Phân biệt ba loại thịt heo, bò cừu bằng phương pháp multiplex PCR

Phân biệt ba loại thịt heo, bò cừu bằng phương pháp multiplex PCR

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ******  ****** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SỬ DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ MICROSATELLITE ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÁC DÕNG KEO LÁ TRÀM (Acacia auriculiformis) Chuyên ngành: Cơng Nghệ Sinh Học Niên khóa: 2003-2007 Sinh viên:Trần Thị Thanh Hƣơng Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ******  ****** SỬ DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ MICROSATELLITE ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÁC DÕNG KEO LÁ TRÀM (Acacia auriculiformis) Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS VƢƠNG ĐÌNH TUẤN TRẦN THỊ THANH HƢƠNG Niên khóa: 2003-2007 Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2007 LỜI CẢM ƠN Con xin cảm ơn Ba Má anh chị gia đình ni dạy đến ngày khôn lớn cho ăn học thành tài  Chân thành cảm ơn! Trƣờng Đại Học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh Bộ Mơn Cơng Nghệ Sinh Học Trƣờng Đại Học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh Phân viện nghiên cứu khoa học kĩ thuật lâm nghiệp Nam Trung Tâm Công nghệ sinh học TP Hồ Chí Minh Đã tạo điều kiện cho tơi học tập hoàn thành luận án tốt nghiệp tiến độ  Chân thành cảm ơn! Tất Thầy Cơ tận tình bảo, truyền đạt kiến thức cho lớp thời gian học tập trƣờng Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh  Chân thành cảm ơn! TS.Vƣơng Đình Tuấn TS Nguyễn Quốc Bình Đã ln tận tình giúp đỡ, hƣớng dẫn, động viên tạo điều kiện cho suốt trình làm đề tài  Chân thành cảm ơn! Chị Ngô Huỳnh Phƣơng Thảo tất anh, chị bạn lớp Công nghệ sinh học 29, không ngừng động viên giúp đỡ suốt trình thực hiên đề tài Xin chân thành tri ân! Sv: TRẦN THỊ THANH HƢƠNG TÓM TẮT TRẦN THỊ THANH HƢƠNG, Đại Học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh Tháng 8/2007 “SỬ DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ MICROSATELLITE ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÁC DÕNG KEO LÁ TRÀM (Acacia auriculiformis)” Hƣớng dẫn khoa học: TS.Vƣơng Đình Tuấn  Thời gian nghiên cứu Từ tháng 3/2007 đến 8/2007  Địa điểm nghiên cứu Phân viện nghiên cứu khoa học kĩ thuật lâm nghiệp Nam Bộ Trung tâm Cơng nghệ sinh học TP Hồ Chí Minh  Mục đích nghiên cứu -Xác định đƣợc thị ADN phù hợp cho nghiên cứu đa đạng di truyền Keo tràm (Acacia auriculiformis) Từ xác định đƣợc mối quan hệ di truyền cá thể thu thập từ xuất xứ khác nhau, có liên hệ đến tính trạng sinh trƣởng nhanh cá thể, góp phần phục vụ công tác chọn giống theo hƣớng chất