2.3.2.1. Chiết bằng dung môi dầu hỏa
Sử dụng phương pháp chiết nóng bằng dung môi dầu hỏa qua 4 giai đoạn:
Giai đoạn 1: Chuẩn bị nguyên liệu.
Sấy dược liệu ở 50-600C đến khối lượng không đổi. Sau đó đem xay thô, rây qua cỡ rây 5 mm.
Giai đoạn 2: Kiềm hóa.
Cân bột dược liệu, làm ẩm bằng nước vôi trong trong 24 giờ. Giai đoạn 3: Chiết bằng dầu hỏa.
Chiết bằng dung môi dầu hỏa theo phương pháp chiết nóng. Tỉ lệ dược liệu/dung môi, nhiệt độ, thời gian, số lần chiết theo khảo sát.
Tiến hành thu dịch chiết, đem lắc với dd H2SO4 0,5% đến pH=2. Lọc, gạn lấy lớp acid rồi đem kiềm hóa bằng dd Na2CO3 bão hòa đến pH= 10-11.
Lọc lấy tủa, rửa bằng nước cất đến pH=7. Thu lấy tủa đem sấy, cân. Lặp đi lặp lại quy trình.
2.3.2.2. Chiết bằng dung môi EtOH 96%
Giai đoạn 1, 2 xử lí dược liệu và kiềm hóa như trên.
Giai đoạn 3: Chiết bằng EtOH 96% bằng phương pháp đun nóng hồi lưu.
Giai đoạn 4: Xử lí dịch chiết thu tủa alcaloid toàn phần.
Thu dịch chiết EtOH 96%, lọc, đem cô tới cắn. Đem lắc với dd H2SO4 0,5% đến pH=2. Loại chất béo bằng dầu hỏa, gạn lấy lớp dưới sau đó đem kiềm hóa bằng dd Na2CO3 bão hòa đến pH= 10-11. Chiết bằng CHCl3, gạn lấy CHCl3 sau đó đem bốc hơi dung môi, cô lấy cắn rồi đem cân.
2.3.3. Phương pháp tinh chế nuciferin
Bước 1: Hòa tan tủa alcaloid toàn phần trong EtOH 96% nóng (1g/26ml).
Bước 2: Tẩy màu bằng than hoạt.
Thêm than hoạt với lượng bằng 5% tủa alcaloid toàn phần tính theo khối lượng. Đun cách thủy trong vòng 10 phút, có khuấy trộn liên tục. Lọc nóng qua phễu Buchner để loại tạp và than hoạt, rửa bã than hoạt bằng EtOH 96%nóng và thu lấy dịch lọc.
Bước 3: Kết tinh sản phẩm.
Gộp dịch lọc và dịch rửa, để kết tinh ở nhiệt độ phòng trong 48-72 giờ. Lọc lấy tinh thể bằng phễu Buchner, rửa tinh thể bằng EtOH 96% lạnh. Để thu được nuciferin tinh khiết, ta đem kết tinh lại trong EtOH 96%.
Lọc, rửa bằng EtOH 96% lạnh, thu lấy tinh thể đem sấy ở nhiệt độ 600C trong 3 giờ thu được sản phẩm.
2.3.4. Kiểm tra độ tinh khiết, khẳng định cấu trúc tinh thể
Để kiểm tra độ tinh khiết của nuciferin sau tinh chế ta dùng phương pháp đo độ chảy và sắc kí lớp mỏng.
+ Đo độ nóng chảy bằng phương pháp đo trong mao quản là kĩ thuật đơn giản, tiến hành nhanh chóng, cho phép sơ bộ định tính và đánh giá mức độ tinh khiết của hợp chất ngay sau giai đoạn kết tinh.
+ Sắc kí lớp mỏng: Sử dụng để kiểm tra sự có mặt của nuciferin trong quá trình chiết tách.
Kiểm tra độ tinh khiết của nuciferin ta triển khai sắc kí lên 3 bản mỏng silicagel tráng sẵn với 3 hệ dung môi khác nhau:
Hệ I: n-Hexan : aceton : amoniac (3 : 1 : 0,1). Hệ II: Cloroform : methanol : amoniac (50 : 10 : 1). Hệ III: Cloroform : ethyl acetat (5 : 1).
