Tài liệu PHÂN BIỆT CÁC LOẠI THỊT HEO, BÕ, CỪU BẰNG PHƯƠNG PHÁP MULTIPLEX PCR ppt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN BIỆT CÁC LOẠI THỊT HEO, BÕ, CỪU BẰNG PHƢƠNG PHÁP MULTIPLEX PCR Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Khóa: 2003 – 2007 Sinh viên thực hiện: TRỊNH THỊ THANH HUYỀN Thành phố Hồ Chí Minh 09/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN BIỆT CÁC LOẠI THỊT HEO, BÕ, CỪU BẰNG PHƢƠNG PHÁP MULTIPLEX PCR Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: PGS. TS. NGUYỄN NGỌC TUÂN TRỊNH THỊ THANH HUYỀN KS. LƢƠNG QUÝ PHƢƠNG Thành phố Hồ Chí Minh 09/2007 iii LỜI CẢM ƠN Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến: Thầy PGS.TS. Nguyễn Ngọc Tuân, Giảng viên khoa Chăn nuôi thú y, trƣờng Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Cô PGS.TS Trần Thị Dân, Giảng viên khoa Chăn nuôi thú y, trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh. KS. Lƣơng Quý Phƣơng, Trung tâm Phân tích thí nghiệm hóa sinh trƣờng Đại Học Nông Lâm Đã tận tình hƣớng dẫn, ủng hộ và giúp đỡ tôi thực hiện và hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp. Xin chân thành cảm ơn: - Ban Giám Hiệu trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, Ban Chủ Nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt những kiến thức quý báu cho tôi trong suốt thời gian học tại trƣờng. - Ban giám đốc, thầy cô và các cán bộ công chức Trung tâm phân tích thí nghiệm hóa sinh trƣờng Đại Học Nông Lâm, đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực tập và hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp . - Thầy Đinh Xuân Phát đã nhiệt tình giúp đỡ, động viên tôi trong quá trình học tập cũng nhƣ thực hiện khóa luận. Tập thể các bạn sinh viên lớp Công nghệ sinh học 29 - Trƣờng Đại học Nông Lâm TP. HCM đã luôn bên tôi những lúc khó khăn, cùng tôi chia sẻ vui buồn trong quá trình học và quá trình thực hiện khóa luận. Và đặc biệt con xin thành kính ghi ơn Cha Mẹ đã sinh thành, dƣỡng dục con nên ngƣời, để con đƣợc nhƣ ngày hôm nay. Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 09 năm 2007. Sinh viên: Trịnh Thị Thanh Huyền. TÓM TẮT KHÓA LUẬN TRỊNH THỊ THANH HUYỀN, thực hiện khóa luận “Phân biệt ba loại thịt heo, bò cừu bằng phƣơng pháp multiplex PCR”. Hƣớng dẫn khoa học: PGS. TS. Nguyễn Ngọc Tuân KS. Lƣơng Quý Phƣơng Thời gian thực hiện từ tháng 2/2007 đến tháng 8/2007, tại Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hóa – Sinh, trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Để tạo tiền đề trong việc giải quyết vấn đề gian lận thƣơng mại đối với sản phẩm thịt tƣơi và thịt chế biến, bƣớc đầu chúng tôi tiến hành thiết lập quy trình phân biệt ba loại thịt heo, bò, cừu bằng phƣơng pháp multiplex PCR. Kết quả đạt đƣợc nhƣ sau: 1) Tách chiết DNA từ thịt tƣơi và thịt đã xử lý nhiệt ở nhiệt độ: 80 0 C/15’, 120 0 C/15’, 120 0 C/30’, 130 0 C/15’ với tỷ số OD trung bình là 2,0 (thịt tƣơi), 1,9 (thịt xử lý nhiệt)- tinh sạch, đạt tiêu chuẩn. 