Tuynhiên những nghiên cứu này thường giới hạn hoặc với dung môi nước nên hiệu quảchiết tách còn hạn chế, hoặc sử dụng các kỹ thuật hiện đại chi phí đầu tư cao, khó ápdụng trong điều kiện
Trang 1TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÀ RỊA - VŨNG TÀU
BÁO CÁO
ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG
NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH HỢP CHẤT POLYPHENOL TRONG LÁ CHÈ XANH TRỒNG TẠI TỈNH BÀ RỊA VŨNG TÀU VÀ NGHIÊN CỨU
ỨNG DỤNG TRONG DƯỢC MỸ PHẨM
Chủ nhiệm đề tài: Sinh viên: Tống Thị Ngọc Bé, lớp DH15HC
đồng hướng dẫn TS Nguyễn Thị Tuyết
BÀ RỊA - VŨNG TÀU, tháng 07, năm 2019
Trang 2- Đã tìm được điều kiện tối ưu cho quá trình chiết polyphenol từ lá chè xanh là:
Nồng độ dung môi ethanol 70%, tỉ lệ Nguyên liệu/Dung môi là 1/25, nhiệt độ chiết 65 OC, thời gian: 35 phút
- Hàm lượng polyphenol tổng cao nhất trong lá chè (Loại lá thứ 2, 3, 4) là20,79%, có hỗ trợ enzym Cenlulozo 2,5% v/w thì hàm lượng polyphenol tổng là22,07% với hiệu suất chiết tăng 1,1 lần; pectinase 3% thì hàm lượng polyphenol tổng
là 20,79% và hiệu suất tăng 1,04 lần
Hàm lượng polyphenol cao nhất ở nụ lá 21,94% và thấp nhất ở lá chè già 17%.Khi sấy cao chiết lá chè ở nhiệt độ 120 oC thì hàm lượng polyphenol còn rất thấp 1,41%
Trang 3cao tới hàm lượng polyphenol tổng và đồng thời giữ được mà và mùi vị ban đầu của lá chè.
- Hoạt tính oxy hóa của dịch chiết polyphenol lá chè cao hơn rất nhiều so với các loại lá khác (Lá neem, lá lô hội, lá xoài) và tăng dần theo nồng độ
- Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết lá chè kháng được cả 5 chủng vi khuẩnEscherichia coli, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa vàSalmonella typhi dù ở nồng độ rất thấp (100 – 800 mg/ml)
- Sau khi mẫu chiết được đo bằng HPLC ta nhận thấy dịch chiết lẫn tạp chấtkhông đáng kể, vì vậy chúng ta nên tách Polyphenol trong chế phẩm ở dạng tinh khiết
để ứng dụng nó trong một số lĩnh vực nhằm đạt được giá trị cao về mặt kinh tế
- Xây dựng được quy trình điều chế Kem dưỡng da từ Cao polyphenol (quy mô phòng thí nghiệm)
5 Thời gian nghiên cứu: Từ 12/03/2018 đến 12/06/2019
6 Chữ ký của CNĐT:………
Trang 4DANH MỤC BẢNG ii
DANH MỤC HÌNH iii
DANH MỤC SƠ ĐỒ iv
MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5
1.1 Giới thiệu chung về cây chè 5
1.1.1 Nguồn gốc và sự phân bố của cây chè 5
1.1.2 Phân loại 5
1.1.3 Tình hình sản xuất chè ở Việt Nam 6
1.1.4 Thành phần hóa học cơ bản của lá chè 6
1.1.5 Dược tính của chè 8
1.2 Polyphenol trong chè 9
1.2.1 Nguồn gốc chuyển hóa và phân loại các hợp chất phenolic thực vật 9
1.2.2 Các hợp chất Polyphenol có trong chè 10
1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng polyphenol/catechin trong lá chè 16
1.2.4 Phương pháp định tính, định lượng polyphenol trong lá chè 17
1.2.5 Hoạt tính sinh học của polyphenol chè 22
1.3 Một số khái niệm về trích ly và các phương pháp trích ly polyphenol trong chè 24
1.3.1 Bản chất của quá trình trích ly 24
1.3.2 Các phương pháp trích ly 24
1.4 Ảnh hưởng của các yếu tố công nghệ đến hiệu suất trích ly và chất lượng của sản phẩm 28
1.4.1 Ảnh hưởng của dung môi và nồng độ dung môi 28
1.4.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly 30
1.4.3 Ảnh hưởng của thời gian trích ly 30
1.4.4 Ảnh hưởng của pH 31
1.4.5 Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/nguyên liệu 31
1.4.6 Quy trình trích ly polyphenol từ chè xanh 32
Trang 51.5.1.Giới thiệu một số loài vi khuẩn 33
1.5.2 Các phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn 42
1.5 Phương pháp Sấy thăng hoa 44
CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM 46
2.1 Nguyên vật liệu nghiên cứu 46
2.1.1 Nguyên liệu chè 46
2.1.2 Chủng vi sinh vật 46
2.1.3 Hóa chất, thiết bị 46
2.2 Định lượng polyphenol tổng số theo phương pháp Folin-Denis 47
2.2.1 Phương pháp xác định hàm lượng polyphenol tổng số 47
2.2.2 Phương pháp xây dựng đường chuẩn axit gallic 48
2.3 Khảo sát quy trình chiết tách polyphenol từ lá chè 49
2.3.1 Khảo sát ảnh hưởng của các thông số công nghệ 49
2.3.2 Một số quy trình khảo sát khác 52
2.3.3 Khảo sát quy trình chiết tách polyphenol lá chè bằng dung môi có hỗ trợ enzym 52
2.3.4 Ảnh hưởng của độ ẩm và độ già của lá 53
2.3.5 Quy trình tinh chế polyphenol từ cao chiết lá chè 53
2.4 Định tính, định lượng polyphenol trong cao chiết lá chè 54
2.4.1 Định tính một số hợp chất hữu cơ có trong dịch chiết lá chè bằng thuốc thử 54
2.4.2 Định tính polyphenol bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) 56
2.4.3 Định tính bằng UV-VIS 56
2.4.4 Định tính và định lượng polyphenol bằng HPLC 57
2.5 Xác định hoạt tính sinh học của dịch chiết chè 57
2.5.1 Xác định hoạt tính kháng oxi hóa của dịch chiết chè 57
2.5.2 Xác định hoạt tính kháng khuẩn 58
2.6 Khảo sát các quy trình quy trình sấy 61
2.6.1 Sấy nhiệt độ cao 61
2.6.2 Sấy thăng hoa 61
Trang 6CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 64
3.1 Kết quả tối ưu hóa điều kiện chiết tách polyphenol của lá chè 64
3.1.1 Xây dựng phương trình đường chuẩn gallic khảo sát các yếu tố công nghệ 64
3.1.2 Xây dựng phương trình đường chuẩn gallic khảo sát ảnh hưởng của enzym 65
3.1.3 Xây dựng phương trình đường chuẩn gallic khảo sát hoạt tính oxy hóa 65
3.2 Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố công nghệ đến hiệu suất thu hồi polyphenol 66
3.2.1 Ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến hàm lượng polyphenol tổng 66
3.2.2 Ảnh hưởng của thời gian đến hàm lượng polyphenol tổng 67
3.2.3 Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi đến hàm lượng polyphenol tổng 68 3.2.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng polyphenol tổng 69
3.2.5 Ảnh hưởng của PH đến hàm lượng polyphenol tổng 70
3.3 Ảnh hưởng của độ ẩm và độ non già của lá tới hàm lượng polyphenol tổng trong cao chiết lá chè 71
3.4 Ảnh hưởng của một số quy trình chiết khác 72
3.5 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của enzym đối với hiệu quả chiết tách polyphenol 73
3.5.1 Ảnh hưởng của enzym cenlulozo đối với quá trình chiết tách polyphenol 73
3.5.2 Ảnh hưởng của enzym pectinase đối với quá trình chiết tách polyphenol 74
3.6 Ảnh hưởng của quá trình tinh chế polyphenol đến hàm lượng polyphenol tổng 75
3.7 Kết quả định tính, định lượng polyphenol trong lá chè 76
3.7.1 Định tính các hợp chất trong lá chè bằng thuốc thử 76
3.7.2 Định tính bằng TLC 77
3.7.3 Định tính bằng UV – VIS 78
3.7.4 Định lượng polyphenol lá chè bằng HPLC 79
3.8 Kết quả khảo sát hoạt tính sinh học của lá chè 80
3.8.1 Kết quả hoạt tính oxy hóa 80
3.8.2 Hoạt tính kháng khuẩn 82
3.9 Kết quả khảo sát quy trình lưu mẫu và sấy cao chiết lá chè 85
Trang 7chiết lá chè
3.9.3 Sấy thăng hoa cao chiết lá chè 87
3.10 Ứng dụng sản phẩm kem dưỡng da 89
CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 92
4.1 Kết luận 92
4.2 Kiến nghị 93
TÀI LIỆU THAM KHẢO 94
Trang 9Bảng 1 1: Sự hấp thụ của dung dịch theo màu 21
Bảng 3 1: Phương trình đường chuẩn axit gallic 64
Bảng 3 2: Phương trình đường chuẩn axit gallic 65
Bảng 3 3: Phương trình đường chuẩn axit gallic 65