Phát hiện vết bằng thuốc thử Dragendorff hoặc soi dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm. Nếu với cả 3 hệ dung môi đều chỉ có một vết trên sắc kí đồ song song với chuẩn liên kết chứng tỏ nuciferin tinh chế được đã tinh khiết.
Khẳng định lại cấu trúc sản phẩm bằng phương pháp phân tích các phổ: phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H- NMR).
+Phổ hồng ngoại (IR) được ghi tại Viện hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam với kĩ thuật viên nén KBr trong vùng 4000 – 400cm-1. Các mẫu rắn được phân tán trong KBr đã sấy khô với tỉ lệ 1:200 rồi được ép dưới dạng film mỏng dưới áp lực cao có hút chân không để loại bỏ hơi ẩm.
+ Phổ khối lượng (MS) ghi tại Viện hóa học và Viện hóa học các hợp chất thiên nhiên - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, sử dụng máy Agilent 6310 Ion Trap.
+Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR) ghi tại Viện hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam trên máy Bruker AV-500.
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Xác định hàm lượng alcaloid toàn phần trong lá sen
Mục đích để tính hiệu suất trong quá trình chiết. Tiến hành định lượng 5 lần theo DĐVN IV. Kết quả thu được ghi trong bảng 3.1.
Bảng 3.1. Hàm lượng alcaloid toàn phần trong lá sen.
Lần mdược liệu (g) Hàm lượng alcaloid toàn phần trong lá sen (%) 1 2,0019 0,8252 2 2,0299 0,9026 3 2,0114 0,8799 4 2,0270 0,8732 5 2,0098 0,8807 Tb 0,8723 SD 0,028573 RSD 3,275499
Nhận xét: Hàm lượng alcaloid toàn phần trong lá sen: 0,8723 ± 0,02%.
3.2. Khảo sát quy trình chiết alcaloid toàn phần từ lá sen.
3.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian chiết
Ta thay đổi thời gian chiết và tiến hành trong cùng điều kiện, cùng dung môi, nhiệt độ, thể tích, số lần chiết. Cụ thể như sau:
Cân 100 g bột lá sen, kiềm hóa trong 24 giờ bằng nước vôi trong. Thêm dung môi vừa đủ ngập dược liệu vào các bình chiết.
Tiến hành như mục 2.3.2.1, chiết trong các khoảng thời gian 2, 3, 4, 5, 6 giờ ở 1000C. Lấy mẫu, cân khối lượng sản phẩm, định lượng theo phương pháp chuẩn độ acid – base, xác định kết quả.
Bảng 3.2. Hàm lượng alcaloid toàn phần và hiệu suất chiết theo thời gian.
Thời gian chiết Hàm lượng alcaloid
toàn phần (g) Hiệu suất chiết (%)
2h 0,4809 55,13
3h 0,6339 72,67
4h 0,6746 77,34
5h 0,6702 76,83
6h 0,6554 75,13
Hình 3.1. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của hiệu suất vào thời gian chiết.
Nhận xét:
Khi chiết từ 2 - 4 giờ, hiệu suất tăng dần do thời gian tiếp xúc giữa nguyên liệu và dung môi ảnh hưởng đến độ hòa tan hoạt chất.
Ở thời gian 5 – 6 giờ, hiệu suất có xu hướng giảm nhẹ. Nguyên nhân là thời gian chiết dài trong nhiệt độ cao làm hoạt chất bị phân hủy, độ tan của tạp tăng, hoạt chất bị lẫn cùng với tạp trong các bước loại tạp tiếp theo.
Từ đồ thị ta lựa chọn thời gian chiết 4 giờ là thích hợp nhất để tiết kiệm thời gian mà vẫn đảm bảo hiệu suất chiết cao.
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 2 3 4 5 6 Hi ệu suấ t (% )
Thời gian (giờ)
55,13
72,67 76,83
77,33
3.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của số lần chiết
Ta khảo sát từ 1-4 lần chiết, tiến hành trong cùng điều kiện nhiệt độ, thời gian. Cụ thể như sau:
Cân 100 g bột lá sen, kiềm hóa trong 24 giờ bằng nước vôi trong. Thêm dung môi vừa đủ ngập dược liệu vào các bình chiết.
