Nhiệt độ nóng chảy: 164 - 1650C phù hợp với tài liệu tham khảo. Sắc kí lớp mỏng: Triển khai với 3 hệ dung môi khác nhau
Hệ I: n-Hexan : aceton : amoniac (3 : 1 : 0,1). Hệ II: Cloroform : methanol : amoniac (50 : 10 : 1).
Hệ III: Cloroform : ethyl acetat (5 : 1).
Phát hiện vết bằng thuốc thử Dragendorff hoặc soi dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm.
Hệ I Hệ II Hệ III
Hình 3.8. Sắc kí đồ nuciferin tinh chế được với các hệ dung môi.
Kết quả:
Rf (hệ I) = 0,40 Rf (hệ II) = 0,83 Rf (hệ III) = 0,24
Với cả 3 hệ dung môi đều chỉ có một vết trên sắc kí đồ tương ứng với chuẩn chứng tỏ nuciferin tinh chế được đã tinh khiết.
Khẳng định cấu trúc sản phẩm bằng các phổ: phổ hồng ngoại (IR), phổ khối (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR).
Bảng 3.9. Kết quả phân tích phổ hồng ngoại của nuciferin (IR, KBr)
nuciferin Nhóm chức Đỉnh hấp thụ đặc trưng (ῡ, cm-1) =C-H (thơm) 3010 -C-H (no) 2958, 2838 C=C (thơm) 1591, 1497, 1452 C-O-C 1243 C-N 1104
Trên phổ hồng ngoại của sản phẩm chiết xuất xuất hiện các giải hấp thụ đặc trưng của các nhân thơm: C-H thơm đặc trưng tại 3010 cm-1, C=C thơm tại 1591, 1497 và 1452 cm-1. Các liên kết ether C-O cho giải hấp thụ đặc trưng xung quanh 1243 cm-1. C-N (amin no bậc 3) cho đỉnh hấp thụ tại 1104 cm-1.
Bảng 3.10. Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton
Nuciferin Độ chuyển dịch hóa học (δ, ppm) Dạng proton 2,34 (2H, m, H-4) Ar-CH2 2,42 (3H, s, H-3’) N-CH3 2,63 (1H, d, J = 15,5 Hz, H-7α) Ar-CH2- 2,82 (1H, dd, J1 = 4,0 Hz, J2 = 14,0 Hz, H-6a) N-CH- 2,96 (2H, m, H-5) N-CH2- 3,13 (1H, dd, J1 = 3,5 Hz, J2 = 14,0 Hz, H-7β) Ar-CH2- 3,57 (3H, s, H-2’) O-CH3 3,80 (3H, s, H-1’) O-CH3 6,77 (1H, s, H-3) =CH thơm 7,22 (1H, m, H-10) =CH thơm 7,27 (2H, m, H-8, H-9) =CH thơm 8,16 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-11) =CH thơm
Ghi chú: s - singlet, d - doublet, m - multiplet, Ar - nhân thơm.
Trên phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton của sản phẩm xuất hiện các tín hiệu đặc trưng của 2 nhân thơm nuciferin, trong đó proton tại carbon số 11 (H-11) có độ chuyển dịch hóa học trong trường yếu nhất (8,16 ppm) dưới dạng doublet với hằng số tương tác 7,5 Hz (ortho với H-10). Proton thơm H-3
đứng độc lập - không tương tác với các vị trí xung quanh - nên cho tín hiệu singlet tại 6,77 ppm. Hai nhóm methyl gắn với oxy có độ chuyển dịch hóa học là 3,57 và 3,80 ppm. Trong khi đó tín hiệu của nhóm methyl gắn với nitơ xuất hiện ở 2,42 ppm. Bộ tín hiệu của các proton còn lại trong cấu trúc của nuciferin đều quan sát thấy trên phổ. Tín hiệu do dung môi DMSO xuất hiện ở 2,50 ppm. Trên phổ cũng quan sát thấy tín hiệu của tạp nước trong DMSO với độ chuyển dịch hóa học là 3,36 ppm.
Trên phổ khối lượng quan sát thấy pic phân tử là: [M+H]+ (m/z 296,0). Điều này phù hợp với công thức phân tử của sản phẩm dự kiến là C19H21NO2 (M = 295,38).
3.6. Đề xuất quy trình chiết xuất alcaloid toàn phần và tinh chế nuciferin
3.6.1. Sơ đồ quy trình
Hình 3.9. Sơ đồ chiết xuất alcaloid toàn phần và tinh chế nuciferin.