Bảng 3 4: Ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến hàm lượng polyphenol tổng 66
Bảng 3 5: Ảnh hưởng của thời gian đến hàm lượng polyphenol tổng 67
Bảng 3 6: Ảnh hưởng của tỷ lệ Nguyên liệu/Dung môi đến hàm lượng polyphenol tổng 68
Bảng 3 7: Ảnh hưởng của tỷ lệ nhiệt độ đến hàm lượng polyphenol tổng 69
Bảng 3 8: Ảnh hưởng của PH đến hàm lượng polyphenol tổng 70
Bảng 3 9: Khảo sát Ảnh hưởng của độ ẩm và độ non già của lá 71
Bảng 3 10: Khảo sát một số quy trình chiết khác 72
Bảng 3 11: Khảo sát Ảnh hưởng của enzym cenlulozo đối với quá trình chiết tách polyphenol 73
Bảng 3 12: Khảo sát Ảnh hưởng của enzym pectinase đối với quá trình chiết tách polyphenol 74
Bảng 3 13: Khảo sát Ảnh hưởng của quá trình tinh chế polyphenol 76
Bảng 3 14: Kết quả khảo sát định tính các nhóm chất 77
Bảng 3 15: Biểu đồ ảnh hưởng của quá trình tinh chế polyphenol 78
Bảng 3 16: Kết quả đo bước sóng của dịch chè sau khi tinh chế 78
Bảng 3 17: Hàm lượng các chất trong polyphenol 79
Bảng 3 18: Kết quả sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC 80
Bảng 3 19: Độ hấp thụ quang của cao các loại lá ở cùng nồng độ 81
Bảng 3 20: Kết quả lực kháng oxy hoá theo nồng độ 81
Bảng 3 21: Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết lá chè 83
Bảng 3 22: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng polyphenol 86
Bảng 3 23: Chỉ tiêu đánh giá cảm quan kem dưỡng da 90
Trang 10Hình 1 1: Lá chè tại Xã Suối Nghệ, Tân Thành, tỉnh BR-VT 5
Hình 1 2: Công thức cấu tạo của catechin 11
Hình 1 3: Công thức cấu tạo của (-)-EGCG 11
Hình 1 4: Công thức cấu tạo của ECG 13
Hình 1 5: Công thức cấu tạo của C(A) và EC(B) 13
Hình 1 6: Công thức cấu tạo của Anthoxanthin 14
Hình 1 7: Công thức cấu tạo hợp chất Leucoanthocyanin 16
Hình 1 9: Vi khuẩn Escherichia coli dưới kính hiển vi 34
Hình 1 10: Vi khuẩn Bacillus cereus dưới kính hiển vi 35
Hình 1 11: Vi khuẩn Salmonella dưới kính hiển vi 37
Hình 1 12: Vi khuẩn Staphylococcus aureus dưới kính hiển vi 38
Hình 1 13: Vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa dưới kính hiển vi 41
Hình 2 1: Lá chè sau khi xử lý 50
Hình 2 2: Thiết bị chiết tách 51
Hình 2 3: Mẫu đo UV - VIS 51
Hình 2 4: Hệ thống cô quay chân không 51
Hình 2 5: Mẫu chè được ủ với enzyme 53
Hình 2 6: Thiết bị phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao 57
Hình 2 7: Mẫu chè thử hoạt tính oxy hoá 58
Hình 2 8: Cao chè thử hoạt tính kháng khuẩn 59
Hình 2 9: Tủ sấy nhiệt độ cao 61
Hình 2 10: Thiết bị sấy thăng hoa 62
Hình 3 1: Biểu đồ phương trình đường chuẩn axit gallic 64
Hình 3 2: Đường chuẩn axit gallic 64
Hình 3 3: Biểu đồ phương trình đường chuẩn axit gallic 65
Hình 3 4: Biểu đồ phương trình đường chuẩn axit gallic 66
Hình 3 5: Biểu đồ ảnh hưởng của nồng độ tới hàm lượng polyphenol tổng 66
Trang 11Hình 3 7: Biểu đồ ảnh hưởng của tỷ lệ Nguyên liệu/Dung môi đến hàm lượng
polyphenol tổng 69
Hình 3 8: Biểu đồ ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng polyphenol tổng 70
Hình 3 9: Biểu đồ ảnh hưởng của nồng độ PH đến hàm lượng polyphenol tổng 71
Hình 3 10: Biểu đồ ảnh hưởng của độ non già của lá 72
Hình 3 11: Biểu đồ ảnh hưởng của một số quy trình chiết khác đến hàm lượng polyphenol tổng 73
Hình 3 12: Biểu đồ ảnh hưởng của enzym cenlulozo đến hàm lượng polyphenol tổng 74 Hình 3 13: Biểu đồ ảnh hưởng của enzym pectinase đến hàm lượng polyphenol tổng 74 Hình 3 14: Cao chiết lá chè được tinh chế với clorofom và etylaxetat 75
Hình 3 15: Biểu đồ ảnh hưởng của quá trình tinh chế polyphenol 76
Hình 3 16: Định tính polyphenol bằng TLC hiện bản UV: 254 nm 77
Hình 3 17: Phổ quét bước sóng UV VIS của dịch chè trước và sau tinh chế 79
Hình 3 18: Phổ sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC 80
Hình 3 19: Biểu đồ khả năng oxy hoá các loại lá 81
Hình 3 20: Biểu đồ lực kháng oxy hoá theo nồng độ 82
Hình 3 21: Biểu đồ thể hiện hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết lá chè 83
Hình 3 22: Khả năng kháng 5 chủng vi khuẩn của cao chiết lá chè 84
Hình 3 24: Biểu đồ ảnh hưởng của thời gian lưu mẫu đến hàm lượng polyphenol 85
Hình 3 23: Biểu đồ ảnh hưởng của nhiệt độ sấy đến hàm lượng polyphenol 86
Hình 3 25: Bột chiết lá chè sau khi sấy thăng hoa 87
Hình 3 25: Kem dưỡng da từ cao chiết lá chè 90
Trang 12Sơ đồ 1 1: Phân loại polyphenol 10
Sơ đồ 1 2: Quy trình tinh chế polyphenol 32
Sơ đồ 2 1: Quy trình chiết tách polyphenol 49
Sơ đồ 2 2: Sơ đồ tinh chế polyphenol 54
Trang 13MỞ ĐẦU
1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
Cây chè là sản phẩm nông nghiệp chủ yếu của đất nước ta, theo thống kê củaHiệp hội Chè Việt Nam, khối lượng xuất khẩu chè tháng 8 năm 2017 ước đạt 13 nghìntấn đưa khối lượng xuất khẩu chè 8 tháng đầu năm 2017 ước đạt 90 nghìn tấn Đối vớitỉnh Bà Rịa Vũng Tàu có thuận lợi về khí hậu và địa hình nương rẫy, phù hợp cho diệntích trồng chè lớn.[77] Ngành công – nông nghiệp và thương mại chè đã giải quyếtcông ăn việc làm cho hàng triệu lao động, đặc biệt ở các vùng khó khăn, vùng trung duđồi núi Theo thống kê của Tổng cục hải quan, trong khoảng 5 năm gần đây, kimngạch xuất khẩu chè bình quân của Việt Nam vào khoảng 150 triệu USD Điều nàycho thấy, sản phẩm chè Việt Nam đã có chỗ đứng trên thị trường thế giới và đã cóđóng góp không nhỏ vào nền kinh tế nước nhà Tuy nhiên, sự phát triển của cây chè vàcác sản phẩm từ chè Việt Nam hiện nay chưa tương xứng với tiềm năng của nó, đờisống người trồng và chế biến chè vẫn khó khăn do giá trị sản phẩm thấp Do vậy, cầnđẩy mạnh việc đầu tư nghiên cứu nâng cao chất lượng, đa dạng hóa sản phẩm chế biến,đồng thời cần nghiên cứu chiết tách các chất có hoạt tính sinh học cao (polyphenol)nhằm ổn định, phát triển sản xuất và nâng cao giá trị của cây chè Việt Nam
Nhiều kết quả ngiên cứu cho thấy hợp chất trong chè xanh có hoạt tính sinh họcnhư: hoạt tính chống oxy hóa, chống xơ vữa động mạch, chống các bệnh về tim mạch,ngăn chặn sự phát triển của khối u, đặc biệt là ung thư da, bảo quản thực phẩm.[78]Liên quan đến hoạt tính sinh học, Fumio và cộng sự [35] đã chỉ ra rằng, khả năng quétgốc tự do DPPH của các catechin chè cao gấp 6 đến 16,4 lần α – tocopherol hay từ 4,3đến 11,8 lần vitamin C Ngoài ra, hoạt tính này của chè xanh cũng cao gấp 1,4 lần sovới hương thảo, 4,02 lần với sả, 7,3 lần với hoa nhài và 15,4 lần so với oải hương.[70]Gần đây, khi so sánh khả năng quét gốc tự do DPPH của chè vàng (một loại chè bánlên men) với một số đối tượng khác, Barhe và Tchouya[23] cũng chỉ ra rằng, hoạt tínhnày của chất chiết chè vàng > chất chiết đỗ tương > vang đỏ > hibiscus Bên cạnh hoạttính kháng oxi hóa, nhiều nghiên cứu trên thế giới cũng chỉ ra rằng, polyphenol (chấtchiết chè) có khả năng kháng được nhiều chủng vi khuẩn gây ngộ độc và gây thối hỏngthực phẩm.[21][49] Điều này cho thấy, đối tượng này không chỉ có tiềm năng ứng dụngcao trong mỹ phẩm, dược phẩm mà còn mở ra những ứng dụng quan trọng trong
Trang 14chè như một chất bảo quản tự nhiên không độc hại Điều này đặc biệt có ý nghĩa trongbối cảnh hiện nay,khi tình trạng vệ sinh an toàn thực phẩm đang ngày càng trở lêntrầm trọng, mất kiểm soát ở các nước đang phát triển, trong đó có Việt Nam.