Tiến hành chiết như mục 2.3.2.1. Cứ trong một khoảng thời gian xác định như đã khảo sát ở trên, rút dịch chiết rồi đổ dung môi mới vào bình chiết, lặp lại 4 lần như thế. Xử lí dịch chiết, cân khối lượng sản phẩm, định lượng theo phương pháp chuẩn độ acid – base, xác định kết quả.
Mỗi mẫu làm 2 lần, lấy kết quả trung bình.
Bảng 3.3. Hàm lượng alcaloid toàn phần và hiệu suất chiết theo số lần chiết.
Số lần chiết Thể tích dung môi mỗi lần chiết (lít)
Hàm lượng alcaloid toàn phần (g)
Hiệu suất chiết (%) 1 1,4 0,5091 58,36 2 1,4; 1,0 0,6841 78,42 3 1,4; 1,0; 1,0 0,7723 88,53 4 1,4; 1,0; 1,0; 1,0 0,7784 89,23
Hình 3.2. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của hiệu suất vào số lần chiết.
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 1 2 3 4 Số lần 58,36 78,42 88,5 89,23
Nhận xét:
Chiết lần 1 cho hiệu suất chiết xuất alcaloid toàn phần thấp vì dung môi nằm lại trong dược liệu.
Khi tăng số lần chiết, hiệu suất tăng do dược liệu được tiếp xúc với dung môi mới.
Từ đồ thị, ta thấy chiết lần 3 và lần 4 độ chênh lệch không đáng kể. Vì vậy, lựa chọn tiến hành chiết 3 lần sẽ tiết kiệm dung môi, thời gian, hóa chất, hiệu suất cao.
3.3.3. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ chiết
Để khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hiệu suất, ta thay đổi nhiệt độ chiết, tiến hành trong cùng điều kiện dung môi, thể tích, số lần chiết, thời gian chiết. Cụ thể như sau:
Cân 100g bột lá sen, kiềm hóa trong 24 giờ bằng nước vôi trong. Thêm dung môi vừa đủ ngập dược liệu vào các bình chiết.
Tiến hành chiết như mục 2.3.2.1 ở các nhiệt độ 250C, 500C, 750C, 1000C với các thông số điều kiện theo khảo sát ở trên. Lấy mẫu, cân khối lượng sản phẩm, định lượng theo phương pháp chuẩn độ acid – base, xác định kết quả.
Mỗi mẫu làm 2 lần lấy kết quả trung bình.
Bảng 3.4. Hàm lượng alcaloid toàn phần và hiệu suất chiết theo nhiệt độ.
Nhiệt độ chiết Hàm lượng alcaloid toàn phần (g)
Hiệu suất chiết (%)
250C 0,2577 29,54
500C 0,3902 44,73
750C 0,5021 57,56
Hình 3.3. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của hiệu suất vào nhiệt độ chiết.
Nhận xét:
Nhiệt độ chiết xuất ảnh hưởng lớn đến hàm lượng alcaloid toàn phần. Ở 250C, alcaloid tan ít trong dầu, khối lượng alcaloid chiết được thấp. Nhiệt độ tăng lên, độ nhớt dung môi giảm, hệ số khuếch tán và độ tan của hoạt chất tăng, lượng alcaloid thu được nhiều hơn. Nếu t0 > 1000C, độ tan tạp tăng gây khó khăn cho quá trình tinh chế. Ngoài ra, một số phân đoạn của dung môi bị bốc hơi, dễ gây cháy nổ, trong công nghiệp càng ở nhiệt độ thấp càng tốt nên ta không khảo sát ở nhiệt độ lớn hơn 1000C.
Qua đồ thị trên, ta thấy ở 1000C hiệu suất lớn nhất nên lựa chọn điều kiện 1000C để tiến hành chiết xuất.
