Luận văn nghiên cứu phát hiện và định lượng một số đột biến của hội chứng động kinh, giật cơ với sợi cơ không đều MERRF ở người việt nam

Nhằm góp phần vào việc chẩn đoán, điều trị và tư vấn di truyền đối với cácbệnh nhân, gia đình bệnh nhân mang hội chứng MERRF chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu phát hiện và định lượ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-Bùi Thị Khánh

NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ ĐỘT BIẾN CỦA HỘI CHỨNG ĐỘNG KINH, GIẬT CƠ VỚI SỢI CƠ

KHÔNG ĐỀU – MERRF Ở NGƯỜI VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS.TS Phan Tuấn Nghĩa

Hà Nội

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến GS.TS.Phan Tuấn Nghĩa, thầy đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, tạo mọi điều kiện chotôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Tôi xin trân trọng cảm ơn TS Nguyễn Thị Hồng Loan, ThS Nguyễn VănMinh và CN Phùng Bảo Khánh và các anh chị em làm việc tại phòng Protein tái tổhợp thuộc Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein, Trường Đạihọc Khoa học Tự Nhiên đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực nghiệm

Tôi xin chân thành cám ơn Ban giám hiệu Trường Cao đẳng Y tế Thái Bình,Trưởng khoa Y học cơ sở và các anh em trong bộ môn Y học cơ sở đã tạo điều kiệnthuận lợi cho tôi được đi học nâng cao trình độ của mình

Tôi xin chân thành cảm ơn đến toàn thể thầy, cô giáo trong Bộ môn Sinh

lý thực vật và Hóa sinh, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên

đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu trong suốt thời gian học tập vànghiên cứu

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Ban Giám hiệu, Phòng Sau Đại học, Ban Chủnhiệm Khoa Sinh học và các Phòng chức năng của Trường Đại học Khoa học

Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tạo điều kiện cho tôi học tập, hoànthành chương trình học Cao học

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình và bạn bè đã luôn độngviên, khích lệ tôi hoàn thành khóa học

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN … ……… ii

MỤC LỤC … ……… iii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT….……….…….vi

DANH MỤC CÁC BẢNG viii

DANH MỤC CÁC HÌNH……… xii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 CẤU TRÚC VÀ CHỨC NĂNG CỦA TY THỂ NGƯỜI 3

1.1.1 Cấu trúc của ty thể 3

1.1.2 Chức năng của ty thể 6

1.1.2.1 Ty thể hoạt động như một nhà máy năng lượng của tế bào 6

1.1.2.2 Ty thể và quá trình lão hóa 7

1.1.2.3 Ty thể và quá trình tự chết của tế bào 9

1.1.3 Hệ gen ty thể và đặc điểm di truyền của hệ gen ty thể 10

1.1.3.1 Hệ gen ty thể 10

1.1.3.2 Đặc điểm di truyền của hệ gen ty thể 12

1.1.3.3 Tính chất dị tế bào chất và tốc độ đột biến của ty thể 12

1.2 ĐỘT BIẾN GEN TY THỂ VÀ CÁC BỆNH LIÊN QUAN 13

1.2.1 Các loại đột biến gen ty thể 13

1.2.1.1 Đột biến điểm 14

1.2.1.2 Đột biến cấu trúc mtDNA 15

1.2.2 Các bệnh do đột biến gen ty thể 15

1.2.2.1 Hội chứng gây ra bởi các đột biến điểm phổ biến trên gen mã hóa tRNA 17

1.2.2.2 Các hội chứng liên quan đến các đột biến điểm phổ biến trên gen mã hóa protein 19

1.2.2.3 Các bệnh liên quan đến các đột biến trên gen mã hóa rRNA 21

1.2.2.4 Bệnh gây nên bởi các đột biến khác trên mtDNA 22

1.3 HỘI CHỨNG ĐỘNG KINH, GIẬT CƠ VỚI SỢI CƠ KHÔNG ĐỀU (MERRF) 24

1.3.1 Các đột biến của hội chứng MERRF 25

1.3.1.1 Đột biến A8344G 25

1.3.1.2 Đột biến T8356C 26

1.3.1.3 Đột biến G8363A 26

1.3.2 Những tác động của hội chứng MERRF trên người bệnh 27

1.3.3 Các phương pháp phát hiện đột biến MERRF 29

1.3.3.1 Phát hiện đột biến thuộc hội chứng MERRF bằng PCR kết hợp với RFLP ………29

1.3.3.2 Phân tích đột biến thuộc hội chứng MERRF bằng xác định trình tự gen … ……… 30

1.3.3.3 Kỹ thuật đa dạng cấu hình sợi đơn SSCP (single-stranded conformational polymorphism) ……… 30

1.3.3.4 Định lượng đột biến gen ty thể bằng phương pháp real-time PCR ……… ………31

1.3.3.5 Phát hiện đột biến DNA ty thể bằng hệ thống cảm biến sinh học 31

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33

2.1 NGUYÊN LIỆU 33

2.1.1 Mẫu bệnh phẩm 33

2.1.2 Các hóa chất, nguyên liệu khác 33

2.2 MÁY MÓC VÀ TRANG THIẾT BỊ 33

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34

2.3.1 Tách chiết DNA tổng số 34

2.3.2 Kiểm tra và định lượng DNA tách chiết 34

2.3.3 Nhân bản đoạn gen ty thể bằng kỹ thuật PCR 35

2.3.4 Kỹ thuật PCR kết hợp với kỹ thuật đa hình chiều dài các đoạn phân cắt giới hạn (PCR-RFLP) 36

2.2.5 Điện di trên gel agarose 36

2.2.6 Điện di trên gel polyacrylamide 37

2.2.7 Kỹ thuật real-time PCR sử dụng mẫu dò huỳnh quang dạng khóa cầu axit nucleic (LNA-locked nucleic acid) 38

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 42

3.1 THU THẬP MẪU MÁU BỆNH NHÂN VÀ TÁCH CHIẾT DNA

TỔNG SỐ 42

3.1 Một số đặc điểm của mẫu phân tích 42

3.2 Tách chiết DNA tổng số của các mẫu 42

3.2 SÀNG LỌC CÁC ĐỘT BIẾN GEN THUỘC HỘI CHỨNG MERRF Ở NGƯỜI VIỆT NAM BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR-RFLP 43

3.2.1 Sàng lọc đột biến A8344G 43

3.2.1.1 Nhân bản đoạn gen từ 8155 - 8366 bằng PCR 43

3.2.1.2 Phân tích sự có mặt của đột biến A8344G bằng PCR-RFLP 44

3.2.2 Sàng lọc đột biến T8356C 46

3.2.1.1 Nhân bản đoạn gen từ 8166 - 8358 bằng PCR 46

3.2.2.2 Phân tích sự có mặt của đột biến T8356C bằng PCR-RFLP 47

3.2.3 Sàng lọc đột biến G8363A 48

3.2.1.1 Nhân bản đoạn gen từ 8342 - 8582 48

3.2.2.2 Phân tích sự có mặt của đột biến G8363A bằng PCR-RFLP 50

3.3 XÂY DỰNG ĐƯỜNG CHUẨN ĐỂ ĐỊNH LƯỢNG ĐỘT BIẾN A8344G BẰNG KỸ THUẬT REAL-TIME PCR 52

3.3.1 Thiết kế mẫu dò huỳnh quang Taqman LNA 52

3.3.1.1 Thiết kế mẫu dò huỳnh quang Taqman LNA 52

3.3.1.2 Đánh giá tính đặc hiệu của mẫu dò đột biến A8344G 54

3.3.2 Xây dựng đường chuẩn và đánh giá độ tin cậy của phương pháp real-time PCR để định lượng đột biến A8344G 56

3.3.2.1 Định lượng số bản sao của plasmid mang đoạn gen đột biến và không đột biến A8344G 56

3.3.2 2 Kết quả xây dựng đường chuẩn đột biến A8344G 56

3.2.4 Thử nghiệm khả năng phát hiện và định lượng đột biến A8344G 60

3.4 SÀNG LỌC ĐỘT BIẾN GEN THUỘC HỘI CHỨNG MERRF BẰNG PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ TRỰC TIẾP 61

3.4.1 Kết quả giải trình tự vùng gen mang đột biến MERRF 8155-9292 trên hệ gen ty thể 61

KẾT LUẬN 63

TÀI LIỆU THAM KHẢO 64

PHỤ LỤC ……… 79

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

APS Ammonium persulfate

ANT Adenine nucleotide translocase

ADP Adenosine diphosphate

ATP Adenosine triphosphate

bp Base pair (cặp bazơ)

BFQ Black fluorescence quencher (chất hấp phụ huỳnh quang)CoQ Coenzyme Q

CPEO Chronic progressive external ophthalmoplegia

(Bệnh liệt mắt cơ ngoài tiến triển kinh niên)

Cyt c Cytochrome c

Cyt b Cytochrome b

D-loop Vòng chuyển vị

dNTP Deoxyribonucleoside triphosphate

ddH2O Deionized distilled H2O (nước cất loại ion, khử trùng)

EtBr Ethidium bromide

FAD+ Flavin adenine dinucleotide (dạng oxi hóa)

FADH2 Flavin adenine dinucleotide (dạng khử)

IPTG Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranoside

KSS Kearns-Sayre syndrome (Hội chứng KSS)

LHON Leber’s hereditary optic neuropathy

(Bệnh liệt thần kinh thị giác di truyền theo Leber)

LNA Locked nucleic acid (nucleotide dạng khóa)

MELAS Mitochondrial encephalopathy, lactic acidosis, stroke-like Episodes (Hội chứng não giật cơ, tăng acid lactic máu và giả tai biến mạch)

MERRF Myoclonic epilepsy with ragged-red fibres

(Hội chứng động kinh, giật cơ với sợi cơ không đều)

MIDD Maternally inherited diabetes and deafness

(Bệnh tiểu đường và câm điếc di truyền theo mẹ)

MRI Magnetic resonance image (Hình ảnh chụp cộng hưởng từ) mtDNA Mitochondrial DNA (DNA ty thể)

nDNA Nuclear DNA (DNA nhân)

NAD+ Nicotinamide adenine dinucleotide (dạng oxi hóa)

NADH Nicotinamide adenine dinucleotide (dạng khử)

NARP Neuropathy, ataxia and retinitis pigmentos

(Hội chứng gây liệt, mất sự điều hòa và viêm võng mạc

OD Optical density (Mật độ quang học)

PCR Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi polymerase)

PEO Progressive external ophthalmoplegia

(Bệnh liệt cơ mắt ngoài tiến triển)

RFLP Restriction fragment length polymorphism

(Sự đa hình các đoạn phân cắt giới hạn)

ROS Reactive oxygen species (dạng oxy phản ứng)

SDS Sodium dodecylsulphate

TAE Tris -Acetate-EDTA

TBE Tris -Borate-EDTA

TEMED N, N, N’, N’- Tetramethyl-Ethylenediamine

Tm Melting temperature (Nhiệt độ tách chuỗi)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Các biểu hiện và triệu chứng lâm sàng của 62 bệnh nhân

MERRF 28

Bảng 2.1: Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR các đoạn gen mang đột biến MERRF 35

Bảng 2.2: Thành phần bản gel polyacrylamide 12% 37

Bảng 2.3: Trình tự của mồi và mẫu dò dùng cho real-time PCR 40

Bảng 3.1: Trình tự mồi nhân đoạn gen 8155 - 8366 43

Bảng 3.2: Trình tự và sản phẩm cắt của enzyme BanII 45

Bảng 3.3: Trình tự mồi cho phản ứng PCR đoạn gen 8166 - 8358 46

Bảng 3.4: Trình tự mồi cho PCR đoạn gen 8342 - 8582 49

Bảng 3.5: Trình tự của mẫu dò dùng cho real-time PCR 53

Bảng 3.6: Tương quan giữa nồng độ DNA plasmid mang đột biến và không đột biến A8344G ban đầu và số chu kỳ ngưỡng được xác định bằng real-time PCR 57

Bảng 3.7: Tỷ lệ phần trăm plasmid đột biến 8344G pha sẵn 58

Bảng 3.8: Kết quả thực nghiệm tỷ lệ phần trăm đột biến của mẫu chuẩn 59

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc ty thể 3

Hình 1.2 Cấu tạo màng ty thể 4

Hình 1.3 Hệ gen ty thể 10

Hình 2.1 Cấu trúc của nucleotide cải biến dạng LNA 38

Hình 2.2 Nguyên lý hoạt động của mẫu dò Taqman 39

Hình 3.1 Điện di sản phẩm DNA tổng số từ mẫu máu của các bệnh nhân 42

Hình 3.2 Kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn gen 8155 - 8366 44

Hình 3.3 Điện di sản phẩm PCR-RFLP đoạn gen 8155 - 8366 của bệnh nhân .45

Hình 3.4 Kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn gen 8166 - 8385 47

Hình 3.5 Điện di sản phẩm PCR-RFLP đoạn gen 8166 - 8385 của bệnh nhân .48

Hình 3.6 Kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn gen 8342 - 8582 49

Hình 3.7 Điện di sản phẩm PCR-RFLP đoạn gen 8166 - 8385 của bệnh nhân .50

Hình 3.8 Kết quả kiểm tra mẫu dò ……… 60

Hình 3.9 Biểu đồ khuếch đại đoạn gen mang đột biến và không mang đột biến A8344G bằng real-time PCR 57

Hình 3.10 Sự tương quan giữa tỷ lệ đột biến thực tế và tỷ lệ đột biến lý thuyết

59 Hình 3.11 Thử nghiệm định lượng 5 mẫu bệnh phẩm không mang đột biến A8344G bằng real-time PCR 60

Hình 3.12 Kết quả blast của trình tự 29 mẫu bệnh với trình tự chuẩn J01415.2 .62

MỞ ĐẦU

Trong hầu hết các tế bào, ty thể là bào quan quan trọng đảm nhiệm chức năngcung cấp năng lượng dưới dạng ATP cho các hoạt động của tế bào Ty thể sản xuấtnăng lượng bằng cách oxy hóa hoàn toàn các hợp chất trung gian của quá trìnhchuyển hóa thức ăn của cơ thể tạo thành sản phẩm cuối cùng là H2O, CO2, và nănglượng dưới dạng ATP

Ty thể có hệ gen riêng, nhân bản độc lập với hệ gen nhân DNA ty thể ngườitồn tại ở dạng mạch vòng kép, có kích thước 16.569 bp, với 37 gen, mã hóa cho 2RNA ribosome, 22 RNA vận chuyển và 13 protein là thành phần cần thiết trong cácphức hợp của chuỗi hô hấp DNA ty thể dễ bị tổn thương do ty thể là môi trườnggiàu dạng oxy phản ứng và thiếu cơ chế sửa chữa hiệu quả dẫn đến nhiều đột biếnxuất hiện trong hệ gen ty thể Hầu hết các hoạt động của tế bào đều dựa vào nguồnnăng lượng ổn định do ty thể cung cấp, do đó những sai hỏng trong DNA ty thể cóthể gây ra sự rối loạn đa hệ thống ảnh hưởng đến nhiều tế bào, mô và các tổ chứckhác nhau

Năm 1988, Wallace và tập thể đã công bố đột biến điểm đầu tiên trên hệ gen tythể người gây bệnh liên quan đến thần kinh thị giác di truyền theo Leber (Leber’shereditary optic neuropathy - LHON) Cho đến nay, hơn 300 đột biến khác nhautrong hệ gen ty thể người đã được xác định, trong đó có hơn 250 đột biến có khảnăng gây bệnh và kèm theo nhiều hội chứng khác nhau

MERRF (myoclonic epilepsy with ragged-red fibres) là hội chứng động kinhgiật cơ với sợi cơ không đều, ảnh hưởng đến hệ thần kinh và cơ xương cũng nhưcác hệ thống khác của cơ thể, gây nên bởi những đột biến trên gen MT-TK củaDNA ty thể Ngoài ra, người mang hội chứng MERRF có thể kèm theo động kinh,mất điều hòa vận động, suy nhược và mất trí nhớ Triệu chứng thường khởi phát ởtrẻ em sau một giai đoạn phát triển bình thường, kết quả hay gặp là điếc, thấp bé,thoái hóa thần kinh thị giác, đôi khi quan sát được các u mỡ khu trú dưới da Tế bào

cơ bất thường và xuất hiện sợi cơ màu đỏ bị xé rách nham nhở khi nhuộm vớiGomori trichrome và quan sát dưới kính hiển vi.

Hiện nay, trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu về hội chứngMERRF để xác định nguyên nhân, cơ chế biểu hiện bệnh cũng như tính di truyềncủa bệnh Tuy nhiên, do tính phức tạp trong tác động lâm sàng, mô bệnh học, cơchế phát sinh và biểu hiện bệnh nên việc chẩn đoán bằng phương pháp thăm khámlâm sàng hay bằng các xét nghiệm thường quy là rất khó khăn, vì thế nhiều bệnhnhân MERRF vẫn chưa được phát hiện và không có phương pháp điều trị hiệu quả

Ở Việt Nam, gần như chưa có công trình nào đi sâu nghiên cứu phát hiện vàđịnh lượng đột biến MERRF ở người Việt Nam

Nhằm góp phần vào việc chẩn đoán, điều trị và tư vấn di truyền đối với cácbệnh nhân, gia đình bệnh nhân mang hội chứng MERRF chúng tôi tiến hành đề tài:

“Nghiên cứu phát hiện và định lượng một số đột biến của hội chứng động kinh, giật cơ với sợi cơ không đều - MERRF ở người Việt Nam“

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 CẤU TRÚC VÀ CHỨC NĂNG CỦA TY THỂ NGƯỜI

1.1.1 Cấu trúc của ty thể

Ty thể là bào quan phổ biến được tìm thấy trong hầu hết các tế bào nhânchuẩn Chức năng chính của ty thể là cung cấp năng lượng hóa học cần thiết chocác hoạt động sinh tổng hợp và vận động của tế bào Ty thể được lần đầu tiên tìmthấy trong tế bào cơ năm 1857 bởi nhà giải phẫu học người Thụy Sĩ, Kollier.Đến năm 1890, nhà mô học người Đức, Richard Altmann, bằng phương phápnhuộm fuchsine đã quan sát được ty thể ở nhiều tế bào khác nhau dưới kính hiển

vi quang học [27].Ty thể có đường kính khoảng 0,5-2 µm và chiều dài 7-10 µm.Hình dạng và số lượng ty thể tùy thuộc vào nhu cầu năng lượng của mỗi loại tếbào khác nhau, các tế bào mô cơ xương hoặc thận cần một lượng ty thể lớn hơncác tế bào khác trong cơ thể Ty thể có thể hình cầu, hình que hay hình sợi nhưngđều có cấu trúc chung giống nhau Ty thể có khả năng thay đổi hình dạng, kíchthước, có thể liên kết với nhau tạo ra những cấu trúc dài hơn hoặc phân ra thànhnhững cấu trúc nhỏ hơn Ngoài ra, ty thể có khả năng di chuyển để phản ứng vớinhững thay đổi sinh lý bên trong tế bào [35]

Hình 1.1 Cấu trúc ty thể [68]

Về cấu trúc, ty thể có cấu tạo dạng màng kép, gồm màng trong và màng ngoài,bao lấy khối chất nền bên trong, khoảng cách giữa hai màng được gọi là xoang gianmàng Cả hai màng đều có bản chất là lipoprotein tương tự như màng sinh chất,nhưng có sự khác biệt về hình dạng và các tính chất lý hóa chuyên trách cho việcthực hiện các chức năng sinh hóa của chúng [35]

Màng ngoài của ty thể có độ dày 6 nm, có tỷ lệ protein (P)/ lipid (L) lớn hơnhoặc bằng 1 Màng ngoài ty thể chứa tỷ lệ cholesterol thấp (bằng 1/6 so với màng tếbào hồng cầu), tỷ lệ phosphatidyl choline cao gấp hai lần so với màng tế bào Màngngoài có nhiệm vụ tiếp thu phần lớn protein sản xuất từ tế bào chất để xây dựng tythể và kiến tạo màng Đặc biệt, màng ngoài của ty thể có tính bán thấm rộng hơnvới các ion và các phân tử lớn cho phép các ion di chuyển tự do từ ngoài nguyênsinh chất vào xoang gian màng và ngược lại Màng ngoài ty thể còn chứa nhiềuenzyme quan trọng như các transferase, các kinase, cytochrome-reductase, acylCoA synthetase [35]

Hình 1.2 Cấu tạo màng ty thể [67]

Màng trong của ty thể có độ dày 6 nm, protein chiếm 80%, lipid chiếm 20%,

và một lượng nhỏ cholesterol Tỷ lệ giữa cholesterol/phospholipid là 1/53 Màngtrong ăn sâu vào chất nền tạo nên các mào răng lược Cấu trúc “mào” làm tăng diệntích bề mặt của màng trong gấp ba lần so với màng ngoài và điều này liên quan đếnchức năng của nó là tăng cường vận chuyển điện tử và tổng hợp ATP Màng trong

chứa nhiều protein vận chuyển chủ động ATP, ADP, acid béo và các proteinkênh vận chuyển các ion Na+, K+, Ca2+ và H+ Màng trong là nơi bám của 5 phứchợp thuộc chuỗi hô hấp bao gồm chuỗi vận chuyển điện tử (phức hợp I-IV), ATPsynthase (phức hợp V, còn gọi là F1F0-ATPase) và adenine nucleotidetranslocase (ANT) [9].

Xoang gian màng (khoảng xen kẽ giữa hai màng) là nơi trung chuyển các chấtgiữa hai màng, môi trường cũng tương tự và cân bằng với bào tương của tế bào.Xoang gian màng chứa nhiều ion H+ từ chất nền đi ra do hoạt động của chuỗi vận

chuyển điện tử, chứa cytochrome c (Cyt c) là chất mang điện tử cơ động cho chuỗi

hô hấp, giải phóng Cyt c vào bào tương sẽ hoạt hóa enzyme caspase có vai trò trongquá trình chết theo chương trình của tế bào [32]

Chất nền (matrix) là một vùng vật chất không định hình chứa nhiều cấu trúcđặc biệt Chất nền này là một phức hệ protein tan trong nước, tương đối đậm đặc vàchứa các enzyme của chu trình Krebs, các enzyme của quá trình oxy hóa acid béo,acid amin và bộ máy di truyền riêng của ty thể Như vậy, ở tế bào động vật, thực vật

và người ngoài hệ gen nhân, còn có hệ gen tế bào chất nằm trong ty thể Ty thể cóvật chất di truyền và bộ máy của riêng nó để tổng hợp nên các RNA cũng nhưprotein của chúng Các DNA ngoài nhiễm sắc thể này mã hóa một số các peptidecủa ty thể (ở người là 13 loại peptide) Các peptide này gắn vào lớp màng trongcùng với các protein khác được mã hóa trong nhân tế bào [32]

Ty thể nhân lên theo phương thức rất giống với tế bào vi khuẩn Khi chúng trởnên quá lớn, chúng bắt đầu chia đôi Quá trình này xảy ra sau khi bộ DNA của tythể được nhân đôi hoàn toàn, được thực hiện bằng sự tạo thành rãnh bên trong vàsau đó màng ngoài thắt lại hình thành hai ty thể con Đôi khi các ty thể mới đượctổng hợp ở các trung tâm giàu protein và polyribosome cần thiết Tuy nhiên, nhiều

ty thể không phân đôi và bị phân hủy trong lyzosome theo cơ chế tự tiêu(autophagy) Cơ chế này giúp duy trì số lượng ty thể đặc trưng trong một tế bào [9]

1.1.2 Chức năng của ty thể

1.1.2.1 Ty thể hoạt động như một nhà máy năng lượng của tế bào

Ty thể đóng vai trò trung tâm trong quá trình chuyển hóa năng lượng của tếbào Quá trình hô hấp biến đổi hóa học và trao đổi chất tại ty thể đã giúp chúngchuyển đổi năng lượng hóa học tiềm tàng trong các hợp chất hữu cơ tạo ra CO2,

H2O và giải phóng năng lượng vào phân tử cao năng ATP ATP được tạo thành từquá trình phosphoryl hóa oxy hóa dựa trên các phức hệ hô hấp (gọi là chuỗi vậnchuyển điện tử) nằm trên màng trong của ty thể Quá trình oxy hóa của tế bào sửdụng nguồn các đương lượng khử NADH và FADH2 như nguồn điện tử chính trongchuỗi vận chuyển điện tử Các thành phần của chuỗi vận chuyển điện tử nằm ởmàng trong của ty thể bao gồm bốn phức hợp I, II, III và IV và một số chất mangđiện tử Các điện tử được vận chuyển dọc theo chuỗi, ba trong bốn phức hợp hoạtđộng như máy bơm proton, đẩy proton từ chất nền tạo thành dòng chuyển proton.Nhờ gradient proton và sự chênh lệch điện thế qua màng, mà ATP được tổng hợp từADP và Pi bởi phức hệ F0F1 synthase, do đó cho phép các proton trở lại chất nền

Sự kết hợp vận chuyển điện tử và tổng hợp ATP hoạt động theo cơ chế hóa thẩm

Có hai giai đoạn tạo ra ATP ở ty thể, đó là chu trình Krebs diễn ra trong chất nền vàquá trình phosphoryl hóa oxy hóa ở chuỗi vận chuyển điện tử nằm ở màng trong tythể với sự xúc tác của các phức hệ enzyme [23]

Nguồn tạo ra năng lượng trong ty thể là carbohydrate, chất béo và proteinđược lấy từ thức ăn, trong đó chủ yếu là carbohydrate Các hợp chất carbohydrate,chủ yếu là glucose thông qua quá trình đường phân (glycolysis) được phân cắt vàbiến đổi cuối cùng tạo thành pyruvate, chất khử NADH và một lượng ATP.Pyruvate được đưa vào ty thể và bị oxy hóa, decarboxyl hóa để tạo thành acetyl-CoA (acetyl-CoA có thể tạo ra từ quá trình oxy hóa acid béo) và tiếp tục được oxyhóa hoàn toàn qua chu trình Krebs để tạo thành CO2, H2O và năng lượng chủ yếuđược tích trữ dưới dạng ATP Trong chu trình Krebs, điện tử và proton H+ đượctách ra và chuyển đến các phân tử nhận điện tử là NAD+ và FAD trong chuỗi vận

chuyển điện tử để tạo thành NADH và FADH2 Chuỗi vận chuyển điện tử bao gồmbốn phức hợp: nicotinamide adenine dinucleotide coenzyme Q reductase (NADH-CoQ reductase/ phức hệ I), succinate CoQ reductase (phức hệ II), ubiquinolcytochrome b reductase (phức hệ III), cytochrome c oxidase (phức hệ IV) và haiphân tử vận chuyển điện tử giữa các phức hệ là coenzyme ubiquinone (CoQ) vàCyt c Phức hệ I và II có vai trò xúc tác cho sự nhận điện tử của CoQ từ NADH vàsuccinate Sau đó phức hệ III xúc tác cho quá trình chuyển điện tử từ CoQ đến Cyt

c Cuối cùng phức hệ IV xúc tác cho sự vận chuyển điện tử từ Cyt c tới chất nhậncuối cùng là oxy phân tử Ở mỗi giai đoạn, điện tử đi qua các phức hệ, năng lượngđược giải phóng ra kèm theo việc bơm các proton (H+) từ chất nền qua màng trong

ra xoang gian màng và làm xuất hiện điện thế màng Do đó, hệ thống F0F1synthase hoạt động và tổng hợp ATP từ ADP và phosphate vô cơ [35]

ATP là nguồn năng lượng lớn được sử dụng cho tất cả các quá trình trao đổichất cần thiết bên trong tế bào Vì vậy, khi ty thể bị tổn thương, quá trình sản sinh

ra năng lượng bị chậm lại, thậm chí là ngừng lại hoàn toàn Pyruvate không đượcchuyển hóa tiếp, nên bị biến đổi thành lactate, vì vậy các bệnh nhân bị bệnh ty thểthường có hàm lượng lactate trong máu và trong dịch não tủy cao Do gần như tất

cả các tế bào đều dựa vào nguồn năng lượng ổn định do ty thể cung cấp nên khi tythể bị tổn thương có thể gây ra sự rối loạn đa hệ thống, ảnh hưởng đến nhiều loại tếbào cũng như mô và các cơ quan [35]

1.1.2.2 Ty thể và quá trình lão hóa

Lão hóa là một quá trình sinh học phức tạp, là yếu tố nguy cơ lớn cho sự pháttriển của ung thư, thoái hóa thần kinh và các bệnh tim mạch Cơ chế phân tử của sựlão hóa là vấn đề phức tạp, tuy nhiên quá trình oxy hóa và nitrate hóa protein trong

tế bào đã được đề xuất là cơ sở cho việc suy giảm chức năng của tế bào và làm giảmkhả năng chống chịu của cơ thể [60]

Các gốc tự do, chủ yếu là các dạng oxy phản ứng (ROS – Reactive oxygenspecies) được xem là những phân tử tín hiệu của nhiều hoạt động sinh lý Những

năm 1990, hydrogen peroxide được phát hiện là có liên quan đến cytokine, insulin,yếu tố tăng trưởng, AP-1 và tín hiệu NF-кB [48] Sau đó, nhiều báo cáo chỉ ra rằngB [48] Sau đó, nhiều báo cáo chỉ ra rằng

H2O2 có thể thúc đẩy sự bất hoạt phosphatase bằng sự oxy hóa cysteine làm ảnhhưởng đến con đường truyền tín hiệu [58]

Hệ quả của các phản ứng hô hấp trong ty thể là các điện tử chưa ghép cặp, sựtương tác của các điện tử này với oxy tạo thành các gốc superoxide rất hoạt động,các gốc tự do có hoạt tính cao Có 8điểm trong ty thể có khả năng sản xuất O2-,superoxide được chuyển hóa thành hydrogen peroxide (H2O2) bởi superoxidedismutase (SOD) khi có sự tham gia của một điện tử và 2 proton H+ [48]

Ngày càng có nhiều bằng chứng cho thấy rằng ROS có thể gây ra những thayđổi trong quá trình dịch mã protein Cụ thể, H2O2 có thể oxy hóa nhóm thiol (-SH)trong cysteine để tạo thành axit sulphenic (-SOH), tiếp theo phản ứng với GSH sinh

ra glutathionylate (-SSG) mang liên kết disulfide (-S-S-) hoặc amide sulfenyl (-SN).Mỗi sự thay đổi này có thể ảnh hưởng đến hoạt động của một protein nhất định.Phosphorylase bị tác động khá nặng bởi ROS, làm ức chế hoạt động tách gốcphosphate [48]

Hơn nữa, các gốc tự do khác như các gốc hydroxyl (OH.) và hydrogenpeoxyde (H2O2) cũng có thể tồn tại ở nồng độ tương đối cao, gây nên nguy cơ oxyhóa lipid làm tổn thương màng tế bào và ảnh hưởng đến cấu trúc DNA Đáng chú ýrằng sự tác động của các gốc tự do này tới DNA ty thể sẽ lớn hơn DNA trong nhân

do DNA ty thể không liên kết với Histone và không có cơ chế tự sửa chữa Khảnăng tạo năng lượng ATP của ty thể giảm và tăng quá trình oxy hoá làm hư hại cấutrúc tế bào Gốc tự do có thể phá rách màng tế bào khiến chất dinh dưỡng thất thoát,

tế bào không tăng trưởng, không được sửa chữa và chết ROS phá hủy hoặc ngăncản sự tổng hợp protein, lipid, đường, tinh bột, enzyme trong tế bào, làm chocollagen, elastin mất tính đàn hồi khiến da nhăn nheo, cơ khớp cứng nhắc [22] ROS được cho là tác nhân chính gây ra những tổn thương sinh lý của tế bào

Sự tích lũy ROS và các tác nhân oxy hóa có liên quan đến nhiều bệnh lý, bao gồm

các bệnh thoái hóa thần kinh, tiểu đường, ung thư và lão hóa sớm ROS và các gốc

tự do gây ra các đột biến gen, tăng sự hình thành và tích lũy các đột biến DNA tythể ở các mô trong quá trình lão hóa [48] Theo thuyết ty thể về lão hoá, việc tíchluỹ những tổn thương ở các thành phần bên trong ty thể bao gồm mtDNA, protein,lipid làm ảnh hưởng đến chức năng của ty thể Nói chung, những tổn thương củamtDNA trong phạm vi rộng với thời gian dài dẫn đến ty thể bị rối loạn, thậm chíngừng hoạt động là nguyên nhân làm cho tế bào chết và cơ thể bị lão hoá [21].1.1.2.3 Ty thể và quá trình tự chết theo chương trình của tế bào

“Chết theo chương trình” (apoptosis) là một quá trình quan trọng giúp các sinhvật đa bào duy trì sự toàn vẹn và chức năng của mô và để loại bỏ những hư hại hoặccác tế bào không mong muốn Ty thể đóng vai trò cốt lõi trong việc điều tiết sự chếtcủa tế bào bằng cách cung cấp nhiều yếu tố quan trọng bao gồm cả sự hoạt hóacaspase và phân mảnh nhiễm sắc thể Ty thể có vai trò quan trọng trong cơ chế tích

tụ Ca2+ và rối loạn quá trình oxy hóa, sự tích lũy lượng Ca2+ đủ lớn trong ty thể dẫnđến chết theo chương trình của tế bào Nồng độ và khả năng hoạt động của Ca2+trong ty thể được điều khiển bởi họ protein Bcl-2, yếu tố quan trọng tham gia vàoquá trình chết theo chương trình của tế bào [34]

Tín hiệu gây chết nội bào phụ thuộc vào sự phóng thích Cyt c Tác động củaCyt c là liên kết với thụ thể protein hoạt hóa procaspase (Apaf-1), tổ hợp lại vớinhau tạo thành heptamer gọi là apoptosome Apaf-1 trong apoptosome hoạt hóaprocaspase mở đầu (procaspase-9), từ đó hoạt hóa dòng caspase sát thủ để điều dẫn

sự chết tế bào Bcl-2 điều hòa con đường apoptosis nội bào bằng cách kiểm soát sựphóng thích Cyt c và các protein khác từ khoảng gian màng của ty thể vào tế bàochất Bcl-2 có hai loại: pro-apoptosis Bcl-2 gia tăng sự giải phóng Cyt c và kíchthích sự chết của tế bào; anti-apoptosis Bcl-2 có tác dụng ngược lại, ức chế sự giảiphóng Cyt c từ đó kìm hãm sự chết của tế bào [32, 60]

Nồng độ Ca2+ trong ty thể cũng quyết định đến sự sống còn của tế bào Sự kíchhoạt nhóm protein pro-apoptosis Bcl-2 đòi hỏi nồng độ ion Ca2+ trong ty thể phải đủ

lớn, từ đó dẫn đến các rối loạn về chức năng của ty thể, kích thích giải phóng Cyt c

và hoạt hóa caspase Mặt khác, khi một lượng lớn Ca2+ tích tụ trong ty thể, sẽ tươngtác với cyclophilin D để kích thích mở lỗ bán thấm trên màng trong của ty thể làmchất nền bị trương lên làm vỡ màng ty thể và phát tán Cyt c Hơn nữa, Ca2+ còn kíchthích sự tổng hợp các gốc tự do có hoạt tính cao (ROS) Sự dư thừa ROS trong tythể hoạt động như chất trung gian của các con đường truyền tín hiệu chết theochương trình [34]

Những rối loạn chức năng của ty thể gây ra bởi sự sai hỏng DNA và các yếu tốlàm tổn thương gen dẫn đến một kết quả chắc chắn là sự chết tế bào theo chươngtrình

1.1.3 Hệ gen ty thể và đặc điểm di truyền của hệ gen ty thể

1.1.3.1 Hệ gen ty thể

Ty thể là bào quan có hệ gen riêng, nhân bản độc lập với gen nhân DNA tythể người tồn tại ở dạng mạch vòng kép, có kích thước 16.569 bp, gồm 37 gen mãhóa cho 2 phân tử ARN ribosome, 22 phân tử ARN vận chuyển và 13 phân tửprotein là thành phần cần thiết trong các phức hợp của chuỗi hô hấp

(NADH-ubiquinone oxidoreductase), Cyt b là tiểu đơn vị phức hợp III chỉ được mã hóa bởimtDNA (ubiquinol cytochrome c oxidase reductase), COX 1-3 mã hóa cho 3 tiểuđơn vị của phức hợp V (ATP synthase) Các phân tử protein còn lại của chuỗi hôhấp được mã hóa bởi gen nhân, được dịch mã trong tế bào chất, sau đó được vậnchuyển vào bên trong ty thể [59].

Đặc biệt, so với hệ gen nhân, hệ gen ty thể chứa rất ít trình tự không mã hóaxen kẽ với vùng mã hóa D-loop nằm giữa gen tRNAPhe (gen MT-TK) và tRNAPro(gen MT-TP) là vùng không mã hóa lớn nhất và có vai trò quan trọng trong điềuhòa quá trình sao chép và phiên mã của hệ gen ty thể, chứa promoter cho sự phiên

mã chuỗi nặng (H) và chuỗi nhẹ (L), chứa điểm khởi đầu của quá trình tái bản Haigen mã hóa cho rRNA (12S và 16S rRNA) và 22 gen mã hóa cho 22 tRNA đượcnằm giữa các gen mã hóa cho protein Các gen này cung cấp các RNA cần thiết cho

sự tổng hợp protein bên trong ty thể [11]

Hệ gen ty thể sao chép độc lập với hệ gen nhân bằng một hệ thống riêng trong

ty thể nhưng các enzyme cho quá trình tái bản lại do hệ gen nhân mã hóa Quá trìnhphiên mã và dịch mã của DNA ty thể lại được điều khiển bởi gen nhân Hệ gen tythể được phiên mã từ một điểm khởi đầu nằm trên vùng D-loop, bản phiên mã sau

đó được endonuclease phân cắt để hình thành nên phân tử rRNA 12S và 16S, tRNA

và mRNA tiền thân Phân tử mRNA hoàn thiện của ty thể không được gắn mũnhưng có đuôi polyA Mô hình phiên mã trên có nhiều điểm giống với một operoncủa vi khuẩn [11, 59]

Các tế bào người có thể chứa tới hàng ngàn bản sao mtDNA trong một tế bào và

có số lượng dao động tùy thuộc vào nhu cầu sử dụng năng lượng của từng loại tế bào

Số bản sao mtDNA giảm nhiều lần trong quá trình tạo tinh trùng nhưng dường nhưtăng đột ngột trong quá trình tạo trứng Số lượng bản sao mtDNA thay đổi rất lớn ởcác mô khác nhau và được kiểm soát nghiêm ngặt trong thời kỳ đầu của quá trìnhphát triển của động vật Số bản sao mtDNA tăng khi quá trình trao đổi chất tăng [46]

1.1.3.2 Đặc điểm di truyền của hệ gen ty thể

Sự di truyền của các gen trên mtDNA là sự di truyền qua tế bào chất Giốngnhư các DNA ngoài nhân, DNA ty thể được di truyền theo dòng mẹ, người mẹtruyền gen ty thể cho các con, nhưng chỉ con gái của bà mới có thể truyền các kiểugen này cho thế hệ tiếp theo Cơ chế di truyền này được lý giải bởi tế bào trứng củangười phụ nữ trung bình chứa khoảng 100.000 phân tử DNA ty thể, trong đó mộttinh trùng khỏe mạnh chỉ chứa trung bình 100 - 1500 phân tử, mặt khác sự suy thoáicủa mtDNA trong đường sinh dục nam và sự phá hủy mtDNA của tinh trùng khivào tế bào trứng là rất rõ ràng nên mtDNA trong tế bào hợp tử thường chỉ đượcthừa hưởng từ trứng [29, 61]

Đối với các gen nằm trong nhân của tế bào sinh vật nhân chuẩn, chúng tuântheo các quy luật hoạt động của nhiễm sắc thể trong các cơ chế phân bào Nhưng

hệ gen ty thể lại không tuân theo những quy luật đó mà các tính trạng do chúngxác định có những kiểu di truyền riêng đặc trưng cho chúng Đột biến mtDNAđược truyền từ mẹ sang con nhưng tỷ lệ số bản sao mang đột biến ở mẹ và conkhác nhau, các cá thể mang đột biến trong một phả hệ gia đình cũng có sự thayđổi về tần suất đột biến vì vậy mức độ biểu hiện bệnh ở mẹ và các con có thể rấtkhác nhau [29, 46]

Một đặc điểm khác biệt nổi bật về tính di truyền gen ty thể là tần số xuất hiệncủa gen đột biến giữa mẹ và con cái Ví dụ, một người mẹ khỏe mạnh mang độtbiến mtDNA có thể sinh ra hai người con với tần suất mang gen đột biến hoàn toànkhác nhau, một người con khỏe mạnh và một người con có biểu hiện bệnh trầmtrọng ngay từ khi còn nhỏ Kiểu di truyền này được gọi là “nút cổ chai”, theo đó tầnsuất mang mtDNA đột biến của các thế hệ con cháu khác nhau đáng kể và cũngkhác với mẹ [14, 46, 50]

1.1.3.3 Tính chất không đồng nhất và tốc độ đột biến của ty thể

Mỗi tế bào có thể chứa hàng ngàn bản sao DNA Vì vậy, khi xuất hiện đột biếnthì trong cùng một mô có thể có cả mtDNA bình thường và mtDNA đột biến, hiện

tượng này được gọi là tính không đồng nhất (Heteroplasmy) Nếu các bản sao củamtDNA đều giống nhau thì được gọi là đồng nhất giữa các bản sao ty thể(Homoplasmy).

Số bản sao mtDNA đột biến so với tổng lượng mtDNA của tế bào sẽ xác địnhmức độ heteroplasmy, là một nhân tố quyết định mức độ nghiêm trọng của bệnh Đa

số các đột biến mtDNA gây bệnh đều tồn tại ở dạng heteroplasmy Những hiểu biết

về mức độ dị plasmid của người mang đột biến là thông số quan trọng để có thể tiênlượng được tình trạng bệnh lý và sự di truyền của đột biến gen ty thể [14]

mtDNA có tốc độ đột biến cao gấp 10 - 20 lần so với DNA trong nhân, do hệgen ty thể ở dạng trần (không liên kết với các protein bảo vệ kiểu histone như hệ gennhân), không chứa trình tự intron, hệ gen ty thể dễ tiếp xúc với các gốc tự do [54].Ngoài ra, ty thể không có cơ chế sửa chữa DNA hiệu quả như với DNA trong nhân.Hiện nay, đã có nhiều đột biến gen ty thể gây bệnh được phát hiện và nghiên cứu.Các đột biến gen ty thể này thường gây ra các triệu chứng khác nhau, tuy nhiên chủyếu tập trung vào cơ, thần kinh và các chuyển hóa của cơ thể

1.2 ĐỘT BIẾN GEN TY THỂ VÀ CÁC BỆNH LIÊN QUAN

1.2.1 Các loại đột biến gen ty thể

Bộ gen ty thể có tỷ lệ đột biến rất cao, cao hơn từ 10 đến 20 lần so với đột biếnDNA trong nhân

Hầu hết những thay đổi trên DNA ty thể là đa hình và có vai trò quan trọngtrong việc theo dõi sự di cư của con người Những đột biến mtDNA gây bệnhđầu tiên đã được xác định vào năm 1988 Kể từ đó, hơn 250 đột biến mtDNAgây bệnh đã được phát hiện và nghiên cứu, bao gồm hai loại đột biến chính làđột biến điểm và đột biến cấu trúc Các đột biến mtDNA có tính không đồngnhất về biểu hiện lâm sàng và tuổi khởi phát bệnh, do đó việc xác định tỷ lệ củabệnh đột biến gen ty thể là rất khó khăn Ước tính ở phía Đông Bắc nước Anh có

tỷ lệ 1/10.000 người đã có biểu hiện lâm sàng bệnh ty thể và 1/6000 người cónguy cơ mắc bệnh Một nghiên cứu gần đây đã cho thấy tần số đột biến là 0,14%

đối với đột biến A3243G và 0,2% đối với đột biến A1555G liên quan đến RNR1 aminoglycoside gây ra mất thính giác, điều này chứng tỏ rằng những hiểubiết về đột biến gen ty thể còn nhiều hạn chế [31, 56].

tRNA ty thể có cấu trúc ngắn hơn và khác biệt với tRNA trong tế bào chất(mã hóa bởi gen nhân) nên sự sai khác về 1 nucleotide dẫn đến thay đổi dạnghình L của tRNA, ảnh hưởng đến cấu trúc bậc ba của chúng Một số đột biến trêntRNA ty thể dẫn đến những khiếm khuyết trên phức hợp OXPHOS Tùy thuộcvào điểm đột biến trên gen tRNA ty thể sẽ ảnh hưởng đến các kênh vận chuyểnđiện tử khác nhau trong chuỗi hô hấp tế bào Các nguyên nhân gây ra khiếmkhuyết trong quá trình tổng hợp các tRNA ty thể là rất nhiều bao gồm: kết thúcphiên mã, biến đổi tRNA trưởng thành, thay đổi bộ ba đối mã, ảnh hưởng đếncấu trúc và chức năng của tRNA do đó giảm khả năng gắn acid amin, giảm liênkết với các yếu tố dịch mã mtEFT hoặc các ribosome ty thể Đột biến điểm ở gen

mã hóa protein ty thể đặc biệt ảnh hưởng đến các chức năng của phức hợp chuỗi

hô hấp tế bào mà nó đảm nhiệm [56]

Đột biến điểm trên mtDNA chủ yếu ở dạng không đồng nhất (heteroplasmy),

tỷ lệ đột biến giữa các mô trong cùng một cá thể cũng rất khác nhau Một số độtbiến gen ty thể ở dạng đồng nhất (homoplasmy) đang được nghiên cứu nhiều hơn,đột biến này thường ảnh hưởng đến các mô xác định và có biểu hiện lâm sàng đặc

trưng Tuy nhiên, đột biến điểm gen ty thể rất đa hình nên việc xác định tỷ lệ độtbiến gen gây bệnh ty thể là vấn đề cần được nghiên cứu nhiều hơn nữa [31].

1.2.1.2 Đột biến cấu trúc mtDNA

Đột biến cấu trúc gen ty thể bao gồm mất đoạn, lặp đoạn và một số sự sắp xếpcấu trúc phức tạp khác đã được nghiên cứu gắn với tình trạng bệnh lý Phần lớn độtbiến cấu trúc mtDNA được phát hiện liên quan đến mất đoạn, thay đổi kích thướckhoảng 1,3 - 8 kb hay một vài gen Đột biến mất đoạn mtDNA thường xảy ra ở giaiđoạn sớm trong quá trình phát triển của hợp tử dẫn đến tần số xuất hiện và biểu hiệnbệnh ở các mô là tương tự nhau Kích thước đoạn mtDNA bị mất có thể do đột biếngen nhân quy định việc duy trì, sao chép và trao đổi nucleotide trong mtDNA (ví

dụ, POLG và PEO1 mã hóa Twinkle) [56]

Ở cấp độ phân tử, khoảng 60% đột biến mất đoạn mtDNA xảy ra trong khuvực mtDNA mà hai bên là trình tự lặp ngắn, kiểu mất đoạn này được gọi là đột biếnmất đoạn type I Khoảng 30% đột biến mất đoạn mtDNA xảy ra tại những vùng cótrình tự lặp không tuyệt đối, được gọi là mất đoạn type II Còn lại khoảng 10% độtbiến mất đoạn xảy ra ở vùng không có trình tự lặp Mất đoạn mtDNA phổ biến nhất,gặp ở khoảng 1/3 số bệnh nhân, là đột biến mất đoạn 5 kb (8470 - 13447) được giớihạn bởi trình tự lặp 13 bp (type I) [24]

Mặc dù có nguồn gốc khác nhau, hầu hết đột biến mất đoạn mtDNA đều cóđặc điểm chung, chủ yếu xảy ra từ quá trình sao chép Cơ chế xảy ra đột biến cũnggiống nhau, Krishnan và cộng sự [24] đã đề xuất rằng mất đoạn mtDNA phát sinhtrong quá trình sửa chữa các sai hỏng trong phân tử mtDNA tái bản Số lượngnucleotide bị mất và tần suất xuất hiện của đột biến trong các mô là cơ sở quantrọng cho việc xác định triệu chứng lâm sàng của bệnh, nhưng có thể không tỷ lệthuận với nhau

1.2.2 Các bệnh do đột biến gen ty thể

Ty thể là bào quan sản xuất năng lượng quan trọng trong các tế bào nhânchuẩn Bệnh ty thể là bệnh lý trong đó khả năng sản xuất năng lượng và đảm

nhiệm vai trò bình thường trong tế bào của ty thể bị tổn hại Nhiều nghiên cứucho thấy đột biến mtDNA là một trong các nguyên nhân chủ yếu gây bệnh ởngười, ngoài ra một số đột biến gen nhân cũng có thể làm mất chức năng của tythể gây nên bệnh ty thể [56] Bệnh ty thể có ảnh hưởng đến nhiều cơ quan với tậphợp các triệu chứng liên quan đến cơ, hệ thần kinh và các cơ quan thiết yếu cho sựsống cần năng lượng cao Biểu hiện lâm sàng của bệnh ty thể rất đa dạng, có nhữngtriệu chứng đan xen vào nhau, thường được xác định bởi tình trạng thiếu nănglượng tế bào do khiếm khuyết quá trình phosphoryl hóa oxy hóa

Sự khởi phát các triệu chứng lâm sàng, sự biến đổi kiểu hình và mức biểuhiện của bệnh ty thể chịu sự chi phối của một số yếu tố bao gồm hiệu ứngngưỡng, sự phân chia tế bào chất trong phân bào, số lượng bản sao DNA đượcnhân lên trong ty thể, và sự di truyền “nút cổ chai” Nhiều đột biến gen gây bệnh

ty thể ở trạng thái không đồng nhất, trong trường hợp này thì tỷ lệ gen đột biến

có liên quan đến mức độ biểu hiện của bệnh Tỷ lệ gen đột biến nhỏ nhất cầnthiết có thể gây nên những biến đổi sinh hóa và chức năng của tế bào dẫn đếnbiểu hiện lâm sàng của bệnh được gọi là ngưỡng biểu hiện của đột biến Giá trịngưỡng này khác nhau đối với từng loại đột biến và giữa các mô, cơ quan trong

cơ thể; sự hô hấp của tế bào theo con đường hiếu khí sẽ bị ảnh hưởng sớm hơn

so với con đường kị khí Thông thường các giá trị ngưỡng trong khoảng 60 90% gen đột biến mtDNA [14] Trong quá trình phân bào, ty thể được tách ngẫunhiên và trong tế bào con sẽ không có sự đồng nhất về tỷ lệ đột biến mtDNA, sựthay đổi này đôi khi thấp hơn hoặc cao hơn ngưỡng biểu hiện của bệnh Mặtkhác, mỗi ty thể của tế bào có hàng ngàn bản sao DNA dẫn đến sự thay đổi tỷ lệmtDNA đột biến trong tế bào và mô Cơ chế di truyền “nút cổ chai” cũng quyếtđịnh sự biểu hiện bệnh ty thể ở các con sinh ra từ trứng của người mẹ mang độtbiến gen ty thể ở dạng không đồng nhất, bởi sự di truyền ngẫu nhiên lượngmtDNA đột biến vào tế bào trứng của mẹ tạo nên tỷ lệ không đồng nhất ở tế bàohợp tử cao hơn hay thấp hơn ngưỡng biểu hiện của bệnh [46]

-Từ việc xác định được các đột biến mtDNA đầu tiên vào năm 1988, sau đó đã

có nhiều nghiên cứu quan trọng đi sâu tìm hiểu những rối loạn di truyền mtDNAdẫn đến tình trạng bệnh lý Hiện nay, đã có hơn 250 đột biến mtDNA gây bệnhđược xác định Ngoài ra còn có nhiều báo cáo về các đột biến gen nhân làm thay đổiprotein trong chuỗi hô hấp của ty thể gây nên bệnh ty thể Những nghiên cứu nàylàm sáng tỏ cơ chế phân tử của bệnh ty thể, đặc biệt tập trung vào các khuyết tật ditruyền mtDNA, hệ quả chức năng đặc trưng của đột biến mtDNA nhằm mang lại sựtiến bộ về phương pháp chẩn đoán và điều trị bệnh ty thể

1.2.2.1 Hội chứng gây ra bởi các đột biến điểm phổ biến trên gen mã hóa tRNA

Hội chứng MELAS (mitochondrial encephalopathy, lactic acidosis and

stroke-like episodes) là hội chứng não giật cơ, tăng acid lactic máu và giả tai

biến mạch, được di truyền từ mẹ sang con Bệnh có ảnh hưởng đến nhiều hệthống của cơ thể, đặc biệt là não bộ, hệ thần kinh và cơ bắp Các dấu hiệu vàtriệu chứng của rối loạn này thường xuất hiện ở trẻ em sau một thời gian pháttriển bình thường, có thể khởi phát ở mọi lứa tuổi Triệu chứng của bệnh baogồm yếu cơ, đau cơ, đau đầu, nôn, và co giật, một số cá nhân có thể bị đột quỵtrước tuổi 40 Bệnh tiến triển có thể là liệt nửa người, bất thường về thị giác, cogiật và nhức đầu nghiêm trọng, những lần đột quỵ lặp lại làm tổn thương não dẫnđến mất thị lực, mất chức năng trí tuệ [6, 56]

Hầu hết bệnh nhân MELAS đều bị tích tụ acid lactic trong cơ thể dẫn đếnnhiễm toan làm nôn mửa, đau bụng, rất mệt mỏi, yếu cơ và khó thở Một số trườnghợp MELAS co thắt cơ không tự chủ, giảm thính lực, bệnh tim và thận, tiểu đường,mất cân bằng nội tiết tố [40]

Nguyên nhân là do một trong các loại đột biến A3243G, A3251G, T3271C,

T3291C, A3252G, A3260G, C3256T trên gen MT-TL1 mã hóa cho tRNALeu; đột

biến G13513A, A12770G và A13514G trên gen MT-ND5 mã hóa cho ND5

ubiquinone oxidoreductase của phức hợp I, G583A trên gen MT-TF mã hóa chotRNAPhe, G1642A trên gen MT-TV mã hóa cho tRNAVal, A5814G trên gen MT-TC

mã hóa cho tRNACys Trong đó, đột biến A3243G chiếm 80% số ca mang hội chứngMELAS, tiếp theo là đột biến T3271C xảy ra khoảng 7,5% [16] MELAS có thể gây

ra bởi các đột biến điểm mtDNA ở các gen khác như COXIII, ND1, ND5 hoặc gen

mã hóa tRNAPhe, tRNAVal, tRNACys, rRNA hoặc mất đoạn với kích thước ngắn Tuynhiên, đột biến trên tRNALeu vẫn là đột biến phổ biến nhất liên quan đến kiểu hìnhMELAS Trong số đó, đột biến A3243G được báo cáo đầu tiên trên gen mã hóa chotRNALeu và là đột biến phổ biến nhất ở tất cả chủng tộc [1] Như vậy, đột biếnA3243G là một chỉ tiêu quan trọng để chẩn đoán hội chứng MELAS ngoài các kiểmtra lâm sàng

Hội chứng CPEO (chronic progressive external ophthalmoplegia) là hội

chứng liệt cơ mắt ngoài tiến triển do rối loạn chức năng ty thể, thường gặp ở ngườilớn Triệu chứng điển hình của bệnh là liệt cơ mắt, sa mí mắt, rối loạn tâm thần vàđột tử

CPEO là một bệnh tiến triển chậm, có thể bắt đầu ở mọi lứa tuổi và tiếntriển trong khoảng thời gian 5 đến 15 năm Các triệu chứng đầu tiên xuất hiệnthường là mí mắt sụp xuống làm giảm giới hạn vận động của mắt, hạn chế tầmnhìn của mắt, và tổn thương giác mạc Bệnh nhân thường sử dụng cơ trán đểgiúp nâng mí mắt nên có thể xảy ra teo các nhóm cơ trên mặt, khó khăn trongviệc nhai, một số bệnh nhân đục thủy tinh thể, suy giảm thính giác, đau thần kinhsợi trục, mất điều hòa co cơ, Parkinson [56]

CPEO là tình trạng bệnh gây nên bởi những khuyết tật trong ty thể làm ảnhhưởng đến quá trình phosphoryl oxy hóa trên chuỗi hô hấp tế bào Trong một sốtrường hợp, đột biến ở gen MT-TL1 trên mtDNA gây nên CPEO Nguyên nhân củabệnh là do đột biến A3243G nằm trên gen mã hóa tRNALeu(UUR) và đột biến T4274Cnằm trên gen mã hóa tRNAIle Mất đoạn mtDNA là nguyên nhân quan trọng gây nênhội chứng CPEO, những mất đoạn có kích thước 3,4 đến 6,9 kb với mức độ khôngđồng nhất dao động trong khoảng 18,8 đến 85,5% cho thấy các biểu hiện lâm sàngkhác nhau Một nghiên cứu trên những bệnh nhân nghi mắc bệnh ty thể ở Malaysia

cho thấy rằng độ dài, vị trí mất đoạn và mức độ không đồng nhất đóng vai trò quantrọng trong việc xác định kiểu hình lâm sàng của bệnh nhân CPEO, hai bệnh nhânnặng được tìm thấy mất đoạn mtDNA có kích thước 4320 bp và 4717 bp Bệnhnhân CPEO có thể mang đột biến điểm, bao gồm các đột biến trên tRNALeu, tRNAIle

và tRNAAsp Mặt khác, các đột biến gen POLG, SLC25A4 và C10orf2 trên DNAnhân cũng là nguyên nhân gây bệnh, những gen này rất quan trọng để bảo vệmtDNA Mặc dù cơ chế chưa rõ ràng, nhưng đột biến bất kỳ trong 3 gen này đềudẫn đến mất đoạn lớn trên mtDNA, dao động từ 2-10 kb [17]

1.2.2.2 Các hội chứng liên quan đến các đột biến điểm phổ biến trên gen mã hóa protein

Hội chứng Leigh (bệnh viêm não tủy cấp di truyền theo Leigh)/NARP

(neuropathy, ataxia and retinitis pigmentos)

Hội chứng Leigh và NARP (yếu cơ do thần kinh, mất điều hòa và viêm sắc tốvõng mạc) là một phần của chuỗi các rối loạn thoái hóa thần kinh tiến triển gây rabởi sự bất thường của chuỗi hô hấp tế bào trong ty thể [53]

Hội chứng Leigh đặc trưng bởi tình trạng thoái hóa thần kinh tiến triển,trong đó đặc biệt ảnh hưởng đến não, não trung gian và hạch thần kinh, thườngdẫn đến tử vong do suy hô hấp Các dấu hiệu đầu tiên ở trẻ mắc hội chứng Leigh

là nôn mửa, tiêu chảy, khó nuốt dẫn đến ăn uống kém, không phát triển, giảmtrương lực cơ, co cơ không kiểm soát, mất cảm giác và yếu ở các chi, triệu chứngphổ biến là cử động khó khăn Một số cá nhân liệt cơ mắt, teo dây thần kinh thịgiác, phì đại cơ tim Ngoài ra, khó thở thường gặp ở những người mắc hội chứngLeigh dẫn đến suy hô hấp, hoặc sự tích tụ lactate trong cơ thể đo được ở máu,dịch não tủy và nước tiểu [56]

NARP được đặc trưng bởi yếu cơ do thần kinh gây mất cảm giác thần kinh,mất điều hòa và bệnh võng mạc sắc tố Triệu chứng khởi phát là mất điều hòa vậnđộng và trí tuệ chậm phát triển, thường xuất hiện ở trẻ em Một số bệnh nhân NARP

có thể tương đối ổn định trong nhiều năm, nhưng có thể bị xuống cấp từng đợt,thường có biểu hiện rõ ràng khi kết hợp với các bệnh do virus [66]

Hầu hết các đột biến gen ty thể gây ra hội chứng Leigh được báo cáo là trêncác gen MT-ATP6, MT-ND3 và MT-ND5, một vài đột biến được xác định trên cácgen MT-ND2, MT-ND6 và MT-ND4 Ngoài ra, còn có trường hợp trên gen liênquan đến quá trình tổng hợp protein, đó là gen MT-TV mã hóa cho tRNAVal, genMT-TL1 mã hóa cho tRNALeu, gen MT-TW mã hóa cho tRNATrp và gen MT-TK mãhóa cho tRNALys MT-ATP6 là gen duy nhất bị đột biến gây NARP [66].

Trong các trường hợp của hội chứng Leigh, đa số các đột biến nằm trên genMT-ATP6, đặc biệt tại vị trí T8993G hoặc T9176C Sự biến đổi T thành G tại 8993trong mtDNA người là một trong các đột biến ty thể kèm theo hội chứng Leighđược mô tả nhiều nhất Đột biến này thay thế leucine thành arginine tại vị trí 156trên ATPase 6 của ty thể, một trong hai tiểu đơn vị của tiểu phần Fo của phức hệATPase (phức hệ V), làm cho quá trình tổng hợp ATP bị lỗi, tạo ra nhiều gốc oxy tự

do, gây nên các triệu chứng lâm sàng khác nhau [53]

Hội chứng Leigh còn liên quan đến sự biến đổi T12706C của gen ND5, dẫnđến thay thế phenylalanine bằng leucine ở vị trí 124 ND5 là gen chức năng gồm

1812 bp (từ vị trí 12337 tới 14148) được mã hóa bởi chuỗi nặng của mtDNA Sảnphẩm của gen ND5 là một thành phần của phức hệ NADH-ubiquinonoxidoreductase Sản phẩm của gen ND5 nằm ở phần kỵ nước của phức hệ I Proteinnày là một trong 7 tiểu phần được mã hóa bởi mtDNA trong số 42 tiểu phần củaphức hệ I của chuỗi hô hấp Đột biến trên gen ND5 có liên quan tới nhiều bệnhtrong đó có LHON, Leigh và MELAS [61]

Hội chứng LHON (Leber herteditary optic neuropathy) là hội chứng liệt thần

kinh thị giác di truyền theo Leber, tác động chủ yếu đến võng mạc, gây hội chứngteo dây thần kinh thị giác, làm mất khả năng nhìn thấy ở cả hai mắt Bệnh thườngphát triển ở tuổi trưởng thành, tỷ lệ ảnh hưởng của nam giới cao hơn 4 đến 5 lần sovới nữ giới Người mang bệnh ban đầu hoàn toàn không có biểu hiện cho đến giaiđoạn phát triển thị giác làm mờ một mắt, mắt còn lại biểu hiện tương tự sau 2 - 3tháng, khoảng 25% bệnh nhân khởi phát bệnh với 2 mắt ở cùng thời điểm Thị lực

giảm nghiêm trọng đến mức không thể đếm được ngón tay hoặc kém hơn nữa Saugiai đoạn cấp tính, đĩa quang trở nên teo Bất thường về thần kinh như run chân tay,bệnh thần kinh ngoại biên, bệnh cơ và rối loạn vận động được báo cáo là thườnggặp ở bệnh nhân LHON, ở nữ giới có thể phát triển triệu chứng đa xơ cứng [69].Khoảng 95% trường hợp LHON gây ra bởi các đột biến liên quan đến các tiểuđơn vị của phức hệ I, bao gồm đột biến G11778A trên gen ND4 (50-70% trường hợp),đột biến G3460A trên gen ND1 (15% trường hợp) và đột biến T14484C trên gen ND6(10% trường hợp) Đột biến G11778A là nguyên nhân phổ biến nhất của LHON.Ngoài ra, còn có các đột biến hiếm khác liên quan đến gen ND5 và ND6 [3].