Có thể thấy, mặc dù việc nghiên cứu chiết xuất polyphenol trong lá chè xanhcũng như việc nghiên cứu các hoạt tính sinh học của chúng đã được báo cáo Tuynhiên những nghiên cứu này thường giới hạn hoặc với dung môi nước nên hiệu quảchiết tách còn hạn chế, hoặc sử dụng các kỹ thuật hiện đại chi phí đầu tư cao, khó ápdụng trong điều kiện Việt Nam hiện nay như trích ly có hỗ trợ vi sóng hay trích lydùng sóng siêu âm, nhiều công trình nghiên cứu và khai thác hoạt tính sinh học củaPolyphenol từ chè xanh, nhưng ở Việt Nam vấn đề này còn khá mới mẻ, nhất là hoạttính kháng khuẩn Để khai thác lợi ích của chúng một cách tối ưu, các thành phần hóahọc có hoạt tính sinh học có trong lá chè xanh vẫn cần phải được nghiên cứu sâu hơn
và hướng tới thương mại hóa sản phẩm ra thị trường, đặc biệt đối với những khu vực
có trữ lượng trà xanh lớn như các nước Việt Nam, Trung Quốc, Ấn Độ Vì vậy;
trong nghiên cứu này này, chúng tôi chọn đề tài “Nghiên cứu chiết tách hợp chất
POLYPHENOLS ứng dụng trong Dược - Mỹ Phẩm và Thực phẩm từ lá Chè Xanh được trồng tại xã Suối Nghệ - huyện Châu Đức - tỉnh Bà Rịa Vũng Tàu” nhằm tìm ra
phương pháp chiết tách polyphenol phù hợp ở điều kiện Việt Nam và khảo sát hoạttính sinh học của chúng với nguồn chè trồng tại tỉnh Bà Rịa Vũng Tàu Từ đó nghiêncứu ứng dụng của chúng làm mặt nạ dưỡng da nhằm giải quyết các vấn đề: Lợi íchkinh tế cho người trồng chè, khai thác triệt để hoạt tính sinh học của polyphenol, tạo rasản phẩm đẹp da, chất lượng tốt và an toàn
2 MỤC TIÊU
- Xây dựng được quy trình chiết tách các hợp chất polyphenol từ lá chè xanh
- Tính chất hóa lý, định tính, định lượng polyphenol trong lá chè
- Đánh giá được khả năng oxy hóa và kháng khuẩn của polyphenol trong lá chè
- Ứng dụng cao polyphenol trong các sản phẩm làm đẹp da
3 PHẠM VI NGHIÊN CỨU
Trong nghiên cứu này các nội dung được giới hạn như sau:
- Đối với lá chè khảo sát: chúng tôi sử dụng chè trồng tại xã Suối Nghệ, huyện Tân Thành, tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu
Trang 15- Đối với nghiên cứu chiết tách polyphenol: phương pháp trích ly bằng dung môiđược chúng tôi sử dụng Do đây là phương pháp khá đơn giản, có khả năng chohiệu suất thu hồi cao Bên cạnh đó, phương pháp này cũng chỉ đòi hỏi đầu tư vừaphải, dễ áp dụng cho các cơ sở sản xuất vừa và nhỏ, phù hợp với điều kiện ViệtNam.
- Đối với xác định hoạt tính oxy hóa: Xác định lực kháng oxy hoá tổng (total
antioxydant capacity) theo mô hình phospho molybdenum.[56]
- Đối với hoạt tính kháng khuẩn: Khả năng kháng khuẩn của dịch chiết được xác
định bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch trên 5 chủng vi khuẩn Escherichia
coli, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa và Salmonella typhi được cung cấp bởi phòng thí nghiệm Đại Học Công Nghiệp
Thành Phố Hồ Chí Minh
- Đối với nghiên cứu ứng dụng chất chiết polyphenol chè trong dược mỹ phẩm: Nghiên cứu trên 2 dòng sản phẩm Mặt nạ dưỡng da và kem dưỡng da từ trà xanh.Các thí nghiệm được thực hiện ở quy mô phòng thí nghiệm Đại Học Bà Rịa Vũng Tàu
4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
- Chiết tách polyphenol trong lá chè xanh bằng dung môi, Enzym và kỹ thuật khác
- Định tính thành phần hóa học trong polyphenol bằng Thuốc thử, sắc ký lớp mỏng (TLC), UV-VIS
- Định lượng bằng phương pháp Folin-Denis và Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
- Hoạt tính chống oxi hóa được xác định dựa theo mô hình phospho molybdenum
- Xác định hoạt tính kháng khuẩn của polyphenol theo phương pháp xác định đườngkính vòng vô khuẩn
5 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA LUẬN ÁN
5.1 Ý nghĩa khoa học
- Kết quả của đề tài tạo ra bộ dữ liệu khoa học tương đối toàn diện về hàm lượngcác hợp chất có hoạt tính sinh học cao (định tính, định lượng hàm lượng polyphenoltổng số, các catechin thành phần) cũng như hoạt tính sinh học (khả năng kháng oxihóa, kháng khuẩn), so sánh hàm lượng polyphenol tổng số của các loại chè non, chègià của giống chè trồng tại tỉnh Bà Rịa Vũng Tàu Các dữ liệu khoa học này là nguồn
Trang 16tư liệu hữu ích cho công tác đào tạo, nghiên cứu và khai thác chè ở tỉnh Bà Rịa Vũng Tàu nói riêng và Việt Nam nói chung.
- Kết quả nghiên cứu công nghệ trích ly polyphenol từ lá chè đã bổ sung thêmcác thông tin khoa học quan trọng cho biết ảnh hưởng của các yếu tố công nghệ đếnhiệu suất thu hồi polyphenol lá chè Đây là nguồn thông tin khoa học hữu ích trongviệc nghiên cứu và triển khai sản xuất bột chiết polyphenol từ chè xanh nguyên liệu
- Kết quả nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng của enzym cenlulozo, pectinase tới hiệusuất chiết tách polyphenol trong lá chè
6 TÍNH MỚI CỦA ĐỀ TÀI
- Nghiên cứu tổng thể và đánh giá về hàm lượng các hợp chất có hoạt tính sinh học là polyphenol tổng số của giống chè ở Suối Nghệ, Bà Rịa Vũng Tàu
- Việc sử dụng hệ dung môi etanol nước trong trích ly polyphenol từ lá chè, đã đềxuất được quy trình công nghệ chiết tách chế phẩm polyphenol cho hiệu suất thu hồi
và chất lượng chế phẩm cao (bao gồm độ tinh sạch và khả năng kháng oxy hóa, khángkhuẩn) Với quy trình này, việc chuyển giao cho các cơ sở sản xuất vừa và nhỏ ở ViệtNam là hoàn toàn khả thi và thuận lợi, không phải đầu tư lớn, tận dụng được nguồnphụ phẩm chế biến chè
- Bước đầu khảo sát ảnh hưởng của 2 loại enzym cenlulozo và pectinase đối với hiệu suất chiết tách polyphenol trong lá chè
- Nghiên cứu ứng dụng trong các sản phẩm làm đẹp có nguồn gốc tự nhiên Thúcđẩy nền công nghiệp Mỹ phẩm sản xuất hàng Việt Nam chất lượng cao
Trang 17CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung về cây chè
1.1.1 Nguồn gốc và sự phân bố của cây chè
Cây chè có tên khoa học Camellia sinensis (L) O Kuntze được phát hiện bởingười Trung Quốc vào khoảng 2700 TCN Hiện nay, nhiều nghiên cứu cho rằng, câychè có nguồn gốc phát sinh ở miền núi phía Nam Trung Quốc, Bắc Ấn Độ và miền núiphía Bắc Việt Nam [6] Chè phân bố khá rộng, trong những điều kiện tự nhiên rất khácnhau, từ 30 độ vĩ nam (Natan - Nam Phi) đến 43 độ vĩ bắc (Grudia), tập trung ở vùngnhiệt đới và á nhiệt đới [9]
Hình 1 1: Lá chè tại Xã Suối Nghệ, Tân Thành, tỉnh BR-VT
1.1.2 Phân loại
Cây chè thuộc: Ngành hạt kín (Angiospermae), Lớp song tử diệp(Dicotyledonae), Bộ chè (Theales), Họ chè (Theaceae), Chi chè (Camellia) và Loài(Camellia (Thea) sinensis) Hiện nay, chè được chia thành 4 giống chính:[9]
* Chè Trung Quốc lá nhỏ (Camellia sinensis var bohea)
Thuộc loại cây bụi thấp, phân cành nhiều, lá nhỏ (dài 3,5 – 6,5 cm), dày nhiều gợn sóng, màu xanh đậm, răng cưa nhỏ, không đều Giống này có đặc điểm năng suất thấp, chất lượng trung bình nhưng khả năng chịu rét tốt Phân bố chủ yếu ở miền Đông, Đông nam Trung Quốc, Nhật Bản và một số vùng khác * Chè Trung Quốc lá to(Camellia sinensis var macrophylla)
Trang 18Cây thuộc loại thân gỗ nhỡ, cao tới 5 m trong điều kiện sinh trưởng tự nhiên Lá
to trung bình, màu xanh nhạt, bóng, răng cưa sâu không đều, đầu lá nhọn Giống cóđặc điểm năng suất cao, chất lượng tốt Nguyên sản ở Vân Nam, Tứ Xuyên (TrungQuốc)
* Chè Shan (Camellia sinensis var shan)
Cây thuộc loại thân gỗ, cao từ 6 đến 10 m Lá to, màu xanh nhạt, đầu lá dài, răng cưa nhỏ và dày Tôm chè có nhiều lông tơ, trắng và mịn trông như tuyết nên còn gọi là chè tuyết Giống có đặc điểm năng suất cao, chất lượng tốt, có khả năng thích ứng trong điều kiện ấm ẩm, phát triển tốt ở vùng có địa hình cao Nguyên sản ở Vân Nam - Trung Quốc, miền bắc của Miến Điện và Việt Nam * Chè Ấn Độ (Camellia sinensis var assamica):
Thân gỗ cao tới 17 m, phân cành thưa, lá dài tới 20 - 30 cm, mỏng, mềm, thường cómàu xanh đậm, dạng lá hình bầu dục, phiến lá gợn sóng, đầu lá dài Giống này thuộcloại có năng suất cao, phẩm chất tốt nhưng không chịu được rét hạn Giống được trồngnhiều ở Ấn Độ, Miến Điện, Vân Nam (Trung Quốc) và một số vùng khác
1.1.3 Tình hình sản xuất chè ở Việt Nam
