Xây dựng quy trình định lượng citral trong tinh dầu xả chanh bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò dãy diod

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC ======  ====== NGUYỄN THỊ HUÊ XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG CITRAL TRONG TINH DẦU SẢ CHANH BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO GHÉP ĐẦU DÒ DÃY DIOD KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC HÀ NỘI - 2019 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC ======  ====== NGUYỄN THỊ HUÊ XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG CITRAL TRONG TINH DẦU SẢ CHANH BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO GHÉP ĐẦU DỊ DÃY DIOD KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC KHOÁ: QHY.2014 NGƯỜI HƯỚNG DẪN: TS NGUYỄN THỊ THANH BÌNH HÀ NỘI - 2019 LỜI CẢM ƠN Trước tiên, xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới Tiến sĩ Nguyễn Thị Thanh Bình – Bộ mơn Hố Dược Kiểm nghiệm thuốc, Khoa Y - Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội, người tận tình hướng dẫn, bảo giúp đỡ tơi suốt q trình thực khóa luận Tôi xin cảm ơn thầy Bộ mơn Hố Dược Kiểm nghiệm thuốc, Khoa Y - Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội, tạo điều kiện để tơi thực khóa luận Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban Chủ nhiệm, Phòng ban Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội tồn thể thầy giáo Khoa cho kiến thức quý báu suốt năm học tập, sinh hoạt rèn luyện Khoa Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình bạn bè ln bên cạnh, động viên tơi lúc khó khăn q trình thực khóa luận Hà Nội, tháng 05 năm 2019 Sinh viên Nguyễn Thị Huê ACN Acetonit BP Dược điể DAD Máy đo q EP Dược điể GC Sắc ký k HPLC ICH Sắc ký lỏ chromato Hội nghị phẩm sử Harmoni Pharmac LOD Giới hạn LOQ Giới hạn MS Phương p NIR Quang p RSD Độ lệch c USP Dược điể MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG - TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu chung sả chanh 1.2 Giới thiệu chung citral 1.2.1 Nguồn gốc .4 1.2.2 Cấu trúc tính chất 1.2.3 Công dụng .5 1.2.4 Các phương pháp định lượng citral .6 1.3 Thẩm định quy trình phân tích 1.3.1 Tính đặc hiệu 1.3.2 Miền giá trị 10 1.3.3 Tính tuyến tính 10 1.3.4 Giới hạn phát .11 1.3.5 Giới hạn định lượng 11 1.3.6 Độ .12 1.3.7 Độ xác 13 CHƯƠNG - NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1 Nguyên vật liệu, trang thiết bị 14 2.1.1 Dung mơi, hố chất 14 2.1.2 Trang thiết bị .14 2.2 Phương pháp nghiên cứu 14 2.2.1 Tối ưu hoá điều kiện sắc ký 14 2.2.2 Thẩm định tính đặc hiệu 15 2.2.3 Thẩm định tính tuyến tính xác định miền giá trị 15 2.2.4 Xác định giới hạn phát giới hạn định lượng 15 2.2.5 Thẩm định độ 15 2.2.6 Thẩm định độ xác 15 2.2.7 Định lượng citral tinh dầu sả chanh 16 CHƯƠNG - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 17 3.1 Xác định điều kiện phân tích 17 3.1.1 Khảo sát hệ dung môi 17 3.1.2 Xác định bước sóng hấp thụ 19 3.1.3 Điều kiện sắc ký 20 3.2 Tính đặc hiệu 21 3.3 Tính tuyến tính miền giá trị .23 3.3.1 Đối với đồng phân neral 23 3.3.2 Đối với đồng phân geranial 24 3.4 Giới hạn phát giới hạn định lượng 26 3.5 Độ 26 3.5.1 Đối với đồng phân neral 26 7.5.2 Đối với đồng phân geranial 27 3.6 Độ lặp lại 27 3.6.1 Đối với đồng phân neral 28 3.6.2 Đối với đồng phân geranial 29 3.7 Độ xác trung gian 29 3.7.1 Đối với đồng phân neral 30 3.7.2 Đối với đồng phân geranial 31 3.8 Định lượng citral số mẫu tinh dầu sả chanh 31 3.8.1 Sản phẩm A 31 3.8.2 Sản phẩm B 32 3.8.3 Sản phẩm C 33 3.8 Bàn luận 35 CHƯƠNG - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 38 4.1 Kết luận 38 4.2 Kiến nghị 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cơng thức c Hình 3.1 Sắc ký đồ dung dịch citral chuẩn nồng độ 25 µg/ml bước sóng 233 nm, hệ dung môi ACN : H2O = 70 : 30 (v/v/v) Hình 3.2 Sắc ký đồ dung dịch citral chuẩn nồng độ 25 µg/ml bước sóng phát 233 nm với hệ dung môi ACN : MeOH : H2O = 47 : 10 : 43 (v/v/v) Hình 3.3 Phổ hấp thụ UV-VIS Neral (A) Geranial (B) Hình 3.4 Sắc ký đồ dung dịch citral chuẩn nồng độ 25 µg/ml điều kiện sắc ký lựa chọn Hình 3.5 Phổ hấp thụ cực đại UV-VIS geraniol Hình 3.6 Sắc ký đồ dung dịch chứa 20 µg/ml citral µg/ml geraniol bước sóng phát 200 nm Hình 3.7 Sắc ký đồ dung dịch chứa 20 µg/ml citral µg/ml geraniol bước sóng phát 242 nm Hình 3.8 Đồ thị biểu diễn tương quang nồng độ dung dịch diện tích pic đồng phân neral Hình 3.9 Đồ thị biểu diễn tương quang nồng độ dung dịch diện tích pic đồng phân geranial Hình 3.10 Kết xác định độ lặp lại phương pháp đồng phân neral Hình 3.11 Sắc ký đồ dung dịch mẫu A nồng độ 100 µg/ml Hình 3.12 Sắc ký đồ dung dịch mẫu B nồng độ 100 µg/ml Hình 3.13 Sắc ký đồ dung dịch mẫu C nồng độ 50 µg/ml DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Tên gọi sả Bảng 1.2 Hàm lượng ci Bảng 3.1 Thông số pic dung dịch citral chuẩn nồng độ 25 µg/ml bước sóng phát 233 nm với hệ dung mơi ACN : H 2O = 70 : 30 (v/v) 18 Bảng 3.2 Thông số pic dung dịch citral chuẩn nồng độ 25 µg/ml bước sóng phát 233 nm với hệ dung môi ACN : MeOH : H2O = 47 : 10 : 43 (v/v/v) Bảng 3.3 Thông số pic dung dịch citral chuẩn nồng độ 25 µg/ml điều kiện sắc ký lựa chọn Bảng 3.4 Thông số pic dung dịch citral 20 geraniol µg/ml bước sóng phát Bảng 3.5 Kết phân tích hồi quy mối tương quan nồng độ dung dịch diện tích pic đồng phân neral Bảng 3.6 Kết phân tích hồi quy mối tương quan nồng độ dung dịch diện tích pic đồng phân geranial Bảng 3.7 Kết xác định tỷ lệ phục hồi đồng phân neral Bảng 3.8 Kết xác định tỷ lệ phục hồi đồng phân geranial Bảng 3.9 Kết xác định độ lặp lại phương pháp đồng phân geranial Bảng 3.10 Kết xác định độ xác trung gian phương pháp đồng phân neral Bảng 3.11 So sánh số phương pháp định lượng citral Bảng 4.1 Các yêu cầu đảm bảo quy trình định lượng neral Bảng 4.2 Các yêu cầu đảm bảo quy trình định lượng geranial Hình 3.11 Sắc ký đồ dung dịch mẫu A nồng độ 100 µg/ml Trên sắc ký đồ ghi nhận xuất pic: Pic có thời gian lưu trùng với thời gian lưu neral Diện tích pic 8,231 mAU.min tương ứng với nồng độ 24,85 µg/ml Như mẫu A chứa 24,85% neral Pic có thời gian lưu trùng với thời gian lưu geranial Diện tích pic 10,138 mAU.min tương ứng với nồng độ 21,54 µg/ml Như mẫu A chứa 21,54% geranial Như tổng hàm lượng citral mẫu A 46,39 µg/ml, tương đương với 46,39% 3.8.2 Sản phẩm B Pha loãng dung dịch mẹ 125 lần dung môi ACN : H 2O (60:40, v/v) thu dung dịch có nồng độ tinh dầu 100 µg/ml Sắc ký dung dịch Kết thể hình 3.12: 32 Hình 3.12 Sắc ký đồ dung dịch mẫu B nồng độ 100 µg/ml Trên sắc ký đồ ghi nhận xuất pic: Pic có thời gian lưu trùng với thời gian lưu neral Diện tích pic 12,793 mAU.min tương ứng với nồng độ 37,35 µg/ml Như mẫu B chứa 37,35% neral Pic có thời gian lưu trùng với thời gian lưu geranial Diện tích pic 17,738 mAU.min tương ứng với nồng độ 35,96 µg/ml Như mẫu B chứa 35,96% geranial Như tổng hàm lượng citral mẫu B 73,31 µg/ml, tương đương với 73,31% 3.8.3 Sản phẩm C Pha loãng dung dịch mẹ 150 lần dung môi ACN : H 2O (60:40, v/v) thu dung dịch có nồng độ tinh dầu 50 µg/ml Sắc ký dung dịch điều kiện chọn Kết thể hình 3.13: 33 Hình 3.13 Sắc ký đồ dung dịch mẫu C nồng độ 50 µg/ml Trên sắc ký đồ ghi nhận xuất pic: Pic có thời gian lưu trùng với thời gian lưu neral Diện tích pic 6,017 mAU.min tương ứng với nồng độ 18,78 µg/ml Như mẫu C chứa 37,56% neral Pic có thời gian lưu trùng với thời gian lưu geranial Diện tích pic 8,795 mAU.min tương ứng với nồng độ 18,69 µg/ml Như mẫu C chứa 37,38% geranial Như tổng hàm lượng citral mẫu C 36,47 µg/ml, tương đương với 74,94% 34 3.8 Bàn luận So sánh phương pháp xây dựng với số phương pháp định lượng citral Bảng 3.11 So sánh số phương pháp định lượng citral Thông số Phương ph Pha đảo, sử dụng hệ dung môi ACN :H2O=70:30, tốc độ dòng ml/phút, tiêm mẫu 15 µl, bước miền giá trị 3-100 HPLC µg/ml citral [49] môi ACN : H2O : CH3 OH=47:43:10 , tốc độ dịng 1,4 ml/phút, thể tích tiêm mẫu 15 µl , bước miền giá trị 50-90 sóng 240 35 µg/ml citral [51] Phương pháp xây dựng: pha đảo, hệ dung môi ACN : H2O:CH3OH = 47 : 43 :10 , tốc độ dòng ml/phút, thể tích tiêm mẫu 10 µl , bước sóng phát nm, miền giá trị 10 citral Chú thích: ( - ) chưa xác định Từ bảng kết so sánh cho thấy phương pháp xây dựng có độ xác, độ lặp lại thấp so với phương pháp khác Tuy nhiên phương pháp xây dựng lại có ưu điểm vượt trội như: So với phương pháp NIR: phương pháp xây dựng đại hơn, có khả định lượng đồng thời đồng phân citral tiến hành xác định thêm thông số (độ lặp lại, LOD LOQ) - So với phương pháp HPLC pha thuận: phương pháp xây dựng có khả định lượng đồng thời đồng phân citral có tính đặc hiệu hơn, tiến hành xác định thêm thơng số (độ xác trung gian, LOD LOQ) - So với phương pháp HPLC pha đảo khác: phương pháp xây dựng xác định đầy đủ thông số (tỷ lệ phục hồi, độ xác trung gian, độ lặp lại, LOD, LOQ) có miền giá trị rộng - 36 Như phương pháp xây dựng có ưu điểm bật: có khả tách chất hồn tồn nên tính đặc hiệu cao, độ xác cao nhạy với nồng độ nhỏ Chất lượng mẫu tinh dầu sả chanh Qua kết định lượng citral ba sản phẩm tinh dầu sả chanh thị trường Kết xác định hàm lượng citral sản phẩm tương đương với hàm lượng citral ghi nhãn bao bì sản phẩm Sản phẩm A B có hàm lượng citral 73,31% 74,94%, đạt yêu cầu chất lượng hàm lượng citral tinh dầu sả chanh Sản phẩm C có hàm lượng citral thấp (46,39%), không đạt yêu cầu chất lượng hàm lượng citral tinh dầu sả chanh 37 CHƯƠNG - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Dựa tài liệu thẩm định quy trình phân tích ICH, nghiên cứu xây dựng thẩm định thành cơng quy trình định lượng đồng thời hai đồng phân hình học citral hệ thống HPLC - DAD với thông số: pha tĩnh silicagel C18 cột μm, 4,6×250 mm, pha động nước : acetonitril : nước : methanol tỷ lệ 43 : 47 : 10, thể tích tiêm mẫu 10 µl, thời gian sắc ký 25 phút, tốc độ dòng ml/phút, đầu dò DAD bước sóng 242 nm Bằng q trình thực nghiệm chứng tỏ quy trình định lượng đồng thời hai đồng phân hình học citral đạt yêu cầu tính đặc hiệu, tính tuyến tính, độ độ xác (bảng 4.1 bảng 4.2) theo hướng dẫn chung ICH - Đối với neral Bảng 4.1 Các yêu cầu đảm bảo quy trình định lượng neral Miền giá trị Tính tuyến tính Hệ số tương quan R2 Độ Độ lặp lại Độ xác trung gian Độ lệch chuẩn S 38 - Đối với geranial Bảng 4.2 Các yêu cầu đảm bảo quy trình định lượng geranial Miền giá trị Tính tuyến tính Hệ số tương quan R2 Độ Độ lặp lại Độ xác trung gian Độ lệch chuẩn S Phương pháp ứng dụng để định lượng citral mẫu tinh dầu sả chanh thị trường 4.2 Kiến nghị Ứng dụng phương pháp để góp phần vào việc kiểm soát chất lượng tinh dầu sả chanh thị trường Phương pháp sở để lựa chọn nguyên liệu bào chế sản phẩm chống côn trùng từ tinh dầu sả chanh 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt [1] Bộ Y tế (2012), Kiểm nghiệm thuốc (dùng cho đào tạo dược sĩ đai học), Nhà xuất giáo dục Việt Nam, pp.135-184 [2] Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm (2010), Thẩm định phương pháp phân tích hố học vi sinh vật, NXB Khoa học Kỹ thuật,pp.10-59 [3] Vụ khoa học đào tạo – Bộ Y tế (2005), Kiểm nghiệm dược phẩm, NXB Y học, pp.68-84 Tiếng anh [4] Adams, R Identification of Essential Oils Compounds by Gas Chromatography – Mass Spectroscopy Allured Publishing Co : IL, 1997 [5] Barbier; Bouveault Comp Rend 1894, 118, 983, 1050 ; 1895, 121, 1159; 1896, 122, 293 [6] Bassolé, I H., A Lamien-Meda, B Bayala, L.C Obame, A J Ilboudo, C Franz, J Novak, R C Nebié, M H Dicko, 2011 Phytomedicine, 18(12): 1070-1074 [7] Bermejo, P.; Abad, M.; Silvon Sen, A.; Sonchez Contreras, S.; Diaz lanza, A Life Sci 1998, 63, 1147- 1156 [8] Bertram Schimmel’s Report 1888, 17 [9] Bilal Yilmaz, Emrah Alkan (2015), “Spectrofluorometric and Spectrofluorometric and UV Spectrofluorometric Methods for the [10] Chenghan Mei, Bin Li, et al (2015), "Liquid chromatography-tandem mass spectrometry for the quantification of flurbiprofen in human plasma and its application in a study of bioequivalence", Journal of Chromatography B, 993-994, pp.69-74 [11] Determination of Flurbiprofen in Pharmaceutical Preparations”, Journal of Pharmaceutical Analysis, 4(4) [12] Dodge Amer Chem J 1890, 12, 553 [13] Epstein, W.; McGee, L.; Poulter,C.; Marsh, J Chem Eng Data 1976, 21, 500 [14] European Medicines Agency (2011), Guideline on bioanalytical method validation, pp.9-10 [15] Fenaroli, G., Furia, T.E., Bellanca, N., Handbook of Flavor Ingredients, ISBN 0-87819-532-7 [16] Gbenou, J D., J F Ahounou, H B Akakpo, A Laleye, E Yayi, F Gbaguidi, L BabaMoussa, R Darboux, P Dansou, M Moudachirou, S O Kotchoni, 2013 Molecular Biology Reports, 40 (2): 1127-1134 [17] Hattori, T.; Ito, M.; Suzuki, Y Nippon Yakurigaku Zasshi 1991, 97, 13-21 [18] Husek, P.; Mack, K J Chromatgr 1975, 133, 139-230 [19] Jennings, W.; Shibamoto, T Qualitative Analysis of Flavor and Fragrance Volatile by Capillary Gas Chromatography Academic Press: New York, 1980 [20] Joulain, D.; Konig, A.; Verlag, E The Atlas of Spectral Data of Sesquiterpene Hydrocarbons Hamburg, Germany, 1998 [21] Khan, M S., I Ahmad, 2012 Journal of Ethnopharmacology, 140 (2): 416-423 [22] Kokane Vikrant , Naik Sonali (2014), “Formulation and evaluation of topical flurbiprofen gel using different gelling agents”, World Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 3(9),pp 654-663 [23] Kruger; Stiehl; Tiemann J Pr Chem 1898, 58, 51; 1899, 59, 497 [24] Kuwahara, Y., Suzuki, H., Matsumoto, K & Wada, Y (1983) “Pheromone study on acarid mites XI Function of mite body as geometrical isomerization and reduction of citral (the alarm pheromone) Carpoglyphus lactis” Appl Entomol Zool 18: 30–39 [25] Lawless, J., The Illustrated Encyclopedia of Essential Oils, ISBN 185230-661-0 [26] Libbey, L.; Essent, J Oil Res 1991, 3, 192 [27] Maíra Maciel Mattos de Oliveiraa, Danilo Florisvaldo Brugneraa, Maria das Graỗas Cardosob, Eduardo Alvesc and Roberta Hilsdorf Piccoli, 2010 Food Control, 2010 21(4): 549-553 [28] Motoo, Y.; Sawabu, N Cancer Lett 1994, 86, 91-95 [29] Murray, Kermit K., et al (2013), "Definitions of terms relating to mass spectrometry (IUPAC Recommendations 2013)", Pure and Applied Chemistry, 85(7),1515-1609 [30] Onawunmi, G.O (1989) “Evaluation of the antimicrobial activity of citral” Lett Appl Microbial (3): 105–108 [31] Pala-Paul, J.; Perez-Alonso, M.; Velasco-Negueruela, A.; Sanz, J “Analysis by Gas Chromatography – Mass Spectroscopy of the Volatile Components of Ageratina Adenophora Spreng., Growing in the Canary Islands.” J of Chromatography 2002, 947, 327-331 [32] Parry, E.J The Chemistry of Essential Oils and Artificial Perfumes 4th Ed.; Scott, Greenwood and Son: London, UK, 1921; Vol 1, pp 63, 270, 71-73, 270 [33] Robacker, D.C & Hendry, L.B (1977) “Neral and geranial: components of the sex pheromone of the parasitic wasp, Itoplectis conquisitor” J Chem Ecol (5): 563–577 [34] Schimelpfenig, C.W J Chem Ed 1978, 55, 306 [35] Semmler, F W Ber Dtsch Chem Ges 1891, 24, 201 [36] Semmler, F.W Ber Dtsch Chem Ges 1890, 23, 2965-3556 [37] Simonsen, J.L The Terpenes 2nd Ed Cambridge University Press: Cambridge, 1947; Vol 1, pp 42 - 45, 70 - 85 [38] Singh, P., R Shukla, A Kumar, B Prakash, S Singh, N K Dubey, 2010 Mycopathologia, 170(3): 195-202 [39] Sofowora, A Medicinal Plants and Traditional Medicine in Africa John Wiley & Sons Inc : New York, 1982; pp 71-72 [40] Survey and health assessment of chemical substances in massage oils Archived 28 June 2007 at the Wayback Machine [41] Swinger, A.; Silverstein, R Aldrich Chemical Co Milwaukee, WI, 1981 [42] The Europaean Pharmacopieal Commission (2010), Pharmacopoeia Europaea 7th Edition vol 2, pp.2056-2057 [43] The International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use (2005), Validation of analytical procedures: text and methodology Q2(R1), pp.6-13 [44] Tiemann Ber DTSCH Chem Ges 1899, 32, 117 [45] Wilson, C.M Grass and People University of Florida Press: Gainesville, 1961; pp 75 [46] Wilson, N.; Ivanova, M.; Watt, R.; Moffat, A “The quantification of Citral in Lemon Grass and Lemon Oils by Near-Infrared Spectroscopy.” The Journal of Pharmacy And Pharmacology 2002, 54, 1257-1263 [47] Xiuqin, L.; Jia, Y.; Song, A.; Chen, X ; Bi, K “Analysis of the Essential Oil from Radix Bupleuri Using Capillary Gas Chromatography.” The Pharmaceutical Society of Japan 2005, 125, 815-819 [48] Zeitshel Ibid 1906, 39, 1787 [49] Gaonkar, R., Yallappa, S., Dhananjaya, B L., & Hegde, G (2016) Development and validation of reverse phase high performance liquid chromatography for citral analysis from essential oils Journal of Chromatography B, 1036-1037, 50–56 [50] Rauber, C.; Guterres, S.; Schapoval, E “LC Determination of Citral in Cymbopogon Citratus Volatile Oil.” J of Pharmaceutical And Biomedical Analysis 2004, 37, 597-601 [51] Miron, D., Battisti, F., Schwengber Ten Caten, C., Mayorga, P., & Eva Scherman Schapoval, E (2012) Spectrophotometric Simultaneous Determination of Citral Isomers in Cyclodextrin Complexes with Partial Least Squares Supported Approach Current Pharmaceutical Analysis, 8(4), 401–408 Trang web [52] http://www.uni-graz.at/~katzer/engl/Cymb_cit.html 2005 [53] http://edis.ifas.ufl.edu 2005 [54] https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Citral#section=Chemicaland-Physical-Properties ... DƯỢC ======  ====== NGUYỄN THỊ HUÊ XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG CITRAL TRONG TINH DẦU SẢ CHANH BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO GHÉP ĐẦU DÒ DÃY DIOD KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH... tinh dầu sả chanh, tinh dầu chanh ta tinh dầu vỏ chanh tây Kết xác định hàm lượng citral mẫu tinh dầu sả chanh 74,98%, mẫu tinh dầu chanh ta 2.09% mẫu tinh dầu từ vỏ chanh tây 0,3% 1.3 Thẩm định. .. hành xây dựng quy trình định lượng citral tinh dầu sả chanh phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao ghép đầu dò dãy diod theo hướng dẫn Hội nghị quốc tế hài hồ hố thủ tục đăng ký dược phẩm sử dụng cho