2) Sau khi tiến hành tối ƣu hóa phản ứng multiplex PCR bằng việc thử nghiệm nhiều quy trình (gồm quy trình của Matsunaga và ctv (1998) và các thử nghiệm điều chỉnh về thành phần hóa chất, nhiệt độ và thời gian của chu trình nhiệt, nồng độ mồi trong phản ứng), chúng tôi đã xác định đƣợc quy trình thích hợp, trong đó nồng độ MgCl 2 2mM, lƣợng FSIM: RP: RB: RS lần lƣợt là 0,4: 0,83: 0,24: 0,17 M, nhiệt độ và thời gian của chu kỳ nhiệt ở giai đoạn lặp lại là: biến tính (94 0 C/1phút), bắt cặp (54 0 C/45giây), kéo dài (72 0 C/1phút). 3) Sử dụng quy trình nultiplex PCR vừa tìm đƣợc đối với các hỗn hợp DNA của cả ba loài trong đó nồng độ DNA bò, cừu giảm dần và đã xác định đƣợc nồng độ của thịt cừu, bò mà quy trình này còn phát hiện đƣợc là 1ng/ l. 4) Chúng tôi tiếp tục thực hiện quy trình trên đối với các hỗn hợp thịt đã xử lý nhiệt ở các nhiệt độ khác nhau và rút ra kết luận là ở các nhiêt độ biến tính 80 0 C/15’, 120 0 C/15’, 120 0 C/30’, 130 0 C/15’ vẫn còn phân biệt đƣợc ba loài trên. [...]... hành xây dựng quy trình phân biệt ba loại thịt heo, bò, cừu trong hỗn hợp thịt chế biến bằng phƣơng pháp multiplex PCR 1.2 Mục đích Bƣớc đầu xây dựng quy trình multiplex PCR phát hiện và phân biệt thịt heo, bò, cừu Ứng dụng quy trình để phát hiện và phân biệt các hỗn hợp thịt đã xử lý nhiệt và bột thịt 1.3 Yêu cầu Nắm vững qui trình tách chiết DNA Tối ƣu hóa quy trình multiplex PCR và ứng dụng quy trình... dụng phƣơng pháp multiplex PCR để khuếch đại vùng gen trên mtDNA Tác giả thực hiện phản ứng PCR với nhiều nồng độ DNA khác nhau Sau đó dựa sự có hay không các sản phẩm PCR qua điện di để xác định nồng độ tối thiểu của DNA để phản ứng PCR còn phát hiện đƣợc 2.4 Các phƣơng pháp phân biệt các loại thịt 2.4.1 Phƣơng pháp quan sát dƣới kính hiển vi quang học Để phân biệt các loài trong bột xƣơng thịt ngƣời... Phƣơng pháp tiến hành 3.4.1 Lấy và bảo quản mẫu Mua 500 g mỗi loại thịt bỏ vào túi nilon sạch kích thƣớc 5 x 10 cm, dán nhãn cho mỗi loại thịt, trữ trong thùng đá, đem về phòng thí nghiệm, trữ ở –700C 3.4.2 Phối hợp các loại thịt để tạo hỗn hợp thịt và xử lý nhiệt Mỗi loại thịt, lấy khoảng 150 g đem nghiền nhuyễn bằng máy nghiền mẫu Sau đó đem cân và trộn các loại thịt với tỉ lệ thịt heo, bò, cừu giảm... hiện loài trong thịt chế biến bằng phƣơng pháp multiplex PCR Hơn một thập kỉ qua, sau khi ra đời phƣơng pháp PCR nói chung và multiplex PCR nói riêng đã đƣợc sử dụng rộng rãi để phát hiện hay phân biệt DNA các sinh vật khác nhau từ nhiều nguồn mẫu Vì vậy phƣơng pháp multiplex PCR cũng đã đƣợc nhiều nhà nghiên cứu sử dụng trong việc phân biệt loài động vật trong thịt chế biến Năm 1997, Wayne và ctv đã... sức khỏe