 70 60 80 60 80 70 70 70 70 70 C (w/v) 1/35 1/35 1/35 1/35 1/30 1/30 1/40 1/40 1/30 1/30 1/40 1/40 1/35 1/35 1/35 1/35 1/35 Hàm lượng polyphenol (mg GAE/g cao chiết) Thực nghiệm Dự đoán 61,75h±0,85 64,86 68,90f±0,68 67,88 55,23i±1,51 56,25 48,63j±1,04 45,52 78,11d±1,10 76,57 70,04f±0,83 72,63 93,32b±0,73 90,73 85,43c±0,76 86,97 66,73g±0,59 65,16 45,03k±0,85 45,55 75,80e±0,93 75,28 62,37h±0,81 63,94 117,30a±0,96 116,88 116,05a±0,09 116,88 118,85a±0,09 116,88 114,71a±1,10 116,88 117,47a±1,20 116,88 Hàm lượng flavonoid (mg QE/g cao chiết) Thực nghiệm Dự đoán 163,51k±1,34 165,75 171,84j±1,02 172,04 101,93m±0,65 101,71 88,68o±062 86,42 209,18f±1,92 208,42 198,70g±0,65 199,98 211,70d±0,66 220,39 219,08e±1,06 219,82 174,05i±1,59 172,54 98,28n±0,86 99,22 190,92h±1,66 189,96 112,14l±1,21 113,62 297,59b±017 297,18 298,07b±0,09 297,18 299,74a±0,05 297,18 296,53b±0,03 297,18 294,05c±0,03 297,18 Ghi chú: Các giá trị có mẫu tự theo sau cùng cột giống khác biệt khơng có ý nghĩa mức 5% A nhiệt độ(oC), B nồng độ ethanol (%, v/v), C tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi (w/v) Các nghiệm thức trung tâm (nghiệm thức 13 đến 17) cho hàm lượng polyphenol flavonoid cao nghiệm thức cịn lại Trong đó, nghiệm thức 15 cho hàm lượng polyphenol (118,85±0,09 mg GAE/g cao chiết) flavonoid (299,74±0,05 mg QE/g cao chiết) cao So với hàm lượng 52 Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Tập 58, Số chuyên đề: Khoa học tự nhiên (2022)(2): 48-58 polyphenol, flavonoid mà mơ hình dự đốn hàm lượng polyphenol thu 17 nghiệm thức không khác so với mơ hình thực nghiệm YPolyphenol = -3275,83725 + 25,58572 × A + 54,08495 × B + 42,29115 × C - 0,03437 × A × B + 0,0009 × A × C + 0,04135 × B × C - 0,19503 × A2 0,38745 × B² - 0,62592 × C² Dựa vào kết quả thu nhận từ Bảng 1, phần mềm Design Expert 11.0 sử dụng để tiến hành tối ưu hóa nhằm xác định giá trị của ba yếu tố mà tại hàm lượng polyphenol flavonoid cao Từ số liệu thực nghiệm, phương trình hồi quy dạng bậc hai thể hàm lượng polyphenol flavonoid thiết lập sau: YFlavonoid = -8869,8385 + 60,48385 × A + 162,08908 × B + 102,27915 × C - 0,05395 × A × B + 0,0893 × A × C - 0,01505 × B × C - 0,49944 × A2 - 1,15762 × B2 - 1,50347 × C2 Trong đó, Y hàm lượng polyphenol flavonoid dự đoán thu từ LXĐ, A yếu tố nhiệt độ (oC), B yếu tố nồng độ ethanol (%, v/v) C yếu tố tỷ lệ nguyên liệu/dung môi (w/v) Bảng Phân tích hệ số tương quan yếu tố đến hàm lượng polyphenol Nguồn Model A B C AB AC BC A² B² C² Residual Lack of Fit Pure Error Cor Total Phân tích ANOVA polyphenol Sum of Mean Df F-value p-value squares square 10770,22 1196,69 152,96 < 0,0001 29,68 29,68 3,79 0,0925 479,26 479,26 61,26 0,0001 406,27 406,27 51,93 0,0002 47,27 47,27 6,04 0,0436 0,0081 0,0081 0,0010 0,9752 17,10 17,10 2,19 0,1828 1601,55 1601,55 204,71 < 0,0001 6320,90 6320,90 807,94 < 0,0001 1030,99 1030,99 131,78 < 0,0001 54,76 7,82 44,96 14,99 6,12 0,0564 9,80 2,45 N=17 CV=3,14% 10824,98 16 R2=0,9949 R2Adj=0,9884 R2Pre=0,9321 Phân tích ANOVA sử dụng để đánh giá mơ hình thu kết quả thể Bảng Phương trình hồi quy của