3.3. So sánh phương pháp chiết bằng dung môi dầu hỏa và EtOH 96%
3.3.1. So sánh độ tan
Do điều kiện nghiên cứu, tiến hành so sánh độ tan của nuciferin sử dụng phương pháp đo quang UV. Để xác định độ tan của nuciferin trong dầu hỏa và trong EtOH 96%ta làm như sau:
Cân 1 lượng dư nuciferin chuẩn, đưa vào ống nghiệm chứa 5ml dung môi cần xác định độ tan. Siêu âm trong 30 phút để tạo dung dịch quá bão hòa (có gia nhiệt theo điều kiện khảo sát), lọc qua màng 0,45 µm. Pha loãng bằng
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 25 50 75 100 Nhiệt độ chiết (0C) 29,54 44,73 57,56 88,11
EtOH 96% sao cho nồng độ nằm trong khoảng tuyến tính đã khảo sát, tiến hành định lượng bằng đo quang, từ đường thẳng tuyến tính xác định được nồng độ sau pha loãng, từ đó xác định được độ tan S (mg/ml).
S = Cthử × f × 10-3 Cthử: nồng độ sau khi pha loãng (µg/ml). f: hệ số pha loãng.
3.3.1.1. Xác định khoảng tuyến tính
Quét phổ dung dịch chuẩn nuciferin trong khoảng bước sóng 200 đến 400 nm, thu được bước sóng cực đại tại 217 nm và 270nm. Lựa chọn bước sóng 270 nm để tiến hành định tính và định lượng nuciferin.
Bảng 3.5. Độ hấp thụ của dung dịch nuciferin trong EtOH 96% ở 270 nm
Nồng độ (µg/ml) 6 8 10 12 14
Độ hấp thụ 0,384 0,497 0,622 0,752 0,881
Hình 3.4. Đồ thị biểu thị mối quan hệ giữa nồng độ và độ hấp thụ
Nhận xét: Ở khoảng nồng độ từ 6-14 µg/ml, hệ số tương quan gần bằng 1, chứng tỏ có sự phụ thuộc tuyến tính giữa độ hấp thụ và nồng độ nucifein. Vì vậy, có thể sử dụng phương pháp đo quang để tiến hành định lượng nuciferin. y = 0.1249x + 0.2525 R² = 0.9993 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 6 8 10 12 14 Độ hấ p thụ Nồng độ (µg/ml)
3.3.1.2. Kết quả đo độ tan
Bảng 3.6. Độ tan của nuciferin trong dầu hỏa và trong EtOH 96%.
Dung môi Dầu hỏa EtOH 96%
250C 1000C 250C 780C
Độ tan (mg/ml) 7,71 19,89 12,05 38,06
Nhận xét: Độ tan của nuciferin trong dầu hỏa thấp hơn độ tan của nuciferin trong EtOH 96% ở cả nhiệt độ phòng và nhiệt độ chiết.
3.3.2. So sánh hiệu suất
Tiến hành chiết xuất để so sánh 2 dung môi dầu hỏa và EtOH 96% theo mục 2.2.2 với các điều kiện như đã khảo sát, phương pháp đun nóng hồi lưu.
Bảng 3.7. So sánh 2 phương pháp chiết xuất bằng dung môi EtOH 96% và dung môi dầu hỏa.
Dung môi EtOH 96%
(780C)
Dầu hỏa (1000C) Cảm quan alcaloid toàn phần Màu nâu Màu vàng
SKLM (Hệ dung môi khai triển
CHCl3:MeOH:NH4OH = 50:9:1) Hiện màu bằng thuốc thử
Bouchardat
Khối lượng tủa thu được (g) 0,72 0,84 Hàm lượng alcaloid toàn phần (%) 94,40 90,31
Khối lượng alcaloid toàn phần (g) 0,6797 0,7586 Hiệu suất chiết (%) 77,92 86,97
Nhận xét:
Hiệu suất chiết bằng dầu hỏa cao hơn hiệu suất chiết bằng EtOH 96%. Phương pháp chiết bằng dung môi EtOH 96%
- Ưu điểm:
+ Là dung môi rẻ tiền, dễ kiếm, không độc. - Nhược điểm:
+ Quá trình xử lí dịch chiết phải qua nhiều công đoạn.
+ EtOH 96% hòa tan nhiều chất khác ngoài alcaloid. Sau khi kiềm hóa bằng dd Na2CO3 bão hòa để tạo tủa, trong dung dịch vẫn còn sáp, nhựa… nên rất nhớt, không thu được bằng phương pháp lọc như khi chiết bằng dầu hỏa, phải dùng cloroform để chiết lấy tủa base. Cloroform là một dung môi độc, dễ bay hơi, dễ gây cháy nổ, khó ứng dụng để sản xuất trên quy mô công nghiệp.
+ Sau khi thu dịch chiếtphải cô đến cắn, mất rất nhiều thời gian. Phương pháp chiết bằng dung môi dầu hỏa
- Ưu điểm: + Đơn giản.
+ Là dung môi chọn lọc thường dùng để chiết alcaloid, ít tạp, không tốn thời gian, dễ tinh chế để thu nuciferin tinh khiết.
+ Dung môi dễ kiếm, có thể thu hồi để sử dụng lại. - Nhược điểm :
+ Dung môi dễ gây cháy nổ, phải đun nóng khi chiết.
* Với những phân tích trên, ta chọn dầu hỏa làm dung môi chiết alcaloid toàn phần từ lá sen là phù hợp.
3.4. Tinh chế nuciferin
Tiến hành chiết 2 kg lá sen khô với các thông số điều kiện đã khảo sát ở trên, lượng dung môi cho vào vừa đủ ngập dược liệu.
Tiến hành tinh chế theo mục 2.3.4.1 và lấy nuciferin tinh chế được đem định lượng bằng HPLC theo mục 2.3.1.3.
Bảng 3.8. Khối lượng alcaloid toàn phần thu được, hàm lượng nuciferin và hiệu suất tinh chế.
Lần 1 Lần 2
Khối lượng dược liệu (kg) 2 2
Khối lượng tủa thu được (g) 13,18 12,67 Hàm lượng alcaloid toàn phần (%) 98,40 99,42 Hàm lượng nuciferin trong alcaloid toàn phần (%) 65,3 63,6 Khối lượng tinh thể nuciferin (g) 6,00 5,98 Hàm lượng nuciferin trong sản phẩm (%) 91,56 95,40 Hiệu suất chiết xuất (%) 74,33 72,20
Hiệu suất tinh chế (%) 62,80 70,80
* Đánh giá:
Về cảm quan, sản phẩm nuciferin có dạng bột kết tinh, hơi vàng.
Kết quả HPLC thu được trên sắc kí đồ của dung dịch nuciferin chuẩn và dung dịch nuciferin tinh chế đều có 1 pic rửa giải ở phút 25,877 chứng tỏ nuciferin tinh chế được không lẫn các alcaloid khác.
Hình 3.6. Sắc kí đồ của mẫu nuciferin tinh chế (100 µg/ml).
Hình 3.7. Sắc kí đồ của mẫu alcaloid toàn phần (100 µg/ml).
3.5. Đánh giá độ tinh khiết, khẳng định cấu trúc sản phẩm.
Nhiệt độ nóng chảy: 164 - 1650C phù hợp với tài liệu tham khảo. Sắc kí lớp mỏng: Triển khai với 3 hệ dung môi khác nhau
Hệ I: n-Hexan : aceton : amoniac (3 : 1 : 0,1). Hệ II: Cloroform : methanol : amoniac (50 : 10 : 1).
Hệ III: Cloroform : ethyl acetat (5 : 1).
Phát hiện vết bằng thuốc thử Dragendorff hoặc soi dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm.
Hệ I Hệ II Hệ III
Hình 3.8. Sắc kí đồ nuciferin tinh chế được với các hệ dung môi.
Kết quả:
Rf (hệ I) = 0,40 Rf (hệ II) = 0,83 Rf (hệ III) = 0,24
Với cả 3 hệ dung môi đều chỉ có một vết trên sắc kí đồ tương ứng với chuẩn chứng tỏ nuciferin tinh chế được đã tinh khiết.
Khẳng định cấu trúc sản phẩm bằng các phổ: phổ hồng ngoại (IR), phổ khối (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR).
Bảng 3.9. Kết quả phân tích phổ hồng ngoại của nuciferin (IR, KBr)
nuciferin Nhóm chức Đỉnh hấp thụ đặc trưng (ῡ, cm-1) =C-H (thơm) 3010 -C-H (no) 2958, 2838