Phát hiện các gene blaoxa ở acinetobacter baumannii bằng phương pháp multiplex PCR‐ELISA

Mục tiêu nghiên cứu của đề tài này nhằm phát hiện các gene blaOXA lưu hành trong các chủng AB ở bệnh viện Đa khoa Thống Nhất, Đồng Nai năm 2013. Mời các bạn cùng tham khảo bài viết để nắm rõ nội dung chi tiết của đề tài nghiên cứu này.

Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 6 * 2014   PHÁT HIỆN CÁC GENE BLAOXA Ở ACINETOBACTER BAUMANNII  BẰNG PHƯƠNG PHÁP MULTIPLEX PCR‐ELISA  Nguyễn Sĩ Tuấn*, Lưu Trần Linh Đa*, Lê Duy Nhất*, Hứa Mỹ Ngọc*, Nguyễn Ngọc Thanh*,   Phạm Thị Thanh Thủy*, Phạm Văn Dũng*, Nguyễn Thúy Hương**  TĨM TẮT  Đặt  vấn  đề:  Acinetobacter baumannii (AB) kháng đa kháng sinh bằng nhiều cơ chế, bao gồm giảm tính  thấm  qua  màng,  biểu  hiện  quá  mức  bơm  thải  kháng  sinh  và  sản  xuất  carbapenemase.  Năm  2013,  AB  kháng  carbapenem bùng phát mạnh ở nhiều bệnh viện. Tính kháng này có thể do sự sản xuất các carbapenemase, trong  đó các oxacillinase thủy phân carbapenem thuộc lớp D (OXA‐23, OXA‐40, OXA‐58 và OXA‐51) được cơng bố  phổ biến nhất ở Châu Á – Thái Bình Dương.   Mục tiêu: Phát hiện các gene blaOXA lưu hành trong các chủng AB ở bệnh viện Đa khoa Thống Nhất, Đồng  Nai năm 2013.  Phương  pháp  nghiên  cứu:  Multiplex PCR – ELISA được tiến hành để phát hiện các blaOXA mã hố các  oxacillinase thuỷ phân carbapenem ở AB và sau đó, kết quả được kiểm tra bằng multiplex PCR truyền thống.  Kết  quả:  Trong 66 chủng AB thử nghiệm, có 83,3% kiểu gene kháng carbapenem là blaOXA‐23 và 16,67%  blaOXA‐58. Có tới 97% các chủng AB mang gene blaOXA‐51.  Kết luận: Cần tiến hành cách ly các bệnh nhân nhiễm trùng do AB có lưu hành các blaOXA, đặc biệt là các  gene nằm trên plasmid, nhằm ngăn ngừa sự phát tán gene kháng thuốc.  Từ khóa: Acinetobacter baumannii, carbapenem, carbapenemase,blaOXA‐23, blaOXA‐51, blaOXA‐58.  ABSTRACT  DETECT BlaOXA GENES OF ACINETOBACTER BAUMANNII BY MULTIPLEX PCR – ELISA  METHOD  Nguyen Si Tuan, Luu Tran Linh Da, Le Duy Nhat, Hua My Ngoc, Nguyen Ngoc Thanh,   Pham Thi Thanh Thuy, Pham Van Dung, Nguyen Thuy Huong   * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 ‐ Supplement of No 6‐ 2014: 458 – 462  Background:  Acinetobacter  baumannii  (AB)  multiple  antibiotic  resistance  by  various  mechanisms,  including decreased membrane permeability, antibiotic pump overexpression and carbapenemase production. In  2013, outbreak of carbapenem which are resistant to AB occured in many hospitals. This resistance may be due to  the production of carbapenemase, in which the hydrolysis oxacillinase carbapenem class D (OXA ‐ 23, OXA ‐ 40,  OXA ‐ 58 and OXA ‐ 51) was documented most in Asian Pacific Ocean.  Objectives: To detect the gene blaOXA in AB strains accuired at Thong Nha‐ Dong Nai General Hospital in 2013.  Methods: Multiplex PCR ‐ ELISA was performed to detect blaOXA encoded oxacillinase in AB and then, the  results were confirmed by multiplex PCR.  Result: In 66 AB strains tested, 83.3% genotypes resisted to carbapenem was blaOXA‐23 and 16.67% blaOXA‐58.  Up to 97% of the AB strain was carrying blaOXA‐51 gene.  Conclusion: It is necessary to isolate patients infected AB carrying the blaOXA, especially the genes located on  plasmid in order to prevent the spread of resistance genes.  **ĐH Bách Khoa TP.HCM – Đại học Quốc gia TP.HCM  Bệnh viện Đa khoa Thống Nhất, Đồng Nai   Tác giả liên lạc: Ths. Nguyễn Sĩ Tuấn   ĐT: 0919563 323  Email: nsituan@gmail.com  * 458 Chun Đề Y Tế Cơng Cộng  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 6 * 2014  Nghiên cứu Y học   Key words: Acinetobacter baumannii, carbapenem, carbapenemase,blaOXA‐23, blaOXA‐51, blaOXA‐58.  ĐẶT VẤN ĐỀ  Trong suốt thế kỷ trước, sự bùng phát các vụ  dịch Acinetobacter baumannii đa kháng thuốc gây  nhiễm khuẩn bệnh viện, đặc biệt ở những bệnh  nhân  suy  giảm  miễn  dịch  trong  các  đơn  vị  Hồi  sức Cấp cứu (ICU), đã được ghi nhận ở khắp các  vùng  địa  lý  khác  nhau  trên  toàn  thế  giới(1,10).  Những  nhiễm  trùng  này  bao  gồm  nhiễm  trùng  huyết, nhiễm trùng vết mổ, viêm màng não thứ  cấp, nhiễm trùng đường niệu và viêm phổi liên  quan  thở  máy(1,10).  Tuy  nhiên,  sự  phát  triển  gần  đây  của  các  chủng  Acinetobacter  baumannii  sản  xuất  Carbapenemase  lớp  D  (chủ  yếu  là  oxacillinase),  là  mối  quan  tâm  lớn  nhất  đối  với  cộng  đồng  khoa  học  quốc  tế,  kể  từ  khi  Carbapenem  được  sử  dụng  thường  xuyên  để  điều trị nhiễm các chủng Acinetobacter baumannii  đa kháng kháng sinh(2,8). Vì những lý do này, đề  nghị cần thiết phải có một chương trình giám sát  trong đó bao gồm theo dõi sự kháng kháng sinh  và các nhiễm trùng mắc phải tại ICU (là gì?), với  việc  sử  dụng  các  phương  pháp  nhanh  chóng,  hiệu  quả  và  đáng  tin  cậy.  Multiplex  PCR  –  ELISA  là  một  phương  pháp  chẩn  đoán  mới  để  trực  tiếp  phát  hiện  các  gene  mã  hóa  OXA  –  carbapenemase trong các bệnh phẩm lâm sàng.   Mục tiêu nghiên cứu  Xác định tỷ lệ các nhóm gene blaOXA lưu hành  ở  Acinetobacter baumannii  tại  bệnh  viện  Đa khoa  Thống Nhất, Đồng Nai năm 2013 bằng multiplex  PCR‐ELISA.  Xác  định  lại  kết  quả  bằng  phương  pháp  multiplex PCR.  ĐỐI TƯỢNG ‐ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU  Bệnh phẩm lâm sàng và chủng vi khuẩn  66 mẫu bệnh phẩm, bao gồm: 4 ca cấy máu  dương  tính,  6  ca  cấy  mủ  vết  thương,  2  ca  cấy  nước tiểu và 54 ca cấy đàm, được thu thập trong  năm  2013  tại  Bệnh  viện  Đa  khoa  Thống  Nhất,  Đồng  Nai.  Các  bệnh  phẩm  được  phân  lập  trên  môi trường MacConkey (MC). Định danh được  Chuyên Đề Y Tế Công Cộng  tiến  hành  bằng  bộ  định  danh  API  20NE,  Biomerieux, Pháp.  Kiểm tra nhạy cảm kháng sinh  Các  chủng  Acinetobacter  baumannii  thuần  được  thử  nghiệm  nhạy  cảm  kháng  sinh  bằng  phương  pháp  Kirby‐Bauer  với  đĩa  kháng  sinh  của  4  nhóm:  aminoglycoside,  β‐lactam  (Imipenem  và  Meropenem),  quinolon,  và  polymycine  (colistin)  của  hãng  Biomerieux,  Pháp.  Các  chủng  kháng  carbapenem  được  tiến  hành thử nghiệm nồng độ ức chế tối thiểu (MIC)  của  imipenem  và  meropenem  bằng  phương  pháp E‐TEST, Biomerieux, Pháp.  Tách chiết DNA và blaOXA PCR  Các khuẩn lạc đơn – thuần khiết (một khuẩn  lạc) được huyền phù trong 500 μl multiplex lysis  buffer.  Lysis  buffer  được  ủ  10  phút  trong  thermoblock ở 990C.Sau đó ly tâm 1000 vòng/ 2  phút,  hút  5  μl  dịch  nổi  để  tiến  hành  PCR.  Các  gene  mã  hóa  oxacillinase  được  xác  định  bằng  cách  sử  dụng  kỹ  thuật  multiplex  PCR  với  các  mồi đặc hiệu cho blaOXA‐23, blaOXA‐40, blaOXA‐51, blaOXA‐ 58  (OXA‐23F:  5’GATCGGATTGGAGAACCAGA3’;  OXA‐23R:  5’–ATTTCTGACCGCATTTCCAT–3’;  OXA‐40F:  5’– GGAATTCCATGAAAAAATTTATACTTCC–3’;  OXA‐40R:  5’– CIIIATCCCGTTAAATGATTCCAAGAIIIICTA GCG  –  3’;  OXA‐51F:  5’  –  TAATGCTTTGATCGGCCTTG–3’;  OXA‐51R:  5’–TGGATTGCACTTCATCTTGG–3’;  OXA‐58F:  5’–AAGTATTGGGGCTTGTGCTG–3’;  OXA‐ 58R: 5’–CCCCTCTGCGCTCTACATAC–3’). Mỗi  phản ứng multiplex PCR gồm 5 μl dịch nổi/5 μl  chứng âm, 1 μl dung dịch Nucleotide, 2 μl dung  dịch  mồi,  5  μl  PCR  buffer  10x,  0.2  μl  DNA  polymerase 1U, thêm H2O cất 2 lần cho đủ 50 μl.  PCR – ELISA  Sản  phẩm  PCR  được  lai  đặc  hiệu  với  các  oligonucleotide trong hệ thống ELISA.  459 Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 6 * 2014     Hình 1. Lưu đồ PCR‐ELISA phát hiện oxacillinase ở Acinetobacter baumannii  phân  lập  từ  các  bệnh  phẩm  đàm,  mủ,  máu  và  Thống kê, phân tích số liệu  nước  tiểu  trong  số  2.288  mẫu  cấy  dương  tính.  Nghiên  cứu  được  tiến  hành  theo  phương  Chọn  ngẫu  nhiên  66  chủng  để  tiến  hành  thử  pháp  cắt  ngang  mô  tả,  mẫu  không  xác  suất  và  nghiệm, bao gồm: 4 chủng từ cấy máu, 2 chủng  thuận tiện. Số liệu được nhập bằng Epi‐data 3.1  từ  cấy  catheter  thông  tiểu,  6  chủng  từ  mủ  vết  và xử lý bằng phần mềm Stata 11.0.  thương hậu phẫu và 54 chủng từ đàm.  KẾT QUẢ   Trong nghiên cứu trước trong năm 2013, 369  chủng  Acinetobacter  baumannii  (16,13%)  được  Bảng 1: Tỷ lệ đề kháng kháng sinh của 66 chủng A. Baumannii thử nghiệm  Nhóm Amino glycoside Fluroquinolon Tetracycline Cephem β-lactam/ức chế β-lactamase Carbapenem Lipopeptide Ức chế biến dưỡng Folate 460 Kháng sinh Amikacine Gentamycine 10µg Netilmycine Ciprofloxacine Doxycyline Cefatadizime Cefotaxime Cefpodoxim Cefuroxim Cefepime Ampicillin/Sulbactam Cephaperazone/Sulbactam Piperacillin/ tazobactam Ticarcillin/ clavulanic acid Imipenem Meropenem Colistin Bactrim Kháng (%) 81,13 95 80,39 94,12 48,72 89,89 100 100 98,04 88,89 42,86 48,28 92,59 89,19 90,2 92,73 86,36 Nhạy (%) 11,32 19,61 5,88 51,28 10,11 0 1,96 11,11 42,86 31,03 7,41 5,41 9,8 5,45 100 9,09 Trung gian (%) 7,55 0 0 0 0 14,29 20,69 5,41 0 4,55 Chun Đề Y Tế Cơng Cộng  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 6 * 2014  Nghiên cứu Y học   Từ  bảng  1  thấy,  đa  số  A.  baumannii  thử  nghiệm  kháng  cao  với  hầu  hết  các  kháng  sinh,  kháng  trung  bình  với  tetracycline  và  β‐ lactam/sulbactam  và  nhạy  100%  lipopeptide  (colistin).  599 bp) và blaOXA‐51 (kích thước 353 bp) được phát  hiện  khi  tiến  hành  điện  di  sản  phẩm  DNA  khuếch  đại  trên  agarose  gel.  Nhóm  đầu  tiên  trong  các  chủng  thử  nghiệm  dương  tính  với  cả  OXA‐51  và  OXA‐23  (83,3%).  Nhóm  thứ  hai  dương tính với cả OXA‐51 và OXA‐58 (16,67%).  Nhóm thứ ba, chỉ dương tính với OXA‐58 (2 ca,  chiếm 0,03%).      Hình 2: Phương pháp multiplex PCR – ELISA phát  hiện Oxacillinase ở A. baumannii.  Bảng 2: MIC Meropenem và Imipenem ở 66  Acinetobacter baumannii thử nghiệm  Số chủng A baumannii 1 1 60 MIC Meropenem 0,125 0,38 0,75 14 >32 MIC Imipenem 0,25 0,38 0,5 0,19 >32 Từ bảng 2 cho thấy, đa số các chủng trong lô  thử  nghiệm  (>  92%)  có  MIC  (carbapenem)  >14  μg/ml. Đây là các chủng Acinetobacter baumannii  có kiểu hình kháng carbapenem bằng E‐TEST.  Bảng 3: Các nhóm gene blaOXA trong số 66 chủng A.  baumannii nghiên cứu  PCR-ELISA A baumannii blaOXA-23 blaOXA-40 blaOXA-51 blaOXA-58 MÁU 4 BỆNH PHẨM NƯỚC TIỂU MỦ 6 0 ĐÀM 54 45 50 Từ hình 3 và bảng 3 cho thấy, các nhóm gene  blaOXA‐23(kích  thước  501  bp),  blaOXA‐58  (kích  thước  Chun Đề Y Tế Cơng Cộng  Hình 3: Kết quả được thiết lập sau khi multiplex PCR  được tiến hành, sử dụng agarose gel 2% để phát hiện  các gene blaOXA trong các Acinetobacter baumannii.  BlaOXA‐51  là  một  gene  nội  tại  của  A.  Baumannii(6). Đây là gene nằm trên nhiễm sắc thể,  cần  thiết  để  điều  hoà  vùng  thượng  nguồn  bởi  ISAba1 để kích thích tính kháng carbapenem. Tỷ lệ  blaOXA‐51  trong  các  chủng  Acinetobacter baumannii  phân  lập  từ  lâm  sàng  trong  thử  nghiệm  này  là  gần  97%.  Số  liệu  này  thấp  hơn  các  phát  hiện  trong  nghiên  cứu  được  tiến  hành  ở  Iran  bởi  Feizabadi  và  cộng  sự  (2008),  theo  đó  có  100%  chủng có gene blaOXA‐51 (3).  Tỷ lệ blaOXA‐23 ở các chủng AB phân lập từ lâm  sàng  trong  nghiên  cứu  này  là  83,3%.  Phát  hiện  này cao hơn nhiều so tỷ lệ blaOXA‐23 chung là 66,5%  phát  hiện  ở  các  quốc  gia  Châu  Á‐Thái  Bình  Dương  (Ấn  Độ,  Trung  Quốc,  Thái  Lan,  Singapore,  Hồng  Kông  và  Hàn  Quốc;  khơng  có  Việt  Nam)(5).  Tuy  nhiên,  dựa  trên  nghiên  cứu  khác  được  tiến  hành  bởi  Feizabadi  và  cộng  sự  (2008), cho thấy có 36,5% các chủng Acinetobacter  baumannii  phân  lập  từ  lâm  sàng  có  tỷ  lệ  mang  gene  blaOXA‐23  khác  biệt  nhau  ở  trên  thế  giới(3).  BlaOXA‐23  là  một  gene  đề  kháng  carbapenem  mắc  phải  nằm  trên  plasmid  của  Acinetobacter  baumannii,  vì  thế  có  một  tỷ  lệ  khác  nhau  được  461 Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 6 * 2014   phát  hiện  so  với  gene  blaOXA‐51  là  gene  kháng  carbapenem  xuất  hiện  tự  nhiên  nằm  trên  nhiễm  sắc thể của AB(6,7). Tỷ lệ blaOXA‐58 trong các AB phân  lập  từ  lâm  sàng  trong  nghiên  cứu  này  chiếm  16,67%.  Số  liệu  này  cao  hơn  tỷ  lệ  15%  blaOXA‐58  ở  AB trong nghiên cứu của Feizabadi và cộng sự tại  Iran  năm  2008(3).  BlaOXA‐58  là  gene  vừa  nằm  trên  nhiễm sắc thể, vừa nằm trên plasmid nên các tỷ lệ  phân lập trên thế giới có sự khác biệt(7).   Các kết quả này cũng phù hợp với các tổng  kết  gần  đây  của  Tada  và  cộng  sự  công  bố  năm  2013 tại chính 2 bệnh viện Bạch Mai và Chợ Rẫy,  theo đó trong cơ chế tiết enzyme phá hủy kháng  sinh  carbapenem,  các  OXA‐carbapenemase  lớp  D (Ambler carbapenemase lớp D) phổ biến trên  tồn  thế  giới  và  khu  vực  Châu  á  –  Thái  Bình  Dương lưu hành chủ yếu các chủng Acinetobacter  baumannii mang gene mã hóa nhóm OXA‐23(9).  quan  tới  khả  năng  lây  lan  của  chủng  vi  khuẩn  này, theo đó phát tán các gene kháng thuốc, cần  được điều tra nghiên cứu trong tương lai.  TÀI LIỆU THAM KHẢO  Bergogne‐Berezin  E.,  Towner  KJ.  (1996).  Acinetobacter  spp.  as  nosocomial  pathogens:  microbiological,  clinical,  and  epidemiological features. Clinical microbiology Reviews. 9(2) 148.  Brown S, Amyes SGB (2005). The sequences of seven class D  β‐lactamases  isolated  from  carbapenem‐resistant  Acinetobacter  baumannii  from  four  continents.  Clinical  Microbiology And Infection. 11(4), 326‐329.  Feizabadi  MM,  Fathollahzadeh  B,  Taherikalani  M  (2008).  Antimicrobial  susceptibility  patterns  and  distribution  of  blaOXA  genes  among  Acinetobacter  spp.  isolated  from  patients at Tehran hospitals. J Infect Dis. 61(4). 274‐8.  Lain  A.  Gustavo  MC.  Saruar  B.  Anton  YP.  (2013).  Carbapenem  resistance  in  Acinetobacter  baumannii.  Expert  Rev Anti Infect Ther. 11(4). 395 – 409.  Mendes RE, Bell JM, Turnidge JD, Castanheira M, Jones RN  (2009). Emergence and widespread dissemination of OXA‐23.  ‐24/40 and –58  carbapenemases among  Acinetobacter  spp  in  Asia‐Pacific  nations:  report  from  the  SENTRY  Surveillance  Program. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 63. 55‐59.  Merkier AK, Centrón D (2006). Bla‐OXA‐51‐type β‐lactamase  genes  are  ubiquitous  and  vary  within  a  strain  in  Acinetobacter baumannii. International Journal Of Antimicrobial  Agents. 28(2). 110‐113.  Perez  F,  Hujer  AM,  Hujer  KM,  Decker  BK,  Rather  PN,  Bonomo  RA,  (2007).  Global  challenge  of  multidrug‐resistant  Acinetobacter  baumannii.  Antimicrobial  agents  and  chemotherapy. 51(10). 3471‐3484.  Poirel  L,  Nordmann  P  (2006).  Carbapenem  resistance  in  Acinetobacter  baumannii:  mechanisms  and  epidemiology.  Clinical microbiology and infection. 12(9). 826‐836.  Tada T, Miyoshi‐Akiyama T, Kato Y (2013). Emergence of 16S  rRNA  methylase‐producing  Acinetobacter  baumannii  and  Pseudomonas  aeruginosa  isolates  in  hospitals  in  Vietnam.  BMC infectious diseases. 13(1). 251.  10 Villegas  MV,  Hartstein  AI  (2003).  Acinetobacter  Outbreaks.  1977‐2000. Infection control and hospital epidemiology. 24(4). 284‐ 295.  KẾT LUẬN  Acinetobacter  baumannii  kháng  cao  với  hầu  hết  các  kháng  sinh,  kháng  trung  bình  với  tetracycline  và  β‐lactam/sulbactam  và  nhạy  100% lipopeptide.   Sau khi hồn thành nghiên cứu này, có bằng  chứng  rõ  ràng  rằng  các  nhóm  gene  blaOXA  (carbapenemase lớp D) là một vấn đề trong các  chủng  Acinetobacter  baumannii  phân  lập  từ  lâm  sàng  tại  bệnh  viện  Đa  khoa  Thống  Nhất,  Đồng  Nai. Các nhóm blaOXA nằm trên plasmid (OXA‐23  và có thể là OXA‐58) có tỷ lệ khác biệt so với các  nghiên cứu khác trên thế giới.  Kỹ thuật multiplex PCR‐ELISA được chứng  minh là kỹ thuật nhanh và chính xác để kiểm tra  nhạy cảm kháng sinh. Tuy nhiên, vẫn còn nhiều  việc  phải  cải  tiến  để  có  thể  áp  dụng  kỹ  thuật  multiplex  PCR  như  là  1  chọn  lựa  thay  thế  cho  các xét nghiệm nhạy cảm kháng sinh hiện nay.  KIẾN NGHỊ     Ngày nhận bài báo:       10/5/2014  Ngày phản biện nhận xét bài báo:   16/6/2014  Ngày bài báo được đăng:       14/11/2014  Khả năng Acinetobacter baumannii tăng trưởng  trong màng biofilms đặt ra một mối đe doạ liên      462   Chuyên Đề Y Tế Công Cộng  ... chiếm 0,03%).      Hình 2: Phương pháp multiplex PCR – ELISA phát hiện Oxacillinase ở A. baumannii.   Bảng 2: MIC Meropenem và Imipenem ở 66  Acinetobacter baumannii thử nghiệm  Số chủng A baumannii 1 1 60... tiến  hành  PCR.  Các gene mã  hóa  oxacillinase  được  xác  định  bằng cách  sử  dụng  kỹ  thuật  multiplex PCR  với  các mồi đặc hiệu cho blaOXA 23, blaOXA 40, blaOXA 51, blaOXA 58  (OXA‐23F: ... việc  sử  dụng  các phương pháp nhanh  chóng,  hiệu  quả  và  đáng  tin  cậy.  Multiplex PCR  –  ELISA  là  một  phương pháp chẩn  đoán  mới  để  trực  tiếp  phát hiện các gene mã  hóa