lƣợng cao  Yêu cầu - Xác định cặp mồi để đánh giá đa dạng di truyền dòng Keo tràm - Tìm hiểu mối quan hệ di truyền dòng Keo tràm Việt Nam  Phƣơng pháp nghiên cứu - Sử dụng kĩ thuật PCR để khuếch đại DNA ly trích từ mẫu 100dòng Keo tràm thu đƣợc với 9cặp mồi  Kết - Bƣớc đầu lọc đƣợc số cặp mồi SSR đƣợc sử dụng cho phân tích đa dạng di truyền Và có khác trọng lƣợng bands cá thể phân tích có biến động di truyền cá thể  Kết luận - Thí nghiệm lọc đƣợc số cặp mồi (Am 341, Am 326 Am 770) cho hiệu phân tích đa dạng di truyền Keo tràm tốt MỤC LỤC ĐỀ MỤC TRANG TRANG TỰA ii LỜI CẢM ƠN iii TÓM TẮT iv MỤC LỤC v DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT viii DANH SÁCH CÁC HÌNH ix DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ x Phần MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Yêu cầu mục đích nghiên cứu đề tài 1.4 Giới hạn đề tài Phần TỔNG QUAN 2.1 Giới thiệu đa dạng sinh học 2.1.1 Định nghĩa 2.1.2 Ý nghĩa đa dạng sinh học 2.1.3 Các phân mức đa dạng sinh học 2.1.3.1 Sự đa dạng hệ sinh thái 2.1.3.2 Đa dạng loài 2.1.3.3 Đa dạng di truyền 2.2 Một số DNA marker sử dụng nghiên cứu đa dạng di truyền 2.2.1 Phân loại 2.2.2 Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) 2.2.3 Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP) 2.2.4 Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphism DNA) 10 2.2.5 SSR (Microsatellite) 10 2.3 Kỹ thuật Microsatellite 11 2.3.1 Khái niệm Microsatellite 11 2.3.2 Tính chất 12 2.3.3 Sự phát triển primer Microsatellite 13 2.3.4 Giới hạn Microsatellite 14 2.3.5 Các loại Microsatellite 15 2.3.6 Cơ chế hình thành vai trò Microsatellite 15 2.3.6.1 Cơ chế hình thành Microsatellite 15 2.3.6.2 Vai trò Microsatellite 17 2.3.7 Các phƣơng pháp phát Microsatellite 18 2.3.7.1 Phƣơng pháp lai 18 2.3.7.2 Phƣơng pháp PCR 19 2.4 Polymerase Chain Reaction (PCR) 19 2.4.1 Khái niệm 19 2.4.2 Thành phần vai trò chất phản ứng PCR 20 2.4.4 Ứng dụng kỹ thuật PCR 23 2.4.5 Ƣu nhƣợc điểm kỹ thuật PCR 23 2.5 Quy trình ly trích DNA thực vật 23 2.5.1 Định lƣợng DNA phƣơng pháp quang phổ 25 2.5.2 Định tính DNA ly trích phƣơng pháp điện di 26 2.6 Tổng quan Keo tràm (Acacia auriculiformis) 28 2.6.1 Vài nét chi Keo (Acacia) 28 2.6.1.1 Đặc điểm sinh học loài Keo 28 2.6.1.2 Cơng dụng lồi Keo (Acacia) 30 2.6.2 Vài nét Keo tràm (Acacia auriculiformis A Cunn ex Benth) 32 2.6.2.1 Các đặc điểm sinh học sinh thái 33 2.6.2.2 Công dụng tiềm gây trồng 35 Phần VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 36 3.1 Thời gian địa điểm thực 36 3.1.1 Thời gian thực 36 3.1.2 Địa điểm thực 36 3.2 Vật liệu thí nghiệm 36 3.3 Phƣơng pháp thí nghiệm 36 3.4 Thiết bị dụng cụ 37 3.5 Ly trích DNA 37 