Các đột biến trên gen ND6 bao gồm T14484C, T14459C, các đột biến nàykhông những gây ra các triệu chứng của hội chứng LHON mà còn gây ra hội chứngLeigh Đột biến G14453A cũng trên gen này, tác động lâm sàng phức tạp hơn, kèmtheo các triệu chứng của LHON còn có các biểu hiện của MELAS

LHON thường là do một đột biến mtDNA homoplasmy và các con sẽ kế thừacác đột biến từ mẹ Tuy nhiên khoảng 50% nam giới sẽ biểu hiện bệnh, trong khichỉ có 10% nữ giới bị mất thị giác Sự tiến triển của bệnh phụ thuộc vào gen độtbiến, 71% bệnh nhân đột biến T14484C có dấu hiệu phục hồi, trong khi đó ở bệnhnhân A11778G chỉ là 25% Phần lớn các bệnh nhân mang đột biến A11778G sớmkhởi phát triệu chứng LHON, đã có một vài báo cáo về kiểu hình suy thoái thầnkinh thị giác [69]

1.2.2.3 Các bệnh liên quan đến các đột biến trên gen mã hóa rRNA

Bệnh do đột biến trên gen mã hóa rRNA chiếm tỷ lệ rất nhỏ Đột biến A1555G

và C1494T được phát hiện trên gen mã hóa cho rRNA 12S, các đột biến này gâymất khả năng nghe do kích thích bởi aminoglycoside và mất khả năng nghe không

có hội chứng Trong đó, đột biến A1555G phổ biến hơn C1494T

Đột biến A1555G là đột biến điểm mtDNA nằm trên gen MT-RNR1, quy dịnh

sự tổng hợp 12S rRNA Đột biến này nằm trên vị trí mã hóa tiểu đơn vị rRNA vàđược dự đoán gây ra một sự thay đổi trong cơ cấu thứ cấp của rRNA Sự thay đổi

này làm suy yếu tổng hợp protein và tăng cường tương tác với kháng sinhaminoglycoside, tiếp tục làm trầm trọng hơn tình trạng bệnh [2] Đột biến đơnthuần thường không dẫn đến tình trạng bệnh lý, nhưng khi kết hợp với các yếu tốmôi trường như kháng sinh nhóm aminoglycoside sẽ biểu hiện triệu chứng bệnhđiển hình, thường quan sát được là mất thính lực ở các mức độ khác nhau Độtbiến A1555G thường ở dạng đồng nhất nhưng biểu hiện triệu chứng bệnh củacác thành viên trong gia đình là rất khác nhau Trong một nghiên cứu cũng chỉ rarằng biểu hiện của bệnh chịu ảnh hưởng của việc sử dụng kháng sinhamimoglycoside với 96,5% ở nhóm tuổi 30 điều trị kháng sinh và 39,9% vớinhóm không điều trị kháng sinh [7].

Đột biến khác trên gen rRNA 12S là T1095C, gây nên sự thay đổi base bảo thủ

ở vòng xoắn 25 của rRNA 12S Nucleotide này nằm ở vị trí P của ribosome, có vaitrò quan trọng trong giai đoạn khởi đầu của quá trình tổng hợp protein của ty thể

Sự thay đổi cấu trúc bậc ba của rRNA 12S làm ảnh hưởng đến quá trình tổng hợpprotein, vì vậy dẫn đến mất chức năng của ty thể và gây ra mất khả năng nghe.1.2.2.4 Bệnh gây nên bởi các đột biến khác trên mtDNA

Hội chứng Kearns-Sayre (KSS) là bệnh liên quan đến sự phát triển sắc tố

võng mạc và liệt cơ mắt ngoài tiến triển, thường khởi phát trước tuổi 20 Nguyênnhân là do mất đoạn mtDNA khoảng 2-4 kb, thường là 4997 bp từ vị trí 8488-

13460, tại điểm đứt gãy thường có một đoạn 13 bp lặp lại Ngoài những triệu chứngnhược cơ, sa mí mắt, yếu cơ mặt, thoái hóa sắc tố võng mạc, bệnh nhân thường cócác biến chứng bao gồm thất điều tiểu não, suy giảm nhận thức và điếc, tắc nghẽn

cơ tim, dáng người thấp bé, nuốt khó [56]

Hội chứng Pearson là một rối loạn hiếm gặp, thường khởi phát trong những

năm đầu đời, đặc trưng bởi thiếu máu hồng cầu, tủy xương và suy tụy ngoại tiết.Diễn biến lâm sàng ở trẻ em có thể nặng dẫn đến tử vong sớm, những trường hợpsống sót thường có biểu hiện thiếu máu sau đó phát triển các đặc điểm lâm sàng

của KSS Bệnh thường được xác định là do mất đoạn mtDNA quy mô lớn, có mặt

ở tất cả các mô [65]

Bệnh liệt cơ mắt ngoài tiến triển (progressive external

ophthalmoplegiaPEO) được đặc trưng bởi sự suy yếu của các cơ mắt, thường xuất hiện ở độ tuổi 18

-40 Dấu hiệu phổ biến và khác so với bệnh liệt mắt tiến triển kinh niên (CPEO) nhưnhược cơ, sa mí mắt, yếu cơ mặt, rách cơ Nguyên nhân gây bệnh là những khuyếttật trong ty thể, hay gặp ở các rối loạn mất đoạn mtDNA quy mô lớn, trong một sốtrường hợp là đột biến gen MT-TL1 Mặt khác, các đột biến gen nhân POLG,SLC25A4 và C10orf2 cũng là nguyên nhân gây nên bệnh này Các nghiên cứu gầnđây chưa chứng minh được sự tương quan giữa kích thước và vị trí đoạn mtDNA bịmất với mức độ biểu hiện của bệnh [54]

Bệnh Parkinson/hội chứng MELAS gối nhau do đột biến mất đoạn TTAA

bắt đầu ở vị trí 14787 của gen CYTB Bệnh nhân biểu hiện rối loạn tiến triển nặng,bắt đầu từ 6 tuổi với biểu hiện khó phối hợp và tập trung vận động Sau này, bệnhnhân thể hiện hội chứng Parkinson, rung giật cơ và nhồi máu não [24]

Mất đoạn 9 bp CCCCCTCTA xảy ra ở vùng không mã hóa nằm giữa gen mã

cho cytochrome oxidase II (COII) và tRNALys trong hệ gen ty thể Vùng không mãhóa gồm hai trình tự lặp lại nối tiếp nhau dài 18 bp từ vị trí 8272-8289 trên hệ gen

ty thể Hiện tượng mất đoạn 9 bp được xem là một dạng đột biến của hệ gen ty thể

và có tỷ lệ cao ở các quần thể người châu Á bao gồm Trung Quốc (15%), Việt Nam(20%), Thái Lan (29%) và Nhật Bản (20%) [62]

Đột biến mất đoạn xuất hiện do những sai hỏng trong quá trình tái bản khôngđược sửa chữa hoặc do quá trình sao chép bị lỗi Vì vậy, mất đoạn 9 bp có lẽ xuấthiện như kết quả của một lỗi không được sửa chữa trong quá trình sao chép củamtDNA Hiện tượng mất đoạn 9 bp được xem xét trên hai phương diện đó là nguồngốc tiến hóa và mối liên quan giữa mất đoạn 9 bp với bệnh tật đặc biệt là các rốiloạn ty thể

Ngoài ra, một số bệnh ty thể còn liên quan đến sự đảo đoạn Nghiên cứu đầutiên về một đột biến đảo đoạn trong mtDNA gây bệnh cơ được phát hiện bởiMusumeci và tập thể vào năm 2000 [41] Bệnh nhân được phát hiện mang đột biếnđảo đoạn 7 nucleotide (ACCTTGC thành GCAAGGT) ở vùng 3902-3908 thuộc

gen mã hóa cho ND1 của NADH ubiquinone oxidoreductase Đột biến đảo đoạn

này dẫn đến thay thế 3 acid amin (D199G, L200K, và A201V) có tính bảo thủ caotrong chuỗi polypeptide, là đột biến ở dạng không đồng nhất 80% và được phát hiệntrong cơ nhưng không có trong máu bệnh nhân Sự thay đổi 3 acid amin liên tiếp từAsp-Leu-Ala thành Gly-Lys-Val, liên quan đến một vùng bảo thủ cao của gen ND1 cóvai trò quan trọng trong việc gắn ubiquinone

1.3 HỘI CHỨNG ĐỘNG KINH, GIẬT CƠ VỚI SỢI CƠ KHÔNG ĐỀU

(MERRF)

Năm 1973, một nhóm bệnh nhân mắc bệnh ty thể có triệu chứng lâm sàng liênquan đến động kinh, giật cơ lần đầu tiên được mô tả Sau đó các trường hợp kháctiếp tục được mô tả, Fukuhara và cộng sự [28] đã đưa ra các tính năng cơ bản củabệnh bao gồm: giật cơ, động kinh kết hợp với sợi cơ không đều được gọi là hộichứng MERRF Bệnh nhân MERRF được chẩn đoán bởi các tiêu chí: rung giật cơ,động kinh, thất điều tiểu não, sinh thiết cơ cho thấy sợi cơ đỏ bị rách Mặc dù đó lànhững biểu hiện chính nhưng thực tế lâm sàng tìm thấy nhiều bệnh nhân MERRF

có triệu chứng không đồng nhất, có thể gặp bệnh nhân điếc, không chịu được vậnđộng, mất trí nhớ, u mỡ đối xứng, bệnh sắc tố võng mạc [15, 37]

Hội chứng lần đầu tiên được mô tả là do đột biến A8344G trên gen mã hóa chotRNALys của ty thể [13, 20, 42] Nguyên nhân phổ biến của hội chứng MERRF là do

đột biến A8344G, T8356C và G8363A nằm trên gen MT-TK mã hóa cho tRNALys gây

ra, tất cả đột biến đều tồn tại ở dạng không đồng nhất Đột biến A8344G là phổ biếnnhất, chiếm 80-90% số ca mang hội chứng MERRF [9, 42] MERRF cũng được mô tả

ở bệnh nhân bị mất đoạn mtDNA Các hội chứng gối nhau với đặc điểmMELAS/MERRF đã được báo cáo ở đột biến T7572C và T8356C trên tRNASer [18]

1.3.1 Các đột biến của hội chứng MERRF

1.3.1.1 Đột biến A8344G

Đột biến A8344G là phổ biến nhất, chiếm 80 - 90% số ca mang hội chứngMERRF Sự thay đổi nucleotide A thành G tại vị trí 8344 trên gen MT-TK của ty thểlàm thay đổi bộ ba mã hóa trên tRNAlys, do đó giảm khả năng tương tác với bề mặtribosome Đột biến tại vùng này ảnh hưởng đến sự hợp nhất của dư lượng lysine vàoprotein ty thể, làm suy yếu tổng hợp protein và gây ra các rối loạn chức năng của chuỗi

hô hấp trong ty thể Từ đó, ty thể giảm hệ thống phosphoryl hóa oxy hóa, đặc biệt làcác phức hợp I (NADH dehydrogenase) và IV (cytochrome c oxidase) [10, 20, 33].Đột biến A8344G được di truyền độc lập từ mẹ sang con và thường tồn tại ởdạng không đồng nhất, nhưng mức độ phân bố của thể đột biến rất khác nhau giữacác cá thể và các mô trong cùng một cá thể [10] Một nghiên cứu cho thấy rằng ởmột phụ nữ có tỷ lệ bản sao ty thể mang đột biến A8344G trong cơ xương là 94%,trong máu là 38%, trong nước tiểu là 18%, còn mẹ của bệnh nhân có 16% gen độtbiến trong máu và 18% trong nước tiểu, còn em gái có tỷ lệ đột biếntrong máu là3% và trong nước tiểu là 4% Định lượng được tỷ lệ gen đột biến nhằm xác địnhmức độ ảnh hưởng của bệnh đến cá thể mang đột biến Tỷ lệ đột biến A8344G cótương quan với sự giảm tổng hợp protein, giảm tiêu thụ oxy và thiếu cytochrome coxidase, cũng như các polypeptid lớn và giàu lysine bị ảnh hưởng nặng nề gợi ýrằng các đột biến MERRF trực tiếp hạn chế quá trình tổng hợp protein của ty thể.Hơn thế nữa, stress oxy hóa và oxy hóa trên các mô bị ảnh hưởng bởi thiếu chuỗi hôhấp dẫn đến sự tiến triển các triệu chứng của bệnh ty thể [30]

Mặc dù được mô tả với các triệu chứng lâm sàng cơ bản của hội chứngMERRF bao gồm rung giật cơ, mất điều hoà, động kinh và sợi cơ màu đỏ ráchnham nhở nhưng đột biến A8344G có những biểu hiện kiểu hình không đồng nhất.Một nghiên cứu ở người phụ nữ 42 tuổi, ngoài các tính năng chính của hội chứngMERRF còn có nhiều triệu chứng khác như suy hô hấp và loạn dưỡng cơ Một sốtrường hợp biểu hiện tầm vóc ngắn, mất thính lực, bệnh thần kinh ngoại biên, bệnh

cơ tim hoặc rối loạn chức năng ống thận Kết quả nghiên cứu mối tương quan giữakiểu gen đột biến A8344G với kiểu hình MERRF cho thấy rằng đột biến này có thểbiểu hiện kiểu hình khác, bao gồm cả triệu chứng lâm sàng của hội chứng Leigh,rung giật cơ kết hợp với u mỡ đối xứng và các bệnh đầu múi cơ [30]

1.3.1.2 Đột biến T8356C

Hội chứng MERRF thường được biết đến với đột biến A8344G, nhưng khôngquan sát thấy trong khoảng 10 - 20% số bệnh nhân có triệu chứng lâm sàng tiêubiểu của hội chứng MERRF Một nghiên cứu giải trình tự gen tRNAlys của nămbệnh nhân có triệu chứng lâm sàng được xác định là rung giật cơ (hoặc động kinh),mất điều hòa và sợi cơ đỏ bị rách nham nhở, tiền sử gia đình tương thích với sự kếthừa bệnh từ mẹ, nghiên cứu tiền lâm sàng thấy tăng hàm lượng acid lactic, sinhthiết cơ cho thấy nhiều sợi cơ đỏ bị xé rách Kết quả cho thấy có sự thay đổinucleotide tại vị trí 8356 từ T chuyển thành C, làm gián đoạn một cặp base đượcbảo tồn trong phân tử mtDNA gốc [51]

Mở rộng nghiên cứu về mức độ biểu hiện của bệnh cho thấy đột biến T8356Ccũng tồn tại ở dạng không đồng nhất nhưng sự phân bố của gen đột biến cũng rấtkhác nhau, kết quả phân tích trên 1 bệnh nhân mang đột biến trong cơ là 100% còntrong máu là 47% Triệu chứng lâm sàng của bệnh nhân mang đột biến này cũngkhá phức tạp, có bệnh nhân xuất hiện triệu chứng rung giật cơ, động kinh, điếc vàđột quỵ giả tai biến giống như hội chứng MELAS [6]

nucleotide A bằng G tại vị trí 8363 trên mtDNA Phân tích RFLP cho thấy rằngđột biến tồn tại ở dạng không đồng nhất và có mức độ phân bố ở các mô khácnhau như ở cơ là 95%, ở máu là 59 - 94% [49]

Sự khiếm khuyết một hay nhiều phần của chuỗi phản ứng phosphoryl hóa(OXPHOS) trong quá trình trao đổi chất ở tế bào cơ của bệnh nhân mang đột biếnG8363A gây ra sự suy giảm tổng hợp protein của ty thể, do đột biến nằm trên gentRNAlys Sự thiếu hụt lysine sẽ ảnh hưởng đến các tiểu đơn vị trong chuỗi hô hấpcủa tế bào, ảnh hưởng trực tiếp đến phức hợp I và phức hợp IV của chuỗi hô hấp.Nghiên cứu sâu hơn cho thấy sự hiện diện của các peptid bất thường trong nguyênbào sợi da của một bệnh nhân mang đột biến G8363A [45, 49, 57]

Những biểu hiện lâm sàng của bệnh nhân mang đột biến A8363G cũng khôngđồng nhất, ở một số bệnh nhân có triệu chứng tâm thần chậm phát triển, mất thínhgiác, nhiều u mỡ, được chẩn đoán giống hội chứng Leigh

1.3.2 Những tác động của hội chứng MERRF trên người bệnh

Những đột biến gây MERRF làm suy giảm khả năng của ty thể trong việc tạo

ra các protein, sử dụng oxy và sản xuất năng lượng Những đột biến này ảnh hưởngđến các cơ quan và các mô với nhu cầu năng lượng cao như não và cơ Bệnh thườngbiểu hiện trong các mô và dễ dàng phát hiện trong mtDNA từ bạch cầu trong máu[37] Tuy nhiên, sự xuất hiện của dạng không đồng nhất có thể làm thay đổi mức độbiểu hiện ở các mô mang đột biến Do đó những người có triệu chứng ít phù hợpvới MERRF có thể không được phát hiện từ bạch cầu mà chỉ phát hiện ở các môkhác như nguyên bào sợi da nuôi cấy, niêm mạc miệng, nhưng đáng tin cậy nhất

là phát hiện từ các tế bào cơ xương [38]

Hội chứng MERRF thường được chẩn đoán lâm sàng dựa trên các triệuchứng tăng nồng độ lactate, pyruvate trong máu và trong dịch não tủy Proteindịch não tủy có thể tăng lên trong hội chứng MERRF Kỹ thuật chụp ảnh não nhưhình ảnh cộng hưởng từ có thể tìm thấy các tổn thương như đột quỵ Điện tâm đồ

có thể được sử dụng để chẩn đoán bất thường về tim Bảng 1.1 liệt kê các triệu

chứng và dấu hiệu thấy được trong 62 bệnh nhân mang đột biến MERRF [70] Cácđặc điểm lâm sàng thường gặp nhất có tỷ lệ tương ứng là: giật cơ, yếu cơ, mấtđiều hòa (35 - 45%); động kinh tổng quát, mất thính lực (25,0 - 34,9%); suy giảmnhận thức, nhiều u mỡ, bệnh thần kinh, không dung nạp tập thể dục (15,0 -24,9%); tăng CK, teo dây thần kinh thị giác, teo cơ, suy hô hấp, tiểu đường, đau

cơ, run, và chứng đau nửa đầu (5,0 - 14,9%) [70]

Bảng 1.1: Các biểu hiện và triệu chứng lâm sàng của 62 bệnh nhân MERRF [70]

Biểu hiện lâm sàng Tần số xuất hiện Tỷ lệ %

Những tác động của hội chứng MERRF lên bệnh nhân là khá đa dạng, phứctạp và không đồng nhất Các rối loạn của hội chứng MERRF ảnh hưởng đếnnhiều bộ phận của cơ thể, đặc biệt cơ bắp và hệ thần kinh, triệu chứng xuất hiện

từ thời thơ ấu hay tuổi vị thành niên Vì vậy việc phân tích mtDNA là quan trọng

ở nhiều trường hợp có sự rối loạn hệ thống không rõ ràng

1.3.3 Các phương pháp phát hiện đột biến MERRF

1.3.3.1.Phát hiện đột biến thuộc hội chứng MERRF bằng PCR kết hợp với RFLP

Kỹ thuật RFLP (restriction fragment length polymorphism) là kỹ thuật phântích tính đa hình chiều dài của các phân đoạn DNA được phân cắt giới hạn Phươngpháp này dựa trên độ đặc hiệu của các enzyme giới hạn (restriction enzyme) phâncắt đối với vị trí nhận biết của chúng trên DNA Sự thay đổi về trình tự nucleotidecủa DNA dẫn đến sự thêm hay bớt các điểm phân cắt của enzyme giới hạn, làm chocác đoạn DNA bị phân cắt có kích thước khác nhau, có thể nhận biết được dựa trênphổ băng khi điện di Theo đó, khi đột biến xuất hiện trong trình tự của DNA tạinhững vị trí giới hạn đặc hiệu sẽ dẫn đến tính đa hình trong chiều dài của các đoạnDNA khi được cắt bởi cùng một loại enzyme giới hạn đặc hiệu Hiện tượng này đãtạo ra sự khác biệt trong chiều dài của các đoạn DNA mà khi điện di chúng trên gelthì có thể phát hiện được các đột biến [25, 30, 45]

Kỹ thuật RFLP đã trở nên đơn giản hơn nhờ có sự phát triển của kỹ thuật PCR(polymerase chain reation) PCR là kỹ thuật phối hợp khả năng lai đặc hiệu củaDNA và khả năng kéo dài chuỗi của DNA polymerase để nhân bản các đoạn DNAkhác nhau lên gấp nhiều lần so với ban đầu DNA polymerase hoạt động theonguyên tắc cần phức hợp khuôn - mồi, trong môi trường thích hợp có các dNTP thì

sẽ kéo dài mồi thành sợi bổ sung với sợi khuôn Vì vậy, để nhân bản được đoạnDNA đích, người ta cần thiết kế các cặp mồi (primers) đặc hiệu Đây là một kỹthuật rất nhạy, chỉ cần một lượng nhỏ DNA khuôn (ng hoặc thấp hơn) phản ứngcũng có thể diễn ra