Năm 2012, Việt Nam đã vươn lên hàng thứ sáu thế giới về diện tích (115.964ha), thứ năm về sản lượng chè (216.900 tấn), chỉ đứng sau Trung Quốc, Ấn Độ,Srilanka, Kenya và tương đương Indonesia Trong 15 năm, từ 1995 – 2010, diện tíchchè của nước ta đã tăng 2,2 lần từ 52.100 ha lên 113.200 ha, sản lượng tăng 4,94 lần từ40.200 tấn lên 198.466 tấn.[79]
Theo ước tính của Hiệp hội chè Việt Nam, cả nước hiện có khoảng 6 triệu laođộng sống dựa vào ngành công – nông nghiệp trồng và chế biến chè, và 116 doanhnghiệp tham gia xuất khẩu chè, hàng năm thu về gần 200 triệu đô la, đóng góp khôngnhỏ vào sự phát triển chung của nền kinh tế nước nhà
Về các giống chè ở Việt Nam, bên cạnh giống truyền thống (Trung du), hiệnchúng ta đã chọn lọc và lai tạo được khá nhiều giống mới
1.1.4 Thành phần hóa học cơ bản của lá chè
1.1.4.1 Nước
Nước là thành phần chủ yếu trong búp chè, thường chiếm từ 75 - 82% trọnglượng búp Hàm lượng nước trong búp thay đổi tùy theo giống, tuổi cây, đất đai, kỹ
Trang 19thuật canh tác và tiêu chuẩn thu hái [4]
1.1.4.2 Tannin chè
Tannin thiên nhiên đều là hỗn hợp của gallic acid và digallic acid ở dạng tự docũng như kết hợp với glucose Đây là sản phẩm chuyển hóa thứ cấp của thực vật vàđược chia làm hai dạng: tannin thủy phân (tannin pyrogallic) và tannin không bị thủyphân (tannin pyrocatechin) Tannin trong chè tồn tại ở cả hai dạng trên nhưng chủ yếu
là dạng pyrocatechin Pyrocatechin là hỗn hợp polymer của catechin vàleucoanthocyanidin.[10] Hàm lượng tannin trong chè vào khoảng 32-40% CK, phụthuộc vào giống, độ non già của lá, mùa vụ thu hoạch và chế độ canh tác.[9]
1.1.4.5 Amino acid và protein
Trong chè, protein chiếm khoảng 18% CK và có khoảng 17 loại amino acid.Protein trong lá chè chủ yếu là dạng glutelin hoà tan trong kiềm Trong quá trình chếbiến, protein và amino acid đóng vai trò quan trọng trong việc tạo hương và vị củanước chè pha.[4]
Trang 201.1.4.7 Tinh dầu
Tinh dầu trong chè rất ít, hàm lượng của chúng trong lá chè tươi vào khoảng0,007 – 0,009% và trong chè bán thành phẩm khoảng 0,024 – 0,025% Hàm lượng nàyphụ thuộc nhiều vào giống và độ cao trồng trọt.[9]
1.1.4.8 Vitamin
Có nhiều loại vitamin trong chè Chính vì vậy, giá trị dược liệu cũng như giá trịdinh dưỡng của chè rất cao Hàm lượng một số vitamin trong chè tính theo mg/1000 gchất khô như sau: Vitamin A: 54,6; B1: 0,7; B2: 12,2; PP: 47,0; C: 27,0 v.v Đángchú ý nhất là hàm lượng vitamin C ở trong chè nhiều hơn trong cam chanh từ 3 đến 4lần.[4]
vệ sức khỏe mà còn có tác dụng điều trị nhiều loại bệnh, nên người ta coi chè là loạithuốc chữa bệnh
Tuy nhiên các hiểu biết về cơ chế tác đông của lá chè mới được bắt đầu nghiêncứu mạnh mẽ trong thế kỉ 20 Trước đây tác dụng của trà được cho rằng do tác độngcủa các thành phần caffeine và vitamin C Bắt đầu từ khoảng thập niên 70 của thế kỉ
20, việc nghiên cứu chi tiết về chè đã chỉ ra rằng những tác dụng về mặt dược lý củachè là do sự có mặt của nhiều nhóm hợp chất như; alcoloid: caffeine, theophyllin,theobromin, purin Các flavonoid, chất catechin, lipid, dẫn chất phenol, tinh dầu, cácacid amin và nhiều sinh tố cùng các nguyên tố hằng lượng và vi lượng như P, sắt, iod,
Trang 21Mg, Cu….tổng cộng trên 300 loại thành phần các thành phần này có tác dụng trọngyếu trong phòng và chữa bệnh đối với cơ thể con người.
Một số tác dụng cụ thể của trà:
- Tinh thần nâng cao, đầu óc tỉnh táo: khi đầu óc xây xẩm, tinh thần mệt mỏi,người
ta uống một chén chè mới pha, sẽ cảm thấy tinh thần sảng khoái
- Thanh lợi đầu và mắt: uống trà lâu dài có thể thanh lợi đầu và mắt, đạt tác dụnglàm tinh thần sảng khoái, mắt tinh, tai sáng Trong trà có chứa nhiều thành phầndinh dưỡng có quan hệ tới thị lực như là: tiền sinh tố A ( β − caroten ), vitamin B1,B2, và C, đều là những chất cần thiết duy trì thị lực
- Tiểu thử giải khát: sau khi uống trà nóng, tinh dầu thơm trong trà và caffeine mauphát huy tác dụng, làm giãn huyết quản, mở tuyến mồ hôi, thân thể hơi toát mồhôi, tán phát nhiệt lượng trong cơ thể, do đó đạt được mục đích tiêu thử giáng thấpthanh nhiệt, sau khi uống trà nóng gia tăng được lượng nước tiểu, làm cho tiểu tiênbài tiết điều hòa, tự nhiên sẽ có bộ phận nhiệt lượng thoe đường tiểu tiện tiết rangoài, làm cho ra mồ hôi Ngoài ra, làm co dãn cơ trơn dạ dày, ruột giãn giải cothắt trường vị, cho nên uống trà điều trị được thử nhiệt, sa khí, đau bụng
- Giảm béo: chè xanh chứa nhiều thành phần như chứa chất dẫn phenol, flavonoid,quereetin cùng nhiều loại sinh tố, nhất là vitamin C với lượng lớn dẫn chất phenoltrong lá chè giáng giải chất mỡ, flavonoid, quereetin hỗ trợ việc giáng thấpcholesterol Vitamin C hỗ trợ lợi tiểu làm cholesterol bài tiết ra ngoài nhanhchóng Các vitamin khác cải thiện cơ năng chuyển hóa của cơ thể, hỗ trợ và đểphòng mạch máu bị xơ cưng Trong lá chè có diệp lục (chlorophyll ) sau khi vào
cơ thể, sẽ loại cholesterol từ thức ăn, ngăn cản tiêu hóa hấp thụ cholesterol trong
cơ thể
Ngoài ra còn trà còn rất là nhiều công dụng khác như sử dụng trong mỹ phẩm,
vì chúng có tác dụng làm ẩm da và chống nếp nhăn, có trong thuốc đánh răng có tácdụng diệt khuẩn
1.2 Polyphenol trong chè
1.2.1 Nguồn gốc chuyển hóa và phân loại các hợp chất phenolic thực vật.
Các hợp chất phenol là sản phẩm chuyển hóa thứ cấp của thực vật, rất đa dạng
về cấu trúc và chức năng Trong cây, nhìn chung hàm lượng của chúng ở các bộ phận
Trang 22khác nhau là khác nhau Các phenol không hòa tan trong nước (lignin,hydroxycinnamic acid ) thường là thành phần của thành tế bào, trong khi loại hòa tanthường cư trú ở không bào.[73]
Sơ đồ 1 1: Phân loại polyphenol
1.2.2 Các hợp chất Polyphenol có trong chè
Nhóm các hợp chất polyphenol là thành phần được quan tâm nhiều nhất trongchè Nhờ các hợp chất này mà chất chiết từ chè xanh có những đặc tính quý giá nhưkhả năng chống ung thư, chống oxy hóa, giảm cholesteron trong máu…
Các hợp chất polyphenol trong chè chủ yếu là các hợp chất flavonoid, trong đó chiathành 5 nhóm chính:
Trang 23Hình 1 2: Công thức cấu tạo của catechinTrong các hợp chất catechin, R1 và R2 có thể cùng là nguyên tử H-, R2 có thể làgốc galloyl, R1 cũng có thể là gốc –OH.
Khi R1 = R2 = H ta có catechin (C); khi R1 = H, R2 = OH ta có gallocatechin(GC) Khi R2 là gốc galloyl, còn R1 là OH thì chất trên sẽ là catechingallate (CG) vànếu R2 là gốc galloyl, còn R1 là H thì chất tạo thành là gallocatechingallate (GCG).Bên cạnh đó, cấu trúc phân tử của catechin có phân tử có 15 cacbon bao gồm hai vòng
6 cacbon A và B được nối bởi 3 đơn vị cacbon ở vị trí 2; 3; 4, hình thành một dị vòng
C chứa một nguyên tử oxy Cấu trúc của catechin có chứa hai cacbon bất đối ở vị trí 2
và 3, không chứa nối đôi ở vị trí 2; 3 và nhóm 4-oxo nên có thể tạo ra nhiều đồng phânkhác nhau Hiện nay đã nhận diện được 7 catechin trong chè là Epigallocatechingallate(EGCG), Epicatechingallate (ECG), Epigallocatechin (EGC), Gallocatechingallate(GCG), Epicatechin (EC), Gallocatechin (GC) và Catechin (C) Trong đó, các catechinchủ yếu là EGCG, EGC, ECG, EC và C.[18] Hàm lượng catechin trong chè có thể lênđến 15 - 20 % CK và thường chiếm trên 70 % tổng lượng polyphenolcủa lá chè.[10]
EGCG
Đây là thành phần chính trong các hợp chất catechin của chè, công thức phân tửC22H18O11, không màu, kết tinh hình kim nhỏ, vị chát hơi đắng, có khả năng kết tủavới gelatin, tan trong nước, dễ tan trong acetone, ethanol, ethylacetate [4]
Trong công thức cấu tạo, R2 là nhóm –OH và R1 là gốc galloyl
Hình 1 3: Công thức cấu tạo của (-)-EGCG
Trang 24Do trong công thức phân tử vừa có gốc galloyl, vừa có 3 nhóm –OH ở vòng Bnên EGCG được cho rằng có cấu trúc phân tử và các trung tâm hoạt động chống oxihóa hiệu quả nhất trong các catechin chè Khi nghiên cứu hiệu quả quét gốc tự doDPPH của catechin và các dẫn xuất của nó, Nanjo và cộng sự [52] đã chỉ ra rằng, hiệuquả quét gốc tự do của các catechin được galloyl hóa (EGCG, ECG, CG) mạnh hơnnhóm không có gốc galloyl (C, EC, GC, EGC) và các catechin mà vòng B có 03 nhóm–OH thì hiệu quả hơn so với các catechin chỉ có 2 nhóm -OH Tuy nhiên các tác giảcũng chỉ ra rằng, ngoài đặc tính cấu trúc thì mức độ phân cực, trạng thái ion hóa và cấuhình không gian cũng có thể ảnh hưởng đến hiệu quả kháng oxi hóa của các hợp chấtnày.