3.5.1 Hóa chất 37 3.5.2 Quy trình ly trích DNA 38 3.5.3 Kiểm tra sản phẩm DNA ly trích 40 3.6.1 Qui trình phản ứng PCR 40 3.6.2 Điện di sản phẩm PCR 42 Phần KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 44 4.1 Q trình ly trích 44 4.2 Phản ứng PCR 44 Phần KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 48 5.1 Kết luận 48 5.2 Đề nghị 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 PHỤ LỤC DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT  µg: microgram  µM: micromol/lite  Al: Allele  bp: base pair  M:mét  cm: centimét  CTAB: Cetyltrimethylammonium bromide  DNA: Deoxyribonucleic acid  dNTP: Deoxynucleotide triphosphate  EDTA: Ethylene diaminetetra acetic acid  EtBt: Ethidium bromide  Kb: kilobases  mM: milimolar (milimol/lite)  PCR: Polymerase chain reaction  RNA: Ribonucleic acid  RNase: Ribonuclease  SSR: Single sequence repeat  Ta : Annealing temperature (nhiệt độ bắt cặp)  TAE: Tris-glacial acetic acid- ethylenne diamine tetra acetic acid  TE: Tris-EDTA (ethylenne diamine tetra acetic acid)  Tm: Melting temperature (nhiệt độ nóng chảy)  U: Đơn vị hoạt tính Taq  UV: Ultra Violet DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1: Cơ chế bắt chéo lỗi giảm phân 16 Hình 2.2: Cơ chế trƣợt lỗi trình mã 16 Hình 2.3:Nguyên tắc phản ứng PCR 20 Hình 2.4: Hình thái loài Keo(Acacia) 29 Hình2.5:Hình thái số lồi Keo 30 Hình 2.6 Keo tràm 33 48 3.5.2 Quy trình ly trích DNA DNA mẫu Keo đƣợc ly trích theo quy trình mơ tả Butcher cộng (sơ đồ 3.1) Sơ đồ 3.1: Q trình ly trích mẫu DNA 0.2g Keo non Bổ sung 500 μl Chloroform đảo o Nghiền mẫu Nitơ lỏng(-196o) o Bổ sung 900 μl CTAB(65o) o Ủ 45-60 phút (65o) o Bổ sung μl mercaptoethanol Ly tâm 13000vòng phút.Thu dịch Bổ sung 500 μl Phenol+ Chloroform (v/v=1:1).Đảo Ly tâm 13000vòng phút.Thu dịch Bổ sung 200 μl CTAB tủa, đảo phút +500 μl Phenol+ Chloroform(v/v=1:1).Đảo Tủa DNA 600 μl Isopropanol lạnh, ly tâm lạnh 4oC(13000 vòng 15 phút).Thu tủa Rửa 500 μl ethalnol (80%), ly tâm lạnh 4o (13000 vòng 15 phút), thu tủa, phơi khơ nhiệt độ phịng Hịa tan tủa DNA TE 49 3.5.3 Kiểm tra sản phẩm DNA ly trích Mẫu DNA ly trích đƣợc điện di gel Agarose1.5%, dung dịch đệm 1X TBE hiệu điện 60 V, cƣờng độ dòng điện 400 mA 60phút Sau chạy điện di xong, ngâm gel hỗn hợp Ethidium Bromide 0,5 g/ml TAE 0,5X 15phút Gel sau nhuộm đƣợc rửa nhẹ với TAE 0,5X đƣa vào máy chụp ảnh DNA Dƣới tia UV, Ethidium Bromide liên kết với sợi đôi DNA phát quang tạo thành band gel 3.6 Thực kỹ thuật SSR  Hóa chất dùng phản ứng PCR: PCR buffer Primer MgCl2 DNA mẫu (ly trích từ dNTP’s Keo) H2O cất chạy PCR Taq DNA polymerase 3.6.1 Qui trình phản ứng PCR Phản ứng PCR với cặp primer lựa chọn