cho ngƣời tiêu dùng Có nhiều cách để xác định nguồn gốc thịt: dùng kính hiển vi quang học, ELISA, điện di 2 chiều, protein array, multiplex PCR Bốn phƣơng pháp đầu hoặc chậm hoặc không thể ứng dụng cho các sản phẩm thịt đã xử lý ở nhiệt độ cao Còn phƣơng pháp multiplex PCR là một phƣơng pháp nhanh, đặc hiệu, đơn giản, thích hợp để phân biệt các loại thịt đã xử lý nhiệt Vì vậy để tạo tiền... (các mẫu thức ăn chó đƣợc ghi trên nhãn là chỉ gồm thịt bò và heo) 17 Chƣơng 3 NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Nội dung thực hiện (1) Tách chiết DNA từ thịt tƣơi và thịt xử lý nhiệt ở: 800C/15’, 1200C/15’, 1200C/30’, 1300C/15’ (2) Thực hiện phản ứng single PCR (s -PCR) đối với DNA từ ba loại thịt tƣơi (heo, bò, cừu) để làm cơ sở cho phản ứng multiplex PCR (m -PCR) (3) Tối ƣu hóa quy trình m -PCR. .. quy trình m -PCR để xác định loại thịt trong hỗn hợp thịt tƣơi xay nhuyễn (4)Thực hiện phản ứng s -PCR đối với DNA từ thịt xử lý ở nhiệt độ: 800C/15’, 1200C/15’, 1200C/30’, 1300C/15’ (5) Thực hiện phản ứng m -PCR để xác định ba loại thịt heo, bò, cừu Thực hiện phản ứng m -PCR đối với hỗn hợp DNA heo, bò, cừu có nồng độ của DNA bò, cừu giảm dần để xác định ở nồng độ nào phản ứng m -PCR vẫn còn phát hiện đƣợc... phƣơng pháp PCR Phƣơng pháp này tỏ ra hữu dụng đối với cả thịt tƣơi và hỗn hợp thịt chế biến bao gồm thịt phơi khô và thịt nấu chín từ bò, cừu, gà Năm 2004, Myers và ctv cũng đã dựa vào đoạn mtDNA để thiết lập phản ứng multiplex PCR nhằm phát hiện thịt các loài bò, heo, cừu, dê, ngựa trong thức ăn chó Giới hạn DNA để phát hiện là 1 g/kg Kết quả cho thấy chỉ có 27 mẫu trong tổng số 31 mẫu là chứa thịt. .. xuất và tiêu thụ sản phẩm thịt tƣơi, thịt chế biến vẫn diễn ra cùng với các dịch bệnh nguy hiểm liên tiếp hoành hành thì việc đảm bảo tính trung thực và an toàn của các sản phẩm này là rất cấp thiết Điều này đặt ra cho các nhà quản lý và các nhà nghiên cứu phải tìm ra phƣơng pháp phát hiện, phân biệt nhanh chóng, chính xác các loại thịt trong sản 1 phẩm thịt tƣơi cũng nhƣ thịt chế biến để ngăn chặn... lƣợng vệ sinh an toàn thực phẩm trong đó có các sản phẩm thịt tƣơi, thịt chế biến đã và đang là mối quan tâm của xã hội Thịt chế biến thƣờng có nguồn gốc từ một loại hay nhiều loại thịt khác nhau Do sự đa dạng về chất lƣợng, giá cả của các loại thịt đã gây ra vấn đề gian lận trong thƣơng mại (đối với cả thịt tƣơi và thịt chế biến) Đã có rất nhiều sản phẩm thịt trên thị trƣờng ghi thành phần trong công . KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN BIỆT CÁC LOẠI THỊT HEO, BÕ, CỪU BẰNG PHƢƠNG PHÁP MULTIPLEX PCR Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH. KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN BIỆT CÁC LOẠI THỊT HEO, BÕ, CỪU BẰNG PHƢƠNG PHÁP MULTIPLEX PCR Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh