Mục tiêu nghiên cứu của đề tài này nhằm phát hiện các gene blaOXA lưu hành trong các chủng AB ở bệnh viện Đa khoa Thống Nhất, Đồng Nai năm 2013. Mời các bạn cùng tham khảo bài viết để nắm rõ nội dung chi tiết của đề tài nghiên cứu này.
Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 6 * 2014 PHÁT HIỆN CÁC GENE BLAOXA Ở ACINETOBACTER BAUMANNII BẰNG PHƯƠNG PHÁP MULTIPLEX PCR‐ELISA Nguyễn Sĩ Tuấn*, Lưu Trần Linh Đa*, Lê Duy Nhất*, Hứa Mỹ Ngọc*, Nguyễn Ngọc Thanh*, Phạm Thị Thanh Thủy*, Phạm Văn Dũng*, Nguyễn Thúy Hương** TĨM TẮT Đặt vấn đề: Acinetobacter baumannii (AB) kháng đa kháng sinh bằng nhiều cơ chế, bao gồm giảm tính thấm qua màng, biểu hiện quá mức bơm thải kháng sinh và sản xuất carbapenemase. Năm 2013, AB kháng carbapenem bùng phát mạnh ở nhiều bệnh viện. Tính kháng này có thể do sự sản xuất các carbapenemase, trong đó các oxacillinase thủy phân carbapenem thuộc lớp D (OXA‐23, OXA‐40, OXA‐58 và OXA‐51) được cơng bố phổ biến nhất ở Châu Á – Thái Bình Dương. Mục tiêu: Phát hiện các gene blaOXA lưu hành trong các chủng AB ở bệnh viện Đa khoa Thống Nhất, Đồng Nai năm 2013. Phương pháp nghiên cứu: Multiplex PCR – ELISA được tiến hành để phát hiện các blaOXA mã hố các oxacillinase thuỷ phân carbapenem ở AB và sau đó, kết quả được kiểm tra bằng multiplex PCR truyền thống. Kết quả: Trong 66 chủng AB thử nghiệm, có 83,3% kiểu gene kháng carbapenem là blaOXA‐23 và 16,67% blaOXA‐58. Có tới 97% các chủng AB mang gene blaOXA‐51. Kết luận: Cần tiến hành cách ly các bệnh nhân nhiễm trùng do AB có lưu hành các blaOXA, đặc biệt là các gene nằm trên plasmid, nhằm ngăn ngừa sự phát tán gene kháng thuốc. Từ khóa: Acinetobacter baumannii, carbapenem, carbapenemase,blaOXA‐23, blaOXA‐51, blaOXA‐58. ABSTRACT DETECT BlaOXA GENES OF ACINETOBACTER BAUMANNII BY MULTIPLEX PCR – ELISA METHOD Nguyen Si Tuan, Luu Tran Linh Da, Le Duy Nhat, Hua My Ngoc, Nguyen Ngoc Thanh, Pham Thi Thanh Thuy, Pham Van Dung, Nguyen Thuy Huong * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 ‐ Supplement of No 6‐ 2014: 458 – 462 Background: Acinetobacter baumannii (AB) multiple antibiotic resistance by various mechanisms, including decreased membrane permeability, antibiotic pump overexpression and carbapenemase production. In 2013, outbreak of carbapenem which are resistant to AB occured in many hospitals. This resistance may be due to the production of carbapenemase, in which the hydrolysis oxacillinase carbapenem class D (OXA ‐ 23, OXA ‐ 40, OXA ‐ 58 and OXA ‐ 51) was documented most in Asian Pacific Ocean. Objectives: To detect the gene blaOXA in AB strains accuired at Thong Nha‐ Dong Nai General Hospital in 2013. Methods: Multiplex PCR ‐ ELISA was performed to detect blaOXA encoded oxacillinase in AB and then, the results were confirmed by multiplex PCR. Result: In 66 AB strains tested, 83.3% genotypes resisted to carbapenem was blaOXA‐23 and 16.67% blaOXA‐58. Up to 97% of the AB strain was carrying blaOXA‐51 gene. Conclusion: It is necessary to isolate patients infected AB carrying the blaOXA, especially the genes located on plasmid in order to prevent the spread of resistance genes. **ĐH Bách Khoa TP.HCM – Đại học Quốc gia TP.HCM Bệnh viện Đa khoa Thống Nhất, Đồng Nai Tác giả liên lạc: Ths. Nguyễn Sĩ Tuấn ĐT: 0919563 323 Email: nsituan@gmail.com * 458 Chun Đề Y Tế Cơng Cộng Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 6 * 2014 Nghiên cứu Y học Key words: Acinetobacter baumannii, carbapenem, carbapenemase,blaOXA‐23, blaOXA‐51, blaOXA‐58. ĐẶT VẤN ĐỀ Trong suốt thế kỷ trước, sự bùng phát các vụ dịch Acinetobacter baumannii đa kháng thuốc gây nhiễm khuẩn bệnh viện, đặc biệt ở những bệnh nhân suy giảm miễn dịch trong các đơn vị Hồi sức Cấp cứu (ICU), đã được ghi nhận ở khắp các vùng địa lý khác nhau trên toàn thế giới(1,10). Những nhiễm trùng này bao gồm nhiễm trùng huyết, nhiễm trùng vết mổ, viêm màng não thứ cấp, nhiễm trùng đường niệu và viêm phổi liên quan thở máy(1,10). Tuy nhiên, sự phát triển gần đây của các chủng Acinetobacter baumannii sản xuất Carbapenemase lớp D (chủ yếu là oxacillinase), là mối quan tâm lớn nhất đối với cộng đồng khoa học quốc tế, kể từ khi Carbapenem được sử dụng thường xuyên để điều trị nhiễm các chủng Acinetobacter baumannii đa kháng kháng sinh(2,8). Vì những lý do này, đề nghị cần thiết phải có một chương trình giám sát trong đó bao gồm theo dõi sự kháng kháng sinh và các nhiễm trùng mắc phải tại ICU (là gì?), với việc sử dụng các phương pháp nhanh chóng, hiệu quả và đáng tin cậy. Multiplex PCR – ELISA là một phương pháp chẩn đoán mới để trực tiếp phát hiện các gene mã hóa OXA – carbapenemase trong các bệnh phẩm lâm sàng. Mục tiêu nghiên cứu Xác định tỷ lệ các nhóm gene blaOXA lưu hành ở Acinetobacter baumannii tại bệnh viện Đa khoa Thống Nhất, Đồng Nai năm 2013 bằng multiplex PCR‐ELISA. Xác định lại kết quả bằng phương pháp multiplex PCR. ĐỐI TƯỢNG ‐ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Bệnh phẩm lâm sàng và chủng vi khuẩn 66 mẫu bệnh phẩm, bao gồm: 4 ca cấy máu dương tính, 6 ca cấy mủ vết thương, 2 ca cấy nước tiểu và 54 ca cấy đàm, được thu thập trong năm 2013 tại Bệnh viện Đa khoa Thống Nhất, Đồng Nai. Các bệnh phẩm được phân lập trên môi trường MacConkey (MC). Định danh được Chuyên Đề Y Tế Công Cộng tiến hành bằng bộ định danh API 20NE, Biomerieux, Pháp. Kiểm tra nhạy cảm kháng sinh Các chủng Acinetobacter baumannii thuần được thử nghiệm nhạy cảm kháng sinh bằng phương pháp Kirby‐Bauer với đĩa kháng sinh của 4 nhóm: aminoglycoside, β‐lactam (Imipenem và Meropenem), quinolon, và polymycine (colistin) của hãng Biomerieux, Pháp. Các chủng kháng carbapenem được tiến hành thử nghiệm nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của imipenem và meropenem bằng phương pháp E‐TEST, Biomerieux, Pháp. Tách chiết DNA và blaOXA PCR Các khuẩn lạc đơn – thuần khiết (một khuẩn lạc) được huyền phù trong 500 μl multiplex lysis buffer. Lysis buffer được ủ 10 phút trong thermoblock ở 990C.Sau đó ly tâm 1000 vòng/ 2 phút, hút 5 μl dịch nổi để tiến hành PCR. Các gene mã hóa oxacillinase được xác định bằng cách sử dụng kỹ thuật multiplex PCR với các mồi đặc hiệu cho blaOXA‐23, blaOXA‐40, blaOXA‐51, blaOXA‐ 58 (OXA‐23F: 5’GATCGGATTGGAGAACCAGA3’; OXA‐23R: 5’–ATTTCTGACCGCATTTCCAT–3’; OXA‐40F: 5’– GGAATTCCATGAAAAAATTTATACTTCC–3’; OXA‐40R: 5’– CIIIATCCCGTTAAATGATTCCAAGAIIIICTA GCG – 3’; OXA‐51F: 5’ – TAATGCTTTGATCGGCCTTG–3’; OXA‐51R: 5’–TGGATTGCACTTCATCTTGG–3’; OXA‐58F: 5’–AAGTATTGGGGCTTGTGCTG–3’; OXA‐ 58R: 5’–CCCCTCTGCGCTCTACATAC–3’). Mỗi phản ứng multiplex PCR gồm 5 μl dịch nổi/5 μl chứng âm, 1 μl dung dịch Nucleotide, 2 μl dung dịch mồi, 5 μl PCR buffer 10x, 0.2 μl DNA polymerase 1U, thêm H2O cất 2 lần cho đủ 50 μl. PCR – ELISA Sản phẩm PCR được lai đặc hiệu với các oligonucleotide trong hệ thống ELISA. 459 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 6 * 2014 Hình 1. Lưu đồ PCR‐ELISA phát hiện oxacillinase ở Acinetobacter baumannii phân lập từ các bệnh phẩm đàm, mủ, máu và Thống kê, phân tích số liệu nước tiểu trong số 2.288 mẫu cấy dương tính. Nghiên cứu được tiến hành theo phương Chọn ngẫu nhiên 66 chủng để tiến hành thử pháp cắt ngang mô tả, mẫu không xác suất và nghiệm, bao gồm: 4 chủng từ cấy máu, 2 chủng thuận tiện. Số liệu được nhập bằng Epi‐data 3.1 từ cấy catheter thông tiểu, 6 chủng từ mủ vết và xử lý bằng phần mềm Stata 11.0. thương hậu phẫu và 54 chủng từ đàm. KẾT QUẢ Trong nghiên cứu trước trong năm 2013, 369 chủng Acinetobacter baumannii (16,13%) được Bảng 1: Tỷ lệ đề kháng kháng sinh của 66 chủng A. Baumannii thử nghiệm Nhóm Amino glycoside Fluroquinolon Tetracycline Cephem β-lactam/ức chế β-lactamase Carbapenem Lipopeptide Ức chế biến dưỡng Folate 460 Kháng sinh Amikacine Gentamycine 10µg Netilmycine Ciprofloxacine Doxycyline Cefatadizime Cefotaxime Cefpodoxim Cefuroxim Cefepime Ampicillin/Sulbactam Cephaperazone/Sulbactam Piperacillin/ tazobactam Ticarcillin/ clavulanic acid Imipenem Meropenem Colistin Bactrim Kháng (%) 81,13 95 80,39 94,12 48,72 89,89 100 100 98,04 88,89 42,86 48,28 92,59 89,19 90,2 92,73 86,36 Nhạy (%) 11,32 19,61 5,88 51,28 10,11 0 1,96 11,11 42,86 31,03 7,41 5,41 9,8 5,45 100 9,09 Trung gian (%) 7,55 0 0 0 0 14,29 20,69 5,41 0 4,55 Chun Đề Y Tế Cơng Cộng Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 6 * 2014 Nghiên cứu Y học Từ bảng 1 thấy, đa số A. baumannii thử nghiệm kháng cao với hầu hết các kháng sinh, kháng trung bình với tetracycline và β‐ lactam/sulbactam và nhạy 100% lipopeptide (colistin). 599 bp) và blaOXA‐51 (kích thước 353 bp) được phát hiện khi tiến hành điện di sản phẩm DNA khuếch đại trên agarose gel. Nhóm đầu tiên trong các chủng thử nghiệm dương tính với cả OXA‐51 và OXA‐23 (83,3%). Nhóm thứ hai dương tính với cả OXA‐51 và OXA‐58 (16,67%). Nhóm thứ ba, chỉ dương tính với OXA‐58 (2 ca, chiếm 0,03%). Hình 2: Phương pháp multiplex PCR – ELISA phát hiện Oxacillinase ở A. baumannii. Bảng 2: MIC Meropenem và Imipenem ở 66 Acinetobacter baumannii thử nghiệm Số chủng A baumannii 1 1 60 MIC Meropenem 0,125 0,38 0,75 14 >32 MIC Imipenem 0,25 0,38 0,5 0,19 >32 Từ bảng 2 cho thấy, đa số các chủng trong lô thử nghiệm (> 92%) có MIC (carbapenem) >14 μg/ml. Đây là các chủng Acinetobacter baumannii có kiểu hình kháng carbapenem bằng E‐TEST. Bảng 3: Các nhóm gene blaOXA trong số 66 chủng A. baumannii nghiên cứu PCR-ELISA A baumannii blaOXA-23 blaOXA-40 blaOXA-51 blaOXA-58 MÁU 4 BỆNH PHẨM NƯỚC TIỂU MỦ 6 0 ĐÀM 54 45 50 Từ hình 3 và bảng 3 cho thấy, các nhóm gene blaOXA‐23(kích thước 501 bp), blaOXA‐58 (kích thước Chun Đề Y Tế Cơng Cộng Hình 3: Kết quả được thiết lập sau khi multiplex PCR được tiến hành, sử dụng agarose gel 2% để phát hiện các gene blaOXA trong các Acinetobacter baumannii. BlaOXA‐51 là một gene nội tại của A. Baumannii(6). Đây là gene nằm trên nhiễm sắc thể, cần thiết để điều hoà vùng thượng nguồn bởi ISAba1 để kích thích tính kháng carbapenem. Tỷ lệ blaOXA‐51 trong các chủng Acinetobacter baumannii phân lập từ lâm sàng trong thử nghiệm này là gần 97%. Số liệu này thấp hơn các phát hiện trong nghiên cứu được tiến hành ở Iran bởi Feizabadi và cộng sự (2008), theo đó có 100% chủng có gene blaOXA‐51 (3). Tỷ lệ blaOXA‐23 ở các chủng AB phân lập từ lâm sàng trong nghiên cứu này là 83,3%. Phát hiện này cao hơn nhiều so tỷ lệ blaOXA‐23 chung là 66,5% phát hiện ở các quốc gia Châu Á‐Thái Bình Dương (Ấn Độ, Trung Quốc, Thái Lan, Singapore, Hồng Kông và Hàn Quốc; khơng có Việt Nam)(5). Tuy nhiên, dựa trên nghiên cứu khác được tiến hành bởi Feizabadi và cộng sự (2008), cho thấy có 36,5% các chủng Acinetobacter baumannii phân lập từ lâm sàng có tỷ lệ mang gene blaOXA‐23 khác biệt nhau ở trên thế giới(3). BlaOXA‐23 là một gene đề kháng carbapenem mắc phải nằm trên plasmid của Acinetobacter baumannii, vì thế có một tỷ lệ khác nhau được 461 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 6 * 2014 phát hiện so với gene blaOXA‐51 là gene kháng carbapenem xuất hiện tự nhiên nằm trên nhiễm sắc thể của AB(6,7). Tỷ lệ blaOXA‐58 trong các AB phân lập từ lâm sàng trong nghiên cứu này chiếm 16,67%. Số liệu này cao hơn tỷ lệ 15% blaOXA‐58 ở AB trong nghiên cứu của Feizabadi và cộng sự tại Iran năm 2008(3). BlaOXA‐58 là gene vừa nằm trên nhiễm sắc thể, vừa nằm trên plasmid nên các tỷ lệ phân lập trên thế giới có sự khác biệt(7). Các kết quả này cũng phù hợp với các tổng kết gần đây của Tada và cộng sự công bố năm 2013 tại chính 2 bệnh viện Bạch Mai và Chợ Rẫy, theo đó trong cơ chế tiết enzyme phá hủy kháng sinh carbapenem, các OXA‐carbapenemase lớp D (Ambler carbapenemase lớp D) phổ biến trên tồn thế giới và khu vực Châu á – Thái Bình Dương lưu hành chủ yếu các chủng Acinetobacter baumannii mang gene mã hóa nhóm OXA‐23(9). quan tới khả năng lây lan của chủng vi khuẩn này, theo đó phát tán các gene kháng thuốc, cần được điều tra nghiên cứu trong tương lai. TÀI LIỆU THAM KHẢO Bergogne‐Berezin E., Towner KJ. (1996). Acinetobacter spp. as nosocomial pathogens: microbiological, clinical, and epidemiological features. Clinical microbiology Reviews. 9(2) 148. Brown S, Amyes SGB (2005). The sequences of seven class D β‐lactamases isolated from carbapenem‐resistant Acinetobacter baumannii from four continents. Clinical Microbiology And Infection. 11(4), 326‐329. Feizabadi MM, Fathollahzadeh B, Taherikalani M (2008). Antimicrobial susceptibility patterns and distribution of blaOXA genes among Acinetobacter spp. isolated from patients at Tehran hospitals. J Infect Dis. 61(4). 274‐8. Lain A. Gustavo MC. Saruar B. Anton YP. (2013). Carbapenem resistance in Acinetobacter baumannii. Expert Rev Anti Infect Ther. 11(4). 395 – 409. Mendes RE, Bell JM, Turnidge JD, Castanheira M, Jones RN (2009). Emergence and widespread dissemination of OXA‐23. ‐24/40 and –58 carbapenemases among Acinetobacter spp in Asia‐Pacific nations: report from the SENTRY Surveillance Program. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 63. 55‐59. Merkier AK, Centrón D (2006). Bla‐OXA‐51‐type β‐lactamase genes are ubiquitous and vary within a strain in Acinetobacter baumannii. International Journal Of Antimicrobial Agents. 28(2). 110‐113. Perez F, Hujer AM, Hujer KM, Decker BK, Rather PN, Bonomo RA, (2007). Global challenge of multidrug‐resistant Acinetobacter baumannii. Antimicrobial agents and chemotherapy. 51(10). 3471‐3484. Poirel L, Nordmann P (2006). Carbapenem resistance in Acinetobacter baumannii: mechanisms and epidemiology. Clinical microbiology and infection. 12(9). 826‐836. Tada T, Miyoshi‐Akiyama T, Kato Y (2013). Emergence of 16S rRNA methylase‐producing Acinetobacter baumannii and Pseudomonas aeruginosa isolates in hospitals in Vietnam. BMC infectious diseases. 13(1). 251. 10 Villegas MV, Hartstein AI (2003). Acinetobacter Outbreaks. 1977‐2000. Infection control and hospital epidemiology. 24(4). 284‐ 295. KẾT LUẬN Acinetobacter baumannii kháng cao với hầu hết các kháng sinh, kháng trung bình với tetracycline và β‐lactam/sulbactam và nhạy 100% lipopeptide. Sau khi hồn thành nghiên cứu này, có bằng chứng rõ ràng rằng các nhóm gene blaOXA (carbapenemase lớp D) là một vấn đề trong các chủng Acinetobacter baumannii phân lập từ lâm sàng tại bệnh viện Đa khoa Thống Nhất, Đồng Nai. Các nhóm blaOXA nằm trên plasmid (OXA‐23 và có thể là OXA‐58) có tỷ lệ khác biệt so với các nghiên cứu khác trên thế giới. Kỹ thuật multiplex PCR‐ELISA được chứng minh là kỹ thuật nhanh và chính xác để kiểm tra nhạy cảm kháng sinh. Tuy nhiên, vẫn còn nhiều việc phải cải tiến để có thể áp dụng kỹ thuật multiplex PCR như là 1 chọn lựa thay thế cho các xét nghiệm nhạy cảm kháng sinh hiện nay. KIẾN NGHỊ Ngày nhận bài báo: 10/5/2014 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 16/6/2014 Ngày bài báo được đăng: 14/11/2014 Khả năng Acinetobacter baumannii tăng trưởng trong màng biofilms đặt ra một mối đe doạ liên 462 Chuyên Đề Y Tế Công Cộng ... chiếm 0,03%). Hình 2: Phương pháp multiplex PCR – ELISA phát hiện Oxacillinase ở A. baumannii. Bảng 2: MIC Meropenem và Imipenem ở 66 Acinetobacter baumannii thử nghiệm Số chủng A baumannii 1 1 60... tiến hành PCR. Các gene mã hóa oxacillinase được xác định bằng cách sử dụng kỹ thuật multiplex PCR với các mồi đặc hiệu cho blaOXA 23, blaOXA 40, blaOXA 51, blaOXA 58 (OXA‐23F: ... việc sử dụng các phương pháp nhanh chóng, hiệu quả và đáng tin cậy. Multiplex PCR – ELISA là một phương pháp chẩn đoán mới để trực tiếp phát hiện các gene mã hóa