Lá sen khô
Bột đã kiềm hóa kiềm hóa
24h Nước vôi
Dầu hỏa Chiết nóng
Bã dược liệu dd H2SO4 0,5% Lắc, pH=2 =2 Để phân lớp, gạn Lọc tủa dd Na2CO3 bh Alc tp/ EtOH EtOH 96% Than hoạt Cách thủy,hòa tan
Tẩy màu, cách thủy Khuấy trộn
Khuấy trộn
Sấy, xay, cân
pH = 10-11 =2 Lọc, để kết tinh Sấy Dung môi Thu hồi Nước cái Lọc Nước cái Bã than hoạt Tủa alc tp
Pha nước acid Dịch chiết Bột lá sen Tinh thể nuciferin Khuấy trộn EtOH 96% Nuciferin/ EtOH 96% Nuciferin thô Cách thủy, hòa tan
Sản phẩm nuciferin Để kết tinh, lọc
Nuciferin/EtOH
3.6.2. Mô tả quy trình
Lá sen khô được sấy ở 600C, đem xay thành bột thô, rây qua cỡ rây 5mm. Cân khoảng 1kg bột dược liệu, làm ẩm bằng nước vôi trong trong 24h. Cho bột dược liệu đã được kiềm hóa vào bình chiết, chiết bằng dung môi dầu hỏa theo phương pháp chiết nóng.Thời gian chiết: 4h, số lần chiết: 3 lần, cho dung môi ngập dược liệu.
Thu dịch chiết, đem lắc với dd H2SO4 0,5% đến khi pH=2. Khuấy mạnh trong 15 phút rồi để yên cho phân lớp, gạn lấy lớp acid, lớp dung môi có thể thu hồi sử dụng cho lần chiết sau. Lọc dịch acid rồi đem kiềm hóa bằng dd Na2CO3 bão hòa đến pH=10-11, để yên cho kết tủa hết.Lọc hút chân không qua phễu Buchner, rửa tủa bằng nước cất đến pH=7. Loại bỏ nước cái và nước rửa, thu lấy tủa đem sấy.
Hình 3.11. Hình ảnh alcaloid toàn phần.
Hòa tan tủa alcaloid toàn phần trong EtOH 96% nóng (1g/26ml). Thêm than hoạt với lượng bằng 5% tủa alcaloid toàn phần tính theo khối lượng. Đun cách thủy trong vòng 10 phút, có khuấy trộn liên tục. Lọc nóng qua phễu
Buchner để loại tạp và than hoạt, rửa bã than hoạt bằng EtOH 96%nóng và thu lấy dịch lọc. Gộp dịch lọc và dịch rửa, để kết tinh ở nhiệt độ phòng trong 48 -72 giờ. Lọc lấy tinh thể bằng phễu Buchner, rửa tinh thể bằng EtOH 96% lạnh. Để thu được nuciferin tinh khiết, ta đem kết tinh lại trong EtOH 96%. Lọc, rửa bằng EtOH 96% lạnh, thu lấy tinh thể đem sấy ở nhiệt độ 600C trong 3 giờ thu được sản phẩm.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN
Từ kết quả thu được, chúng tôi rút ra những kết luận:
1. Đã khảo sát và xây dựng được phương pháp chiết xuất alcaloid toàn phần từ lá sen bằng dung môi dầu hỏa với các thông số như sau:
Số lần chiết: 3 lần. Nhiệt độ chiết: 1000C. Thời gian chiết: 4 giờ.
2. Đã xây dựng được phương pháp phân lập nuciferin từ lá sen đơn giản bằng EtOH 96% cho sản phẩm có độ tinh khiết cao, được khẳng định bằng HPLC, điểm chảy, sắc kí lớp mỏng, phổ IR, phổ MS, phổ 1H-NMR.
KIẾN NGHỊ
Vì điều kiện trang thiết bị và thời gian có hạn, chúng tôi mới chỉ thực hiện nghiên cứu trên quy mô phòng thí nghiệm. Để ứng dụng vào thực tế sản xuất, cần tiếp tục triển khai nghiên cứu trên quy mô lớn hơn dựa trên phương pháp chiết xuất và tinh chế nuciferin đã xây dựng được.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
1. Bộ môn công nghiệp dược (2006), Kỹ thuật sản xuất dược phẩm,
Trường đại học Dược Hà Nội, tập I, trang 204 – 211.
2. Bộ y tế (2007), Dược liệu học, nhà xuất bản Y học, tập 2, trang 116- 119.
3. Bộ y tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, nhà xuất bản Y học, Hà Nội,
trang 883-884.
4. Đỗ Huy Bích và các tác giả (2004), Cây thuốc và động vật làm thuốc
Việt Nam, nhà xuất bản khoa học kĩ thuật, Hà Nội, trang 721 - 726.
5. Lê Thị Hằng (2009), Nghiên cứu định lượng nuciferin trong lá sen và một số chế phẩm từ lá sen, Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại học,
Trường đại học Dược Hà Nội.
6. Đỗ Tất Lợi (2005), “Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam”, nhà xuất bản Y học, Hà Nội, trang 783-786.
7. Hoàng Thị Tuyết Nhung (2012), Nghiên cứu chiết xuất và tinh chế conessin, keampferol, nuciferin từ dược liệu làm chất chuẩn đối chiếu trong kiểm nghiệm thuốc, Luận án tiến sĩ dược học, Đại học Dược Hà
Nội.
8. Nguyễn Thị Nhung (2001), Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần
hóa học và tác dụng sinh học của cây sen Nelumbo nucifera, họ Sen ở Việt Nam, Luận án tiến sĩ dược học, Đại học Dược Hà Nội.
9. Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ, Tô Yến Ngọc, Trần Hùng, Nguyễn Đức Tuấn (2013), “Xây dựng quy trình định lượng đồng thời nuciferin, pronuciferin, o-nuciferin và isoliensinin trong lá sen bằng phương pháp HPLC với đầu dò PDA”, Tạp chí Dược học – 05/2013, (445), trang 27 – 31.
10.Nguyễn Thị Kiều Trang (2009), Nghiên cứu quy trình điều chế nuciferin từ lá sen, Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại học, Đại học Dược
Hà Nội.
Tài liệu tiếng Anh
11. Bo Huang, Xiaoquan Ban, Jingsheng He, Jing Tong, Jun Tian, Youwei Wang (2009), “Hepatoprotective and Antioxidant activity of ethanolic extracts of edible lotus (Nelumbo nucifera Gaertn) leaves”, Food Chemistry, 120(3), p. 873-878.
12. Bo Huang, Xiaoquan Ban, Jingsheng He, Jing Tong, Jun Tian, Youwei Wang (2010), “Antioxidant activity of bovine and porcine meat treated with extracts from edible lotus (Nelumbo nucifera) rhizome knot and leaf”, Meat. Science, 87(1), p. 46-53.
13. Cheng L.M., Hsuan K.S., Jun C.P.,Chuan C.K., Yuan Y.M., Jong W.C. (2009), “Improvement foe High Fat Diet-Induce Hepatic Injuries and Oxidative Stress by Flavonoid – Enriched Extract from Nelumbo nucifera Leaf”, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 57(3), p. 5925 - 5932.
14. Hoa Nguyen, Nhan Ta, Hong Minh Pham, Tien Nguyen, Dien Pham, Suresh Mishra, Gre ´goire Nyomba (2012), “Nuciferine stimulates insulin secretion from beta cells—An in vitro comparison with glibenclamide”, Journal of Ethnopharmacology, (142), p. 488 - 495. 15. K-Mo J, Yoshika Y, Tanaka S, Imori Y, Isor K, Masada Y, Hashimo K
and Inouei T (1973), “Alkaloids of Nelumbo nucifera”,
Phytochemistry, p. 699 - 701.
16. Jiang-Ning Hu, Bin Shan, Ze-Yuan Deng, Jing Li, Ya-Wei Fan, Zheng Ruan, and Rong Liu (2010), “Application of High-speed Counter- current Chromatography for the isolation of 5 alkaloids from Lotus
(Nelumbo nucifera Gaertn.) leaves”, Food Sci. Biotechnol, 19(6),
p.1661-1665
17. Juan Xiao, Binqiang Tian, Bijun Xie, Erning Yang, John Shi, Zhida Sun (2010), “Supercritical fluid extraction and identification of isoquinoline alkaloids from leaves of Nelumbo nucifera Gaertn”, Eur Food Res Technol, (231), p. 407 - 414.
18. Ming – Jiuan Wu, Lisu Wing, Ching – Yi Weng, “ Antioxidant activity of methanol extract of the Lotus leaf (Nelumbo nucifera Gernt)”, The American journal of Chinese medicine, (31), p. 687 – 698.
19. Nishkruti R Mehta, Ekta P Patel, Pragnesh V Patani, Biren Shah, “Nelumbo Nucifera (Lotus): A Review on Ethanobotany, Phytochemistry and Pharmacology”, Indian J.Pharm.Biol.Res. 2013,
1(4), p.152-167.
20. Saranya Sivan P.S, Arjun P, Mohana Priya S, Krishnamoorthy M and Balasubramanian K (2012), “Phytochemical analysis and anticancer activity of Nelumbo nucifera extracts”, Research manuscript, p. 81-85. 21. Wang GH, Zhang BX, Nie QX, Li H, Zang C (2008), “Optimal
extraction of nuciferin and flavone from lotus leaf based on central composite design and response methodology”, Zhongguo Zhong Yao Za Zhi, (20), p. 2332 - 2335.
22. Wenyan Ma, Yanbin Lu, Ruilin Hu, Jihang Chen, Zizhang Zhang, Yuanjiang Pan (2010), “Application of ionic liquids based microwave- assisted extraction of three alkaloids N-nornuciferine, O-nornuciferine, and nuciferine from lotus leaf”, Talanta, (80), p. 1292–1297.
23. Yoshiki Kashiwada, Akihiro Aoshima, Yasumasa Ikeshiro, Yuh-Pan Chen, Hiroshi Furukawa, Masataka Itoigawa, Toshihiro Fujioka, Kunihide Mihashi, Mark Cosentino, Susan L. Morris-Natschke and
Kuo-Hsiung Lee (2004), “anti HIV benzylisoquinoline alkaloids and flavonoids from the leaves of Nelumbo nucifera and structure-activity corelations with related alkaloids”, Bioorganic Medicinal Chemistry,
13(2), p. 443 - 448.
PHỤ LỤC
Phụ lục 1: Phổ hồng ngoại (IR) của nuciferin. Phụ lục 2: Phổ khối lượng (MS) của nuciferin.
Phụ lục 3: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H – NMR) của nuciferin. Phụ lục 4: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân mở rộng của nuciferin. Phụ lục 5: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân mở rộng của nuciferin.