Về hàm lượng EGCG trong lá chè, nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng, hàm lượngnày phụ thuộc rất lớn vào giống chè, độ non già của lá và mùa vụ thu hoạch.[22] [27] Lin
và cộng sự [44] đã phân tích 10 giống chè Đài Loan vào vụ hè (chiết bằng nước ở700C/30 phút, tỷ lệ chè/nước là 1/10) cho kết quả trung bình về hàm lượng EGCG là2,6 ± 0,2% CK Tuy nhiên hàm lượng này lên tới 9,1 đến 12,9% CK trong búp chè tạiAustralia.[74]
EGC
Trong chè, EGC là thành phần catechin có hàm lượng đứng thứ 2, chỉ sauEGCG Thành phần này có công thức phân tử C15H14O7, kết tinh hình kim nhỏ khôngmàu, vị chát mạnh nhưng có vị ngọt, không tác dụng với gelatin, tan trong nước vàethylacetate, dễ tan trong acetone.[4]
Trong lá chè, hàm lượng EGC thay đổi theo giống, độ non già của lá và mùa vụthu hoạch.[27][74] Với thành phần này, Lin và cộng sự [44] thu được kết quả 1,1 ± 0,1%
CK, trong khi nó lên tới 3,6 đến 5,2% CK trong nghiên cứu của Yao và cộng sự(2005).[74]
ECG
Epicatechingallate là thành phần có hàm lượng thường đứng thứ 3 sau EGCG
và EGC Đây là một trong các catechin được galloyl hóa Trong công thức cấu tạo, gốcgalloyl được gắn vào vị trí C3 ở vòng C (hình 1.4) Cấu tử này có công thức phân tửC15H18O10, kết tinh hình kim nhỏ không màu, vị chát hơi đắng, tác dụng với gelatincho kết tủa màu trắng, tan trong nước, dễ tan trong acetone, ethanol, ethylacetate [4]
Trang 25Hàm lượng ECG cũng thay đổi tùy theo giống chè, độ non già của lá và mùa vụ thuhoạch Kết quả nghiên cứu của Lin [44] và Yao [74] về hàm lượng catechin này là 1,1
Hình 1 5: Công thức cấu tạo của C(A) và EC(B)Cũng giống như các thành phần khác, hàm lượng EC và C thay đổi theo giống,
độ non già của lá [74] Kết quả phân tích của Lin và cộng sự [44] trong 10 giống chèĐài Loan cho hàm lượng trung bình của chúng là 0,33% và 0,13% CK tương ứng
Tính chất của các hợp chất catechin có trong chè
Các hợp chất catechin trong lá chè đã được tách ra từng chất ở dạng tinh khiết,
ở thể rắn chúng là những chất kết tinh không màu, hình kim hoặc hình lăng trụ, có vịchát ở mức độ khác nhau, riêng hai chất L-EGC và este gallat của nó có vị chát hơi đắng khi ở dạng tự do và chuyển thành vị chát dịu khi ngưng thành các catechin
Các catechin đều dễ tan trong nước nóng, rượu, axeton, etyl axetat tạo dung dịch không màu, không tan trong các dung môi không phân cực hoặc ít
Trang 26phân cực như benzen hoặc clorofooc.
Các catechin tác dụng với FeCl3 cho kết tủa xanh thẫm hoặc xanh nhạt tuỳ theo
số lượng nhóm hydroxyl trong phân tử Các catechin có tính khử mạnh nên dễ dàng bịoxy hóa bởi dung dịch KMnO4 trong môi trường axit và bởi dung dịch I2 trong môitrường kiềm, chúng có thể tự oxy hóa trong không khí ẩm Dưới tác dụng của các menoxy hóa khử hoặc nhiệt độ cao, các chất catechin bị oxy hóa và tiếp đến sản phẩm oxyhóa trung gian của chúng lại gây ra hàng loạt các biến đổi hóa học làm chuyển hóa cácchất có trong lá chè, góp phần tạo ra các chất thơm đặc trưng cho các loại chè
1.2.2.2 Hợp chất anthoxanthin (flavonol)
Các hợp chất anthoxanthin trong chè đã được nhận dạng là kaempferol,quercetin và myricetin Các hợp chất này thường tồn tại ở cả dạng tự do và kết hợp(dạng glycoside) Hàm lượng anthoxanthin trong chè rất thấp nếu so sánh với cáccatechin Trong giống chè Trung Quốc, chúng chỉ dao động từ 0,4 – 1,5% CK.[4]
Chúng có công thức cấu tạo chung như sau [7]:
Hình 1 6: Công thức cấu tạo của AnthoxanthinTrong đó:
- Nếu R1 = R3 = (-H); R2 = (-OH): ta có chất Kaempferol
- Nếu R1 = R2 = (-OH); R3 = (-H): ta có chất Quercetin
- Nếu R1 = R2= R3 = (-OH): ta có chất Myricetin
Các anthoxanthin trong lá chè tươi tồn tại cả hai dạng tự do và kết hợp, hơn nữacác glycosid của chúng thường đính gốc đường tại vị trí thứ 3
1.2.2.3 Hợp chất anthocyanin
Hợp chất anthocyanin thuộc nhóm flavonoid dẫn xuất croman Trong thực vật,hầu như các hợp chất anthocyanin đều tồn tại ở trạng thái kết hợp với các gốc đường(glycosid)
Tất cả các anthocyanin đều có chứa trong vòng pyran oxy hóa trị tự do
Trang 27Ở trạng thái tự do, anthocyanin gồm 3 aglycon chủ yếu là pelargonidin, cyanidin và delphinidin.
Các glycosid của anthocyanin được tạo thành do gốc đường glucoza,galactoza hoặc ramnoza kết hợp với gốc aglycon có màu gọi là anthocyanidin Do đó,khi thủy phân các glycosid của anthocyanin thì được đường và anthocyanidin.[6][7]Chúng tan trong nước và có trong dịch bào thực vật, có vị đắng và màu sắc thay đổiphụ thuộc vào nhiều yếu tố như: hàm lượng catechin và anthoxanthin, nhiệt độ dungdịch và nồng độ của chúng Nhìn chung, các giống chè có búp màu tím thường hàmlượng anthocyanin cao hơn búp màu xanh.[4]
1.2.2.4 Phenol carbocylic acid
Axit phenol cacboxylic là nhóm chất tự nhiên có trong thực vật, trong phân tử
có chứa nhóm phenol và nhóm cacbonyl
Trong lá chè tươi có nhiều acid hữu cơ như: gallic acid, ellagic acid,methadigallic acid, chlorogenic acid, cafeic acid, para-coumaric acid, galloylquinicacid Tuy nhiên hàm lượng của chúng không cao Trong các acid này, gallic acid cóvai trò quan trọng trong việc hình thành chất chát và hoạt tính kháng oxi hóa của dichchiết chè [4] Fernandez và cộng sự [33] đã phân tích hàm lượng gallic acid trong 12mẫu chè xanh có nguồn gốc từ Trung Quốc và Nhật Bản, các tác giả cho biết hàmlượng này rất thấp, chỉ dao động từ 0,004% CK đến 0,12% CK
1.2.2.5 Hợp chất leucoanthocyanin
Hợp chất leucoanthocyanin là sự kết hợp của các gốc aglycol với gốc đường(glycosid) Các leucoanthocyanin trong thành phần polyphenol chè thường gặp làleucoxyanidin và leucodelphinidin Chúng tồn tại ở cả trạng thái tự do và dạngglycoside Hàm lượng của chúng trong lá chè tươi cũng rất ít nếu so sánh với cáccatechin Các leucoanthocyanin là dạng trung gian giữa catechin và anthocyanin.[4]
Trang 28Hình 1 7: Công thức cấu tạo hợp chất Leucoanthocyanin
1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng polyphenol/catechin trong lá chè
Giống chè: Hàm lượng polyphenol/catechin phụ thuộc rất lớn vào giống chè.Nhìn chung, chè Ấn Độ (Asammica) thường có hàm lượng polyphenol cao hơn giốngchè Trung Quốc (Sinensis).[9] Wu và cộng sự [71] cho biết, hàm lượng catechin tổng sốtrong 04 giống chè Trung Quốc (Ziya, Wuniuzao, Huangyezao, Fudingdabaicha) daođộng từ 11,4% CK đến 22,5% CK Ở Việt Nam, Vũ Hồng Sơn và Hà Duyên Tư [7] đãchỉ ra rằng, hàm lượng polyphenol tổng số của giống chè Shan > PH1 > Trung du >LDP1 Nhìn chung hàm lượng này trong lá non thu hái vụ đông dao động trongkhoảng từ 17,5 – 19,6% CK
Độ non già của nguyên liệu: Độ non già của lá chè có ảnh hưởng rất lớn đếnhàm lượng polyphenol Nhìn chung, lá càng non hàm lượng polyphenol/catechin cànglớn Trong một búp chè, hàm lượng này giảm theo thứ tự: lá 1 > lá 2 > lá 3 > cuộng.[10]Trong nghiên cứu của Baptista và cộng sự,[22] hàm lượng polyphenol tổng số đạt18,5% CK trong búp 1 tôm 2 lá, trong khi nó chỉ là 11,5% CK trong các lá bánh tẻ vàgià (hỗn hợp từ lá thứ 3 đến lá thứ 8)
Mùa vụ thu hoạch: Sự tổng hợp tannin hay polyphenol trong lá chè chịu ảnhhưởng rất lớn bởi cường độ chiếu sáng, khi cường độ chiếu sáng tăng thì hàm lượngnày tăng và ngược lại.[9][74] Do vậy trong một năm, hàm lượng polyphenol trong lá chèthường đạt cực đại vào mùa hè và thấp hơn ở mùa thu và mùa xuân
Chế độ canh tác: Dinh dưỡng cho cây chè cũng ảnh hưởng đến hàm lượngtannin và polyphenol trong nguyên liệu Nhìn chung, khi tăng lượng bón phân đạm thìhàm lượng polyphenol trong lá chè giảm và hàm lượng này tăng khi tăng lượng lân và
ka li.[17]
Ngoài các yếu tố trên thì hàm lượng polyphenol trong lá chè cũng chịu ảnhhưởng của các yếu tố như thổ nhưỡng, khí hậu, tuổi cây [45] Nguyễn Văn Chung vàTrương Hương Lan [2] đã khảo sát hàm lượng polyphenol tổng số trong chè xanh tạiPhú Thọ, Thái Nguyên và Lâm Đồng, các tác giả cho biết hàm lượng này đạt trungbình 14,8% CK, 18,5% CK và 18,8% CK tương ứng
Trang 291.2.4 Phương pháp định tính, định lượng polyphenol trong lá chè
1.2.4.1 Phương pháp định tính bằng thuốc thử
- Định tính nhóm Anthranoid bằng phản ứng Borntraeger
- Định tính nhóm Steroid – triterpenoid bằng: Thuốc thử Salkowski, Liebermann – Burchard, Rosenthaler,
- Định tính alkaloid bằng: Thuốc thử Mayer, Wagner
- Định tính nhóm flavonoid bằng: Dung dịch FeCl3 bão hoà, H2SO4 đặc
- Định tính nhóm saponin bằng khả năng tạo bọt, định tính chỉ số tạo bọt
Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất
Anthranoid Phản ứng Borntraeger
Nguyên tắc: Trong thiên nhiên các hợp chất Anthranoid có thể tồn tại dưới dạngoxy hoá (Anthraquinone) hoặc dạng khử (Anthranol, Anthrone), dạng tự do (aglycone)hoặc dạng kết hợp (glycoside) Các hợp chất Anthranoid khi tác dụng với kiềm(amoniac, natri hydroxyd hoặc kali hydroxyd) sẽ tạo các dẫn chất phenolate có màu đỏtím
Khảo sát sự hiện diện của Steroid – triterpenoid
Đặc điểm: Steroid là những alcol thể rắn được phân bố rộng rãi trong tự nhiên,cấu trúc tổng quát vòng cyclopentanopentanoperhyrophenantren hoặc một vài trườnghợp hiếm gặp là dạng biến đổi của hệ thống vòng nói trên Steroid có nguồn gốc sinhtổng hợp như triterpen với chất liệu cơ bản là pharnesyl pyrophosphat Sterol thuộcnhóm steroid, phân bố rộng rãi, thường có mặt song song với các alkaloid hoặcsaponinsteroid Chúng có nguồn gốc động vật (cholesterol) hoặc thực vật (phytosterol,
β –sitosterol, ergosterol, stigmasterol,…) Sterol có mặt trong tất cả các bộ phận củacây nhưng có nhiều nhất ở các hạt có dầu dưới dạng tự do hoặc các ester Sterol là chấtkhông phân cực, rất ít tan trong nước, tan trong dầu béo, carotene Tan nhiều trong cácdung môi không phân cực như petroleum ether, benzen, chloroform, nên thường dùngcác dung môi này để chiết sterol Sản phẩm chiết được bằng dung môi hữu cơ thường
là hỗn hợp các ester sterol kết hợp với lipid, carotene, lecitin Phải qua giai đoạn xàphòng hóa để tách các chất này ra khỏi sterol, sau đó chiết sterol bằng dung môi hữu
cơ Tinh chế bằng kết tinh phân đoạn
Một số thuốc thử nhận biết Steroid – triterpenoid:
Trang 30Thuốc thử Liebermann – Burchard:
Anhidrid acetic 1 ml
H2SO4 đậm đặc
Dung dịch xuất hiện màu lục, hồng, cam hoặc đỏ và bền là phản ứng dương tính
Thuốc thử Salkowski: H2SO4 đậm đặc, nếu xuất hiện màu đỏ đậm, xanh, xanh
tím là phản ứng dương tính
Phản ứng Rosenthaler để phát hiện Steroid – triterpenoid:
- Vanilin 1%/ethanol 2 giọt, 10 ml nước cất
- Hỗn hợp hai dung dịch và thêm đủ 100 ml nước cất
Dung dịch sẽ xuất hiện tủa trắng hoặc vàng nhạt
Khảo sát sự hiện diện của Alkaloid
Đặc điểm: Alkaloid là những hợp chất hữu cơ chứa dị vòng nitơ, có tính base,thường gặp ở nhiều loại thực vật, đôi khi còn tìm thấy trong một số loài động vật.Alkaloid tồn tại ở hai trạng thái rắn và lỏng Đa số chúng không tan trong nước (trừnicotin và coniine), hầu hết tan trong dung môi hữu cơ như benzen, ether, chloroform,
…
Các alkaloid đa số không mùi và có vị đắng, một số ít có vị cay (piperine)
Đặc biệt alkaloid có hoạt tính sinh lý cao đối với cơ thể người và động vật, nhất là đốivới hệ thống thần kinh Với một lượng nhỏ, alkaloid có thể là chất độc gây chết người(như thuốc phiện, heroin), nhưng nó có khi lại là thần dược trị bệnh đặc hiệu hay thànhphần quan trọng trong một số thực phẩm (như cacao, cà phê,…)
Alkaloid có chứa lưu huỳnh thường có độc tính rất mạnh, có nhiều trong cácloại nấm độc
Một số thuốc thử Alkaloid:
Thuốc thử Mayer:
• Dung dịch 1: Hòa tan 1,36 g HgCl2 trong 60 ml nước cất
• Dung dịch 2: Hòa tan 5 g KI trong 10 ml nước cất
• Hỗn hợp hai dung dịch và thêm đủ 100 ml nước cất
Dung dịch xuất hiện tủa trắng hoặc vàng nhạt
Thuốc thử Wagner:
• I2 :1,27g
Trang 31• KI:2 g
• H2O: vừa đủ 100 ml
Dung dịch xuất hiện tủa màu nâu
Khảo sát sự hiện diện của Flavonoid
Đặc điểm: Flavonoid là những hợp chất màu phenol thực vật, tạo nên rất nhiềumàu cho rau, quả, hoa, Phần lớn chúng có màu vàng, một số ít có màu xanh, tím, đỏhay không màu Một số alkaloid tan trong nước, rượu, acid vô cơ loãng và base băng.Flavonoid có cấu trúc cơ bản là 1,3 diphenylpropan, gồm 2 vòng benzen A và B nốivới nhau qua một dây 3 carbon, nên thường gọi là C6-C3-C6 Nếu dây C3 đóng thì đánh
số bắt đầu từ dị vòng với dị nguyên tố oxygen mang số 1, rồi đánh tiếp đến vòng A,còn vòng B đánh số phụ
Nếu dây C3 hở, đánh số chính trên vòng B và đánh số phụ trên vòng A
Khảo sát sự hiện diện của saponin
Định tính khả năng tạo bọt của saponin trong môi trường acid, base:
Trang 32Pha động là một hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần được trộn với nhau theo
tỷ lệ quy định trong từng chuyên luận
Trong quá trình di chuyển qua lớp hấp phụ, các cấu tử trong hỗn hợp mẫu thửđược di chuyển trên lớp mỏng, theo hướng pha động, với những tốc độ khác nhau.Kết quả
Ta thu được một sắc ký đồ trên lớp mỏng
Cơ chế của sự chia tách có thể là cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, sàng lọcphân tử hay sự phối hợp đồng thời của nhiều cơ chế tùy thuộc vào tính chất của chấtlàm pha tĩnh và dung môi làm pha động
Ðại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của chất phân tích là hệ số dichuyển Rf được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng dịch chuyển của chất thử và khoảng dịchchuyển của dung môi:
b
R f = aTrong đó:
a: là khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi đo trên cùng đường đicủa vết, tính bằng cm
b: là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết mẫu thử, tính bằng cm
Rf: Chỉ có giá trị từ 0 đến l
1.2.4.3 Phương pháp UV-VIS
Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử hay còn gọi là phương pháp đo quang,phương pháp phân tích trắc quang phân tử là một trong những phương pháp phân tíchcông cụ thông dụng với rất nhiều thế hệ máy khác nhau, từ các máy đơn giản của thế
hệ trước còn được gọi là các máy so màu đến các máy hiện đại được tự động hóa hiện
Trang 33nay, gọi là máy quang phổ hấp thụ phân tử UV - VIS Các máy đo quang làm việctrong vùng tử ngoại (UV) và khả kiến (VIS) từ 190nm đến khoảng 900nm.
Sự hấp phụ ánh sáng của dung dịch màu:
Dung dịch có màu là do bản thân dung dịch đã hấp thụ một phần quang phổ(một vùng phổ) của ánh sáng trắng, phần còn lại ló ra cho ta màu của dung dịch, chính
là màu phụ của phần ánh sáng trắng đã bị hấp thụ (vùng quang phổ còn lại) Sự hấp thụcủa dung dịch theo màu được trình bày trong bảng :
Bảng 1 1: Sự hấp thụ của dung dịch theo màu
1.2.4.4 Phương pháp định lượng bằng Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một phương pháp chia tách trong đó pha động
là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểuphân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biếnđổi bằng liên kết hoá học với các nhóm chức hữu cơ Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơchế hấp phụ, phân bố, trao đổi Ion hay phân loại theo kích cỡ ( Rây phân tử )
Trang 341.2.5 Hoạt tính sinh học của polyphenol chè
1.2.5.1 Hoạt tính kháng oxi hóa của polyphenol chè
Ngày nay mối quan tâm trong việc sử dụng và đo lường các chất chống oxy hóatrong các ngành công nghiệp thực phẩm, dược phẩm và mỹ phẩm ngày càng tăng Mốiquan tâm này bắt nguồn từ các bằng chứng tích lũy kết nối căng thẳng oxy hóa vớinhiều phân loại, ví dụ như lão hóa sớm, ung thư và một loạt các bệnh trong đó có liênquan đến các gốc tự do Ngoài ra, thực hiện các quy định rất nghiêm ngặt về việc sửdụng chất bảo quản thực phẩm, do đó họ chỉ cho phép sử dụng chất chống oxy hóa tựnhiên
Các ứng dụng tiềm năng là chất bảo quản trong thực phẩm, mỹ phẩm và cácngành công nghiệp dược phẩm Sự quan tâm về việc loại bỏ chất độc của trong quátrình tổng hợp các chất chống oxy hóa trong thực vật và trong việc xác định các nguồnchất chống oxy hóa tự nhiên đã thúc đẩy chúng tôi phát triển để xác định giá trị củachất tan trong nước
Khi nghiên cứu khả năng quét gốc tự do tổng hợp như picrylhydrazyl (DPPH), 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid)(ABTS)…, các polyphenol-catechin đều thể hiện hoạt tính vượt trội so với các chấtkháng oxy hóa đối chứng như vitamin C, vitamin E Nanjo và cộng sự [52] đã chỉ rarằng, các catechin có hoạt tính quét gốc tự do DPPH cao gấp 6 đến 16,4 lần α –tocopherol hay từ 4,3 đến 11,8 lần vitamin C Trong các hợp chất catechin, nhìn chungdạng galloyl hóa có khả năng quét DPPH cao hơn so với dạng khác Trong các thànhphần của catechin chè, khả năng quét DPPH được xếp theo trật tự giảm dần như sau:EGCG > ECG > EGC > EC > C [41][47] Đối với chè, thành phần các catechin đónggóp khoảng 70-80% khả năng kháng oxy hóa của dịch chiết.[49]
2,2-diphenyl-1-Nhiều nghiên cứu in vitro và in vivo cũng chỉ ra rằng, polyphenol chè có hiệuquả cao trong việc giảm cholesterol tổng số cũng như phần LDL trong huyết thanh,[59][76]
chống oxy hóa các acid béo,[28][31] hay quét các gốc tự do superoxyl, hydroxyl.[19][66]
Trong nghiên cứu về tác dụng của polyphenol đối với độc tố ochratoxin A ở tế bàogan, Hundhausen và cộng sự [39] đã chỉ ra rằng, EGCG có hoạt tính kháng oxi hóa caogấp 4 lần trolox và genistein, 3,4 lần daidzein và khoảng 1,3 lần quercetin
Trang 35Khả năng kháng oxi hóa của chất chiết chè xanh cũng là chủ đề của nhiềunghiên cứu Khi đánh giá khả năng này của chè xanh, hoa nhài, oải hương, hoa hồng,
sả và hương thảo thông qua khảo sát khả năng quét DPPH, khả năng kháng oxi hóatương đương trolox (TEAC) và khả năng hấp phụ gốc oxygen (ORAC assay) Tsai vàcộng sự [70] đã nhận thấy rằng, trong tất cả các thử nghiệm, chè xanh có hoạt tínhkháng oxi hóa mạnh nhất Cụ thể với DPPH, hoạt tính này của chất chiết chè xanh caogấp 1,4 lần so với hương thảo, 4,02 lần với sả, 7,3 lần với hoa nhài và 15,4 lần so vớioải hương (bảng 1.2) Trong thí nghiệm khác với cùng đối tượng, Aoshima và cộng sự[15] cũng cho quy luật tương tự
Một phương pháp xác định lực kháng oxy hoá tổng (total antioxydant capacity)khác dựa theo mô hình phospho molybdenum [56] bằng phép đo quang phổ trên cơ sởviệc khử Mo (VI) thành Mo (V) bằng chất phân tích mẫu và sự hình thành tiếp theocủa phức chất atacidic photphat / Mo (V) màu xanh lá cây Phương pháp này đã đượctối ưu hóa và đặc trưng theo khoảng cách tuyến tính, độ lặp lại và độ tái lập và hệ sốhấp thụ mol để định lượng một số chất chống oxy hóa
Phương pháp này phù hợp với quy mô và thiết bị của phòng thí nghiệm trườngĐại Học Bà Rịa Vũng Tàu nên chúng tôi quyết định sử dụng phương pháp này để xácđịnh lực kháng oxy hóa của Polyphenol lá chè xanh
1.2.5.2 Hoạt tính kháng khuẩn của polyphenol chè
Về cơ chế kháng khuẩn của polyphenol chè, các catechin đặc biệt là EGCG đãcan thiệp vào quá trình tổng hợp acid béo type II của tế bào vi khuẩn.[75] Bên cạnh đó,gốc galloyl của catechin cũng gây ra sự rối loạn đặc hiệu trong cấu trúc của lớp đôiphosphatidylcholine và phosphatidylethanolamine trong thành màng tế bào.[26] Ngoài
ra, hiệu quả sát khuẩn của catechin còn có thể liên quan đến việc tạo hydrogenperoxide – kết quả từ tác động của oxygen với EGCG.[16]
Khả năng kháng khuẩn, kháng virus, kháng nấm của polyphenol/chất chiết chèđược tổng hợp qua bảng 1.3 [49] Đối với vi khuẩn, polyphenol chè có tác dụng tốt đốivới nhiều loài vi khuẩn gây ngộ độc cũng như gây thối hỏng thực phẩm.[21]
Mendel [49] đã chỉ ra rằng, EGCG, CG, EGC thể hiện hoạt tính kháng B cereus
ở mức độ nmol, chất chiết chè xanh và chè đen đều có thể ức chế sự phát triển của C.jejuni và C coli trong vòng 4 giờ [30], nồng độ ức chế tối thiểu (minmum inhibitory
Trang 36concentration) trung bình của các catechin chè đối với S aureus và một số chủngVibrio là 192 ± 91 và 162 ± 165 µg/ml tương ứng trong khi đối với các vi khuẩn gram(-) như Salmonella và E coli là 795 ± 590 và 1519 ± 949 µg/ml tương ứng.[68]
Một số nghiên cứu đã tiến hành về ảnh hưởng của polyphenol chè đối với các visinh vật gây bệnh cho cây trồng Fukai và cộng sự [34] đã nghiên cứu ảnh hưởng củachất chiết catechin chè trên 8 chủng Erwinia gây bệnh thối rữa đối với xà lách, súp lơ,
cà chua, củ cải và 10 chủng Pseudomonas gây bệnh héo xanh (wilt), thối ướt (springrot), đốm lá (necrotic leaf spot) trên tỏi, súp lơ, xà lách…, kết quả chỉ ra rằng, catechinchè là chất ức chế tốt đối với các vi khuẩn này, nồng độ ức chế tối thiểu của cácpolyphenol chè đều dưới 100 ppm Trong số 4 cấu tử catechin thử nghiệm (EGC,EGCG, EC, ECG), thì EGCG và EGC hiệu quả hơn cả Liên quan đến khả năng khángmột số vi khuẩn gây thối hỏng thực phẩm, Yam và cộng sự [72] cũng kết luận rằng,chất chiết chè cũng như thành phần polyphenol chè có tiềm năng trong bảo quản thựcphẩm, đặc biệt khả năng kháng lại P vulgaris, P aeruginosa và S marcescens
1.3 Một số khái niệm về trích ly và các phương pháp trích ly polyphenol trong chè
1.3.1 Bản chất của quá trình trích ly
Bản chất của quá trình trích ly là sự rút chất hòa tan trong chất lỏng hay chất rắnbằng một chất hòa tan khác (gọi là dung môi) nhờ quá trình khuếch tán các chất cónồng độ khác nhau Trích ly chất hòa tan trong chất lỏng gọi là trích ly lỏng – lỏng,còn trích ly chất hòa tan trong chất rắn là trích ly rắn – lỏng [21]
1.3.2 Các phương pháp trích ly
Hiện nay tùy theo mục đích (mục đích khai thác và mức độ tinh sạch mongmuốn hay mục đích phân tích) cũng như điều kiện áp dụng công nghệ mà việc trích lycác hợp chất có trong thực vật có thể tiến hành theo một số phương pháp sau:
1.3.2.1 Kỹ thuật soxhlet
Chiết soxhlet là một trong các kỹ thuật cổ điển nhất, được đề xuất bởi nhà hóahọc người Đức Franz Ritter Von Soxhlet Đầu tiên nó được thiết kế chủ yếu cho việctách chất béo nhưng hiện nay được ứng dụng cho nhiều mục đích khác nhau, trong đó
có chiết tách các hợp chất có hoạt tính sinh học Trong chiết soxhlet, dung môi thíchhợp liên tục được bốc hơi, ngưng tụ và tiếp xúc với vật liệu rắn để tách chất mục tiêu
Trang 37trong một thiết bị chuyên dụng (bộ soxhlet) Đối với kỹ thuật này, do những hạn chếnhư làm việc gián đoạn, năng suất thấp, thời gian chiết dài nên hiện nay thường chỉđược sử dụng trong nghiên cứu, phân tích và để đối sánh với các kỹ thuật mới khác[31].
1.3.2.2 Kỹ thuật chiết ngâm (maceration)
Với kỹ thuật này, quá trình chiết thường gồm các bước cơ bản sau:
i) vật liệu được nghiền nhỏ để tăng diện tích tiếp xúc với dung môi, ii) dung môithích hợp được đưa vào trong bình chiết và được trộn đều với vật liệu, iii) tách dungmôi có chứa chất mục tiêu ra khỏi bã và ép bã để thu hồi triệt để chất mục tiêu, iv) lọclàm sạch dung môi chứa chất mục tiêu thu được Ngoài ra, trong phương pháp nàyngười ta thường kết hợp với khuấy đảo để tăng quá trình khuếch tán của chất tan vàlàm mới dung môi trên bề mặt vật liệu Từ đó làm tăng hiệu suất trích ly.[20]
Ưu điểm của phương pháp là rẻ tiền, đơn giản, dễ thực hiện, không yêu cầuthiết bị phức tạp, thích hợp với việc chiết tách các hợp chất nhạy cảm nhiệt nhưng cónhược điểm là thời gian trích ly dài và có hạn chế về hiệu suất trích ly
1.3.2.3 Kỹ thuật ngấm kiệt (percolation)
Trong kỹ thuật này, vật liệu được ngâm ngập trong dung môi và không cókhuấy đảo Khi sự chênh lệch nồng độ chất tan trong vật liệu và ngoài dung môi gầnđạt trạng thái cân bằng, dung môi chứa chất tan sẽ được chiết rút từ từ nhỏ giọt ra khỏibình chiết Đồng thời với quá trình này, dung môi mới sẽ được đưa vào để chiết kiệtchất mục tiêu trong vật liệu Kỹ thuật này có thể thực hiện đơn giản như trên hoặc cóthể tiến hành theo cách phân đoạn Trong chiết phân đoạn, dịch chiết loãng được sửdụng làm dung môi để chiết vật liệu mới
Kỹ thuật này cũng có ưu điểm là khá đơn giản, dễ áp dụng Tuy nhiên thời gianchiết dài và lượng dung môi tiêu thụ lớn
1.3.2.4 Trích ly có hỗ trợ siêu âm
Cơ sở của phương pháp này là sử dụng sóng siêu âm làm tăng cường quá trìnhphá vỡ cấu trúc tế bào, tăng cường quá trình chuyển khối, từ đó có thể làm tăng hiệusuất trích ly Bên cạnh đó, phương pháp này cũng cho phép rút ngắn thời gian trích ly
và làm giảm tiêu tốn dung môi…[3]. Tuy nhiên kỹ thuật này có thể làm tăng nhiệt của
hệ dung môi – vật liệu trong quá trình, do đó có thể không thích hợp trong trích ly các
Trang 38hoạt chất nhạy cảm nhiệt như polyphenol Ngoài ra, những khó khăn trong việc triểnkhai công nghiệp cũng là điểm hạn chế của kỹ thuật này [58].
Cuối cùng, hiện nay phương pháp này vẫn chưa có các đánh giá toàn diện nhưảnh hưởng của sóng siêu âm đến sự biến đổi cấu trúc và hoạt tính sinh học của chấtcần trích ly, hiệu suất trích ly polyphenol có thực sự được cải thiện hay không vẫnchưa có những kết luận đồng thuận Ví dụ như trong khi Tao và cộng sự [69] cho biết,trích ly polyphenol từ chè có hỗ trợ siêu âm cho phép nâng hàm lượng polyphenoltrong dịch chiết từ 22,04% lên 22,67% thì Amir và cộng sự [14] lại không nhận thấy có
sự khác biệt có ý nghĩa thống kê khi so sánh giữa trích ly polyphenol từ vỏ quả hồ trăn(Pistachia vera) có và không có hỗ trợ của sóng siêu âm với cả hai dung môi là nước
và methanol
1.3.2.5 Trích ly có hỗ trợ vi sóng
Trích ly có hỗ trợ vi sóng cũng được xem là một phương pháp mới trong trích
ly các hợp chất tự nhiên Trong kỹ thuật này, trường điện từ trong dải tần từ 300 MHztới 300 GHz thường được sử dụng Chúng tạo ra hai trường dao động trực giao làtrường từ và trường điện Trong quá trình này, năng lượng điện từ sẽ được chuyển hóathành năng lượng nhiệt.[20] Kỹ thuật này thường gồm 3 bước:[13] i) đầu tiên có sự phântách chất mục tiêu khỏi các vị trí hoạt động của vật liệu do sự tăng nhiệt độ và áp suất,ii) tiếp theo có sự di chuyển của dung môi vào trong vật liệu, iii) cuối cùng, chất mụctiêu được hòa tan vào dung môi
Ưu điểm của phương pháp này là thời gian nâng nhiệt và chiết tách nhanh, íttiêu tốn dung môi, hiệu suất thu hồi cao.[13] Tuy nhiên, nó cũng gặp những hạn chếnhư trong kỹ thuật trích ly có hỗ trợ siêu âm như kém phù hợp trong chiết tách các hợpchất nhạy cảm nhiệt và những vấn đề về thiết bị trong triển khai công nghiệp.[103]
1.3.2.6 Trích ly siêu tới hạn
Cơ sở của phương pháp: khi chất khí ở nhiệt độ và áp suất trên điểm tới hạn(gọi là chất lỏng tới hạn) nó bộc lộ khả năng của một dung môi, nhưng có độ nhớt vàkhả năng khuếch tán của một chất khí Chất lỏng siêu tới hạn có khả năng khuếch táncao, tính vận chuyển tốt hơn một chất lỏng thường vì vậy nó có khả năng thích ứng vớiquá trình chiết tách Trong kỹ thuật này, CO2 thường được lựa chọn vì nó có mật độtới hạn cao (0,47 g/cm3).[63]
Trang 39Ưu điểm chính của phương pháp này là có thể tiến hành ở nhiệt độ thấp, có thể giảm thiểu sự oxi hóa các chất cần trích ly, an toàn không độc hại và không tốn năng lượng để tách dung môi (chất lỏng tới hạn) sau trích ly.[63][58] Tuy nhiên nhược điểm chính của phương pháp này là đầu tư trang thiết bị lớn và hiệu quả thấp đối với việc trích ly các hợp chất phân cực như catechin chè Để sử dụng phương pháp này cho trích ly polyphenol, người ta thường phải kết hợp CO2 siêu tới hạn với một dung môi phân cực khác như ethanol.
Sau hơn 30 năm phát triển, phương pháp này hiện đã được phát triển ở quy môcông nghiệp trong việc tách caffeine từ cà phê và hoa húp lông.[58]
1.3.2.7 Chiết dung môi ở áp suất cao
Phương pháp này lần đầu tiên được mô tả bởi Richter và cộng sự vào năm
1996.[20] Cơ sở của phương pháp là sử dụng áp suất cao trong quá trình chiết để lưugiữ trạng thái lỏng của dung môi trên điểm sôi của nó Do vậy, điều kiện làm việc này(nhiệt độ và áp suất cao) sẽ làm tăng khả năng hòa tan của chất mục tiêu, giảm độ nhớt
và sức căng bề mặt của dung môi Điều này cho phép làm tăng tốc độ chuyển khối vàcải thiện hiệu suất trích ly Bên cạnh đó, khả năng có thể tự động hóa quá trình cũng làmột trong các ưu thế của kỹ thuật này.[40] Tuy vậy, với điều kiện làm việc ở nhiệt độ
và áp suất cao có thể kém phù hợp trong việc chiết tách các hợp chất nhạy cảm nhiệtnhư catechin chè
1.3.2.8 Trích ly bằng dung môi có hỗ trợ enzym
Xử lý enzyme của các mẫu thực vật là một kỹ thuật khác phù hợp để giải phóngcác hợp chất phenolic Phenolics trong vật liệu thực vật dường như được liên kết vớicác polysacarit vách tế bào thực vật bởi cả hai liên kết kỵ nước và kỵ nước.Việc bổsung các enzyme có thể làm tan rã các liên kết thành tế bào phenolic và tăng cườngchiết xuất phenolic Gần đây, thủy phân enzyme sử dụng kết hợp pectinase, cellulase
và hemiaellulase đã được chứng minh là tăng cường chiết xuất phenolic từ chất thảirắn mâm xôi Maier et al đã phát triển ứng dụng enzyme để chiết xuất phenolic từbưởi nho Kapasakalidis và cộng sự đã báo cáo rằng các chế phẩm enzyme cellulosethương mại thúc đẩy việc chiết xuất polyphenol và anthocyanin từ quả bưởi đen Trongmột nghiên cứu khác, việc so sánh ứng dụng của ba loại chế phẩm enzyme khác nhaubao gồm-amylase, Viscozyme L và Ultraflo L đã được tiến hành trên thân cây
Trang 40Ipomoea batatas (khoai lang) Ultraflo L và Viscozyme L tạo điều kiện phục hồiphenolic và dẫn đến sản lượng axit ferulic và axit vanillic cao hơn, tương ứng, trongchiết xuất Hong và Van Veit đã so sánh các kỹ thuật của UAE và chiết xuất các hợpchất phenol có hỗ trợ enzyme từ quả acerola, ngược lại, sản lượng phenolics cao hơnbằng phương pháp mới của UAE so với chiết xuất enzyme.
Nhận xét chung về các phương pháp trích ly:
Như đã trình bày ở phần trên, Tất cả các kỹ thuật chiết tách polyphenol từ lá trà xanh đều có lợi thế và hạn chế riêng Chính vì vậy, chúng tôi đã lựa chọn nghiên cứu các điều kiện chiết tách cho phương pháp chiết polyphenol trong lá chè bằng dung môi, ngoài ra khảo sát thêm sự hỗ trợ của một số enzym nhằm cải thiện và tối ưu hóa cả hiệu suất trích ly cùng hoạt tính sinh học của dịch chiết polyphenol/catechin đồng thời phù hợp với điều kiện của phòng thí nghiệm Đại Học Bà Rịa Vũng Tàu và
dễ dàng triển khai ở quy mô nhỏ so với các nghiên cứu đã từng được tiến hành ở Việt Nam.
1.4 Ảnh hưởng của các yếu tố công nghệ đến hiệu suất trích ly và chất lượng của sản phẩm
Những nghiên cứu trên thế giới về chiết tách polyphenol chè nhìn chung cũngtập trung chủ yếu đến việc tìm hiểu ảnh hưởng của các yếu tố công nghệ đến hiệu suấttrích ly và chất lượng của sản phẩm thu được (hoạt tính kháng oxi hóa, kháng khuẩncủa dịch chiết/chất chiết polyphenol)
1.4.1 Ảnh hưởng của dung môi và nồng độ dung môi
Việc lựa chọn dung môi có thể ảnh hưởng đến cả loại và hàm lượng các hợpchất phenol chiết tách được Độ hòa tan của các hợp chất phenol chịu ảnh hưởng lớnbởi độ phân cực của dung môi sử dụng Trong chiết xuất các hợp chất phenol, cácdung môi có độ phân cực cao như nước hoặc ít phân cực như chlorofom hay hexanethường không cho hiệu suất thu hồi cao.[46] Dung môi nước tuy an toàn nhưng thườnglàm cho dịch chiết có lượng tạp chất lớn, gây khó khăn cho việc làm sạch về sau Nếuquá trình chiết hướng tới nhiều loại hợp chất khác nhau cùng tồn tại trong vật liệu,người ta thường sử dụng hỗn hợp các loại dung môi để tạo ra một dung dịch có độphân cực trung bình Điều này cho phép cải thiện hiệu suất trích ly đối với tổng thể cáchợp chất đích.[46] Trong chiết tách các hợp chất phenolic chè, dung môi thường được