polyphenol flavonoid có dạng hàm bậc đạt tương quan tốt với phân tích phương sai (ANOVA) có ý nghĩa thống kê (p0,05) so với hàm lượng polyphenol, flavonoid mà mơ hình tối ưu đề Do đó, mơ hình tối ưu thiết kế thí nghiệm chấp nhận Dựa kết quả phân tích phương án tốt dự đốn để ly trích polyphenol, flavonoid từ LXĐ trình bày Hình Như vậy, hàm lượng polyphenol, flavonoid từ LXĐ ly trích tối ưu điều kiện nhiệt độ 59,69oC, nồng độ ethanol 68,91% tỷ lệ nguyên liệu/dung môi 1/35,97 (w/v), hàm lượng polyphenol, flavonoid thu đạt cao 118,04 mg GAE/g cao chiết 299,74 mg QE/g cao chiết Hình Hàm kỳ vọng điều kiện tối ưu hàm lượng polyphenol flavonoid 54 Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Tập 58, Số chuyên đề: Khoa học tự nhiên (2022)(2): 48-58 3.3 Hoạt tính kháng oxy hóa kháng ĐTĐ in vitro cao tối ưu LXĐ 3.3.1 Hiệu kháng oxy hóa in vitro cao tối ưu LXĐ hóa yếu có giá trị EC50>150 µg/mL Kết quả nghiên cứu cho thấy, cao tối ưu LXĐ có hoạt tính kháng oxy hóa mạnh gốc t cỏc phng phỏp DPPH (EC50=26,731,16 àg/mL), ABTSã+ (EC50=7,79±0,01 µg/mL), RP (EC50=9,03±0,12 µg/mL) FRAP (EC50=9,20±0,30 µg/mL) Trong đó, cao tối ưu LXĐ đánh giá có khả trung hịa khử mạnh gốc tự NOã (EC50=55,430,78 àg/mL), TAC (EC50=59,492,61 àg/mL) Tuy nhiờn, cao tối ưu LXĐ có khả kháng oxy hóa phương pháp DPPH, ABTS•+, RP, FRAP TAC yếu tinh chất trolox 41,77, 3,40, 2,36, 3,76 1,20 lần Đối với gốc tự NO•, cao tối ưu LXĐ xác định mạnh tinh chất trolox 1,40 lần Cao tối ưu LXĐ đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa bằng cách so sánh với chất chuẩn trolox thông qua việc sử dụng nồng độ (µg/mL) mà tại chất chuẩn hay cao chiết trung hòa khử 50% lượng gốc tự (EC50-half maximal effective concentration) Theo nghiên cứu của Blois (2000), mẫu thử có giá trị EC50 thấp 50 µg/mL chất kháng oxy hóa mạnh; 50-100 µg/mL chất kháng oxy hóa mạnh 101-150 µg/mL chất kháng oxy hóa trung bình chất kháng oxy 120 116,28 92,85 100 90,93 Giá trị EC50 (µg/mL) 85,69 81,91 77,6 80 59,49 55,43 60 49,65 38,39 40 26,73 20 9,2 9,03 7,79 3,82 2,29 0,64 2,45 DPPH NO ABTS Cao tối ưu xạ đen RP Cao xạ đen FRAP TAC Trolox Hình Nờng độ trung hòa khử 50% lượng gốc tự nhiệt độ chiết 40oC, thời gian chiết 29 phút nồng độ ethanol 65% Kết quả cho thấy, cao tối ưu LXĐ nghiên cứu của Pham et al (2020) có khả trung hịa gốc tự DPPH ABTS•+ với giá trị EC50 164,85 89,05 μg/mL Trong nghiên cứu này, cao tối ưu LXĐ có hiệu quả trung hịa gốc tự DPPH (EC50=26,73±1,16 µg/mL) v ABTSã+ (EC50=7,790,01 àg/mL) manh hn cao ti u LX nghiên cứu của Pham et al (2020) 6,17 11,43 lần Trong nghiên cứu của Pham et al (2020), khả trung hòa gốc tự DPPH ABTS•+ thấp nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng flavonoid Trong nghiên cứu này, cao tối ưu LXĐ có hàm lượng flavonoid 302,39±1,78 mg QE/g cao chiết cao gấp Bên cạnh việc so sánh với tinh chất trolox, hoạt tính kháng oxy hóa của cao tối ưu LXĐ so sánh với cao LXĐ (cao chưa tối ưu) Cao LXĐ ly trích bằng cách ngâm bột dược liệu dung môi ethanol 99,5% (v/v), 30oC, 24 với tỷ lệ nguyên liệu/dung môi 1/10 (w/v) Qua so sánh thấy, cao tối ưu LXĐ có hoạt tính kháng oxy hóa tất cả phương pháp mạnh cao LXĐ Cụ thể, phương pháp DPPH, ABTS•+, NO•, RP, FRAP TAC, cao tối ưu LXĐ mạnh cao LXĐ 3,40, 11, 1,68, 4,25, 8,90 1,95 lần Trong nghiên cứu của Pham et al (2020), xạ đen tối ưu hóa quy trình ly trích flavonoid bằng phương pháp siêu âm với công suất 130 W, 55 Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Tập 58, Số chuyên đề: Khoa học tự nhiên (2022)(2): 48-58 12,81 lần so với nghiên cứu của Pham et al (2020) Trong nghiên cứu có tương đồng với nghiên cứu của Pham et al (2020) khả trung hòa gốc tự DPPH của cao tối ưu LXĐ gốc tự ABTS•+ Bên cạnh đó, nghiên cứu đánh giá đa dạng khả kháng oxy hóa của cao tối ưu LXĐ nhiều gốc tự khác 3.3.2 Hiệu kháng đái tháo đường in vitro cao tối ưu LXĐ của enzyme (giá trị EC50) đánh giá khả ức chế enzyme của cao tối ưu LXĐ Giá trị EC50 nhỏ chứng minh khả ức chế enzyme của cao chiết cao ngược lại Bên cạnh việc so sánh với tinh chất acarbose, hoạt tính ức chế enzyme α-amylase α-glucosidase của cao tối ưu LXĐ so sánh với cao LXĐ (cao chiết điều kiện bình thường chưa tối ưu) Kết quả trình bày Bảng cho thấy, khả ức chế enzyme α-amylase α-glucosidase tăng dần theo thứ tự từ cao LXĐ < cao tối ưu LXĐ < acarbose Cụ thể, cao tối ưu LXĐ có khả ức chế enzyme α-amylase (EC50=156,03±0,43 µg/mL) α-glucosidase (EC50=26,33±0,76 µg/mL) mạnh cao LXĐ (EC50, α-amylase=455,08±4,46 µg/mL; EC50, α-glucosidase=76,56±0,87 µg/mL) 2,92 2,91 lần Tinh chất acarbose xác định có hoạt tính ức chế enzyme α-amylase (EC50=20,02±0,55 µg/mL) α-glucosidase (EC50=4,66±0,08 µg/mL) mạnh cao tối ưu LXĐ lượt 7,79 5,65 lần Như vậy, nghiên cứu cho thấy, cao tối ưu LXĐ giàu polyphenol flavonoid có khả ức enzyme α-amylase α-glucosidase mạnh cao LXĐ Từ đó, hàm lượng polyphenol flavonoid chứng minh đóng vai trị quan trọng việc điều hòa hoạt động của enzyme αamylase α-glucosidase Nghiên cứu của Williams (2013) Kang et al (2014) cho thấy cao chiết thực vật có hoạt tính ức chế enzyme α-amylase α-glucosidase phụ thuộc vào hàm lượng polyphenol flavonoid Enzyme α-amylase α-glucosidase sử dụng nghiên cứu có mối liên quan chặt chẽ mặt cấu trúc học với enzyme của người, enzyme ly trích từ động vật Cụ thể, enzyme α-amylase ly trích từ tụy enzyme α-glucosidase ly trích từ ruột non thích hợp cho việc bố trí thí nghiệm khảo sát hoạt tính kháng ĐTĐ in vitro Một tác nhân có khả ức chế enzyme α-amylase α-glucosidase sử dụng nhóm thuốc hỗ trợ điều trị bệnh ĐTĐ bằng cách ngăn chặn thủy phân nhanh dạng carbohydrate thành đường đơn giúp kéo dài thời gian hấp thu kiểm sốt glucose huyết (Zhenhua et al., 2014) Do đó, nghiên cứu tiến hành khảo sát khả ức chế hoạt động của enzyme α-amylase α-glucosidase Trong nghiên cứu này, tinh chất acarbose sử dụng làm chất đối chứng dương để so sánh tác dụng của ức chế enzyme α-amylase αglucosidase của cao tối ưu LXĐ Dựa vào nồng độ mà tại cao chiết ức chế 50% hoạt động Bảng Nồng độ ức chế 50% sự hoạt động enzyme α-amylase α-glucosidase Phương pháp Enzyme α-amylase Enzyme α-glucosidase Giá trị EC50 (µg/mL) Cao LXĐ tối ưu Cao LXĐ 156,03b±0,43 455,08a±4,46 26,33b±0,76 76,56a±0,87 Acarbose 20,02c±0,55 4,66c±0,08 Ghi chú: Các giá trị có mẫu tự theo sau cùng hàng giống khác biệt khơng có ý nghĩa mức 5% Cao LXĐ cao ly trích phương pháp ngâm dung môi ethanol 99,5% (v/v), nhiệt độ 30oC, thời gian ly trích 24 giờ tỷ lệ nguyên liệu/dung môi 1/10 (w/v) flavonoid (302,39±1,78 mg QE/g cao chiết) Đồng thời, nghiên cứu cho thấy, cao tối ưu LXĐ giàu polyphenol flavonoid có khả trung hòa tốt gốc tự DPPH (EC50=26,73±1,16 µg/mL), NO• (EC50=55,43±0,78 µg/mL), ABTS•+ (EC50=7,79±0,01 µg/mL), khử hiệu quả phức chất phương pháp RP (EC50=9,03±0,12 µg/mL) FRAP (EC50=9,20±0,30 µg/mL) TAC (EC50=59,49±2,61 µg/mL) Các enzyme α-amylase (EC50=156,03±0,43 μg/mL) α-glucosidase (EC50=26,33±0,76 μg/mL) bị ức chế cao tối ưu LXĐ KẾT LUẬN Hàm lượng polyphenol flavonoid ly trích từ LXĐ chịu ảnh hưởng đáng kể nồng độ ethanol, tỷ lệ nguyên liệu/dung mơi, nhiệt độ thời gian ly trích Nghiên cứu tiến hành tối ưu hóa quy trình ly trích polyphenol flavonoid bằng phương pháp đáp ứng bề mặt theo mơ hình Box-Behnken phần mềm Design Expert 11.0 Bột dược liệu LXĐ ngâm ethanol 69% (v/v) với tỷ lệ nguyên liệu/dung môi 1/36 (w/v), nhiệt độ chiết xuất 60oC thu cao chiết LXĐ giàu polyphenol (120,30±1,15 mg GAE/g cao chiết) 56 Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Tập 58, Số chuyên đề: Khoa học tự nhiên (2022)(2): 48-58 nghiên cứu khuôn khổ đề tài: “Khảo nghiệm trồng xạ đen tại tỉnh Tây Ninh làm nguồn dược liệu theo hướng hỗ trợ điều trị bệnh gan, ĐTĐ type lipid máu cao” LỜI CẢM TẠ Xin chân thành cảm ơn Sở Khoa học Công nghệ tỉnh Tây Ninh hỗ trợ kinh phí thực TÀI LIỆU THAM KHẢO Alisi, C S., & Onyeze, G O C (2008) Nitric oxide scavenging ability of ethyl acetate fraction of methanolic leaf extracts of Chromolaena odorata (Linn.) African Journal of Biochemistry Research, 2(7), 145-150 DOI:10.5897/AJBR.9000174 Anh, V T T., Trang, D T X., Kamei, K., Linh, T C., Pham-Khanh, N H., Tuan, N T., & Danh, L T (2021) Phytochemicals, antioxidant and antidiabetic activities of extracts from Miliusa velutina flowers Horticulturae, 7(12), 555-567 https://doi.org/10.3390/horticulturae7120555 Benzie, I F., & Strain, J J (1996) The ferric reducing ability of plasma (FRAP) as a measure of antioxidant power: the FRAP assay Analytical Biochemistry, 239(1), 70-76 https://doi.org/10.1006/abio.1996.0292 Blois, M S (1958) Antioxidant determination by the use of stable free radicals Nature, 181(4617), 1199-2000 https://doi.org/10.1038/1811199a0 Bộ Y Tế (2018) Dược điển Việt Nam V Nhà xuất bản Y học Chirinos, R., Rogez, H., Campos, D., Pedreschi, R., & Larondelle, Y (2007) Optimization of extraction conditions of antioxidant phenolic compounds from mashua (Tropaeolum tuberosum Rz & Pavón) tubers Separation and Purification Technology, 55, 217-225 https://doi.org/10.1016/j.seppur.2006.12.005 Cianciosi, D., Forbes-Hernández, T., Afrin, S., Gasparrini, M., Reboredo-Rodriguez, P., Manna, P., & Quiles, J (2018) Phenolic compounds in honey and their associated health benefits: A review Molecules, 23, 2322 https://doi.org/10.3390/molecules23092322 Eslami, A., Asadi, A., Meserghani, M., & Bahrami, H (2016) Optimization of sonochemical degradation of amoxicillin by sulfate radicals in aqueous solution using response surface methodology (RSM) Journal of Molecular Liquids, 222, 739-744 https://doi.org/10.1016/j.molliq.2016.07.096 Guan, X., & Yao, H (2008) Optimization of viscozyme L assisted extraction of oat bran protein using response surface methodology Food Chemistry, 106: 345-351 https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2007.05.041 Han, X., Shen, T., & Lou, H (2007) Dietary polyphenols and their biological significance International Journal of Molecular Sciences, 8(9), 950-988 DOI: 10.3390/i8090950 Hộ, P H (2000) Cây cỏ Việt Nam Nhà xuất bản Trẻ, Thành phố Hồ Chí Minh Hu, X Q., Han, W., Han, Z Z., Liu, Q X., Xu, X K., Fu, P., & Li, H L (2014) A new macrocyclic lactone and a new quinoflavan from Celastrus hindsii Phytochemistry Letters, 7, 169-172 https://doi.org/10.1016/j.phytol.2013.11.015 Kaur, G., Padiya, R., Adela, R., Putcha, U K., Reddy, G S., Reddy, B R., & Banerjee, S K (2016) Garlic and resveratrol attenuate diabetic complications, loss of β-cells, pancreatic and hepatic oxidative stress in streptozotocin-induced diabetic rats Frontiers in Pharmacology, 7, 360 https://doi.org/10.3389/fphar.2016.00360 Kuzuya, T., Nakagawa, S., Satoh, J., Kanazawa, Y., Iwamoto, Y., Kobayashi, M., & Kadowaki, T (2002) Report of the Committee on the classification and diagnostic criteria of diabetes mellitus Diabetes Research and Clinical Practice, 55(1), 65-85 https://doi.org/10.1016/S0168-8227(01)00365-5 Ly, T N., Shimoyamada, M., & Yamauchi, R (2006) Isolation and characterization of rosmarinic acid oligomers in Celastrus hindsii Benth leaves and their antioxidative activity Journal of Agricultural and Food Chemistry, 54(11), 3786-3793 https://doi.org/10.1021/jf052743f Luo, D., Xiong, S., Li, Q G., Jiang, L., Niu, Q W., He, L J., Li, Y L., Zhang, Y B., & Wang, G C (2018) Terpenoids from the stems of Celastrus hindsii and their anti-RSV activities Fitoterapia, 130, 118-124 https://doi.org/10.1016/j.fitote.2018.08.018 Nuutila, A M., Kammiovirta, K., & OksmanCaldentey, K M (2002) Comparison of methods for the hydrolysis of flavonoids and phenolic acids from onion and spinach for HPLC analysis Food Chemistry, 76(4), 519-525 https://doi.org/10.1016/S0308-8146(01)00305-3 Oyaizu, M (1986) Studies on product of browning reaction prepared from glucosamine The Japanese Journal of Nutrition and Dietetics, 44(6), 307-316 https://doi.org/10.5264/eiyogakuzashi.44.307 Pham, D C., Nguyen, H.C., Nguyen, T L., Ho, H L., Trinh, T K., Riyaphan, J., & Weng, C F 57 Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Tập 58, Số chuyên đề: Khoa học tự nhiên (2022)(2): 48-58 (2020) Optimization of ultrasound-assisted extraction of flavonoids from Celastrus hindsii leaves using response surface methodology and evaluation of their antioxidant and antitumor activities BioMed Research International, 3497107 https://doi.org/10.1155/2020/3497107 Phụng, N K P (2007) Phương pháp cô lập hợp chất hữu Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh https://doi.org/10.1155/2020/3497107 Prieto, P., Pineda, M & Aguilar, M (1999) Spectrophotometric quantitation of antioxidant capacity through the formation of a phosphomolybdenum complex: specific application to the determination of vitamin E Analytical biochemistry, 269, 337-341 https://doi.org/10.1006/abio.1999.4019 Şensoy, I., Rosen, R T., Ho, C T., & Karwe, M V (2006) Effect of processing on buckwheat phenolics and antioxidant activity Food Chemistry, 99(2), 388-393 https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2005.08.007 Shai, L., Magano, S., Lebelo, S., & Mogale, A (2011) Inhibitory effects of five medicinal plants on rat alpha-glucosidase: Comparison with their effects on yeast alpha-glucosidase Journal of Medicinal Plants Research, 5, 2863-2867 https://doi.org/10.5897/JMPR Sharma, O P., & Bhat, T K (2009) DPPH antioxidant assay revisited Food Chemistry, 113, 1202-1205 https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2008.08.008 Singleton, V L., Orthofer, R M., & LamuelaRaventos, R M (1999) Analysis of total phenols and other oxidation substrates and antioxidants by means of Folin-Ciocalteu reagent Methods Enzymol, 299, 152-178 https://doi.org/10.1016/S0076-6879(99)99017-1 Sultana, B., Anwar, F., & Przybylski, R (2007) Antioxidant activity of phenolic components present in barks of Azadirachta indica, Terminalia arjuna, Acacia nilotica, and Eugenia jambolana Lam trees Food Chemistry, 104, 1106-1114 https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2007.01.019 Thu Dao, T A., Webb, H K., & Malherbe, F (2021) Optimisation of pectin extraction from fruit peels by response surface method: conventional versus microwave-assisted heating Food Hydrocolloids, 106475 https://doi.org/10.1016/j.foodhyd.2020.106475 Wang, L., Zhang, Y., Xu, M., Wang, Y., Cheng, S., Liebrecht, A., & Qi, X (2013) Anti-diabetic activity of Vaccinium bracteatum Thunb leaves’ polysaccharide in STZ-induced diabetic mice Int J Biol Macromol, 61, 317-321 DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2013.07.028 Williams, G (2013) Possible effects of dietary polyphenols on sugar absorption and digestion Molecular Nutrition & Food Research, 57, 4857 http://dx.doi.org/10.1002/mnfr.201200511 Xiao-Ping, Y., Chun-Qing, S., Ping, Y., & RenGang, M (2010) α-Glucosidase and α-amylase inhibitory activity of common constituents from traditional Chinese medicine used for diabetes mellitus Chinese Journal of Natural Medicines, 8, 349-352 https://doi.org/10.1016/S18755364(10)60041-6 Xiao, W., Han, L., & Shi, B (2008) Microwaveassisted extraction of flavonoids from Radix astragali Separation and Purification Technology, 62(3), 614-618 https://doi.org/10.1016/j.seppur.2008.03.025 Zhenhua, Y., Wei, Z., Fajin, F., Yong, Z., & Wenyi, K., (2014) α-Glucosidase inhibitors isolated from medicinal plants Food Science and Human Wellness, 3, 136-174 https://doi.org/10.1016/j.fshw.2014.11.003 58