Thành phần Thể tích sử dụng Nồng độ đầu Nồng độ cuối HN buffer 2,5 μl 10X 1X MgCl2 0,75μl 50mM 1.5mM dNTPs 0,2μl 25mM 0,2mM Primer forward 0.5μl 10 μmol/ μl 0,2 μmol/ μl Primer reverse 0.5μl 10 μmol/ μl 0,2 μmol/ μl DNA mẫu 0.5μl Taq polymerase 0,2μl 5u/ μl 1u/ μl 50 H2O cất 19,85μl Tổng thể tích: 25µ Bảng 3.2: Chu trình nhiệt phản ứng PCR Chu kỳ Nhiệt độ (oC) Thời gian - 29 94 phút 94 30 giây 55-60 30 giây 72 phút 30 72 phút 31 Forever Lƣu ý: Sau phản ứng PCR hoàn chỉnh, chờ cho nhiệt độ máy 4oC phút Đem sản phẩm trữ 4oC hay -20oC để sử dụng với thí nghiệm sau Các thao tác tiến hành pha mix phải thực tủ cấy để đảm bảo điều kiện vô trùng thành phần phải đƣợc giữ điều kiện lạnh Trình tự primer sử dụng đề tài theo chiều 5’ – 3’ Bảng 3.3: Trình tự SSR’Primer sử dụng Primer Am008 Trình tự (5’-3’) F: CCACCCGTTACCCATTTATG Nucleotide lặp lại (TG)14 R: CCGTGATTGACTCTCAGCG Am012 F: TGAGTCGATCGCTTAGCTTG (TC)15(AC)7-(AC)10AG R: TCCCGTTATTATGCCAAAGTG Am014 F: TACTAACGTTGCTATATGAGAAAGG (ATAC)3(AC)26(AT)3,(GTAT)2(AT)3AC R: CTGGTTGTTCGCTTATATGG 51 Am018 F: CACGGCTGTTATTTCCTTCG (AC)14 R: GGAAAGAGGTGTGACAGAGGAC Am326 F: GGACCAAACTTATGCAACACC (CA)20 R: GCATCAATGTACTAAACCATTTCC Am341 F: CCATTCGAGCATCCTAAGAG (CA)12(TA)2 R: CGTATGGCTGAGCTACTTAATCA Am502 F: CAAATGGCCAAGTTACGACTG (TTC)3-(GGA)8, AGA(GGA)2 R: TTCTGGTAATCCAAACTTATGTGG Am522 F: ATGAGTTTGACCCGACTTGA (AAT)3-(AGT)2(GGT)7 R: TGCGTAACACGATTATCCT Am770 F: CAGAGGTGGCAGATGATGTC CTC(CAC)5CGC,(CAC)3 R: AAGCCTTTAGTTGGGCGTTC 3.6.2 Điện di sản phẩm PCR Lƣu ý: Khi tiến hành nạp gel gắn lƣợc cần tránh tạo bọt khí gel giếng Bƣớc1: Rửa kính(0.75mm) với nƣớc Lau khơ giấy mềm Rửa lại 2lần cồn 70 oC Dùng giấy không bụi lau lại thật Lắp kính vào phận đổ gel điện di đứng vào Bƣớc2: Chuẩn bị gel phân tích polyacrylamide(7.5%): H2 O 4.89ml Tris HCl 1.5M,pH 8.8 2.5ml Monomer 2.5ml TEMED 10 μl 10% APS 100 μl Bơm dịch gel vào phận đổ gel Thêm iso propanol vào để làm mặt gel Đợi gel đơng hồn tồn (khoảng 20phút), thấm hút dịch isopropanol Bƣớc3: Chuẩn bị gel gom polyacrylamide(7.5%): H2 O Tris HCl 1.5M,pH 8.8 2.133ml 0.33ml 52 Monomer 0.83ml TEMED 3μl 10% APS 30μl Bơm dịch gel vào phận đổ gel Gắn lƣợc tạo giếng Đợi gel đơng hồn tồn Tháo lƣợc Gắn gel vào buồng điện di đứng Chuẩn bị load mẫu điện di Bƣớc4: Trộn 10µl mẫu với 10µl loading dye5x (BioRad) nạp vào giếng Vận hành máy điện di 60V, 400A 60 phút Bƣớc5: Di chuyển gel khỏi kính đem nhuộm ethium bromide 15 phút Rửa lại với TAE 0.5X Tiến hành chụp gel 53 Phần KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Q trình ly trích Li trích DNA bƣớc khởi đầu quan trọng, định thành công cho phản ứng PCR sau Qui trình li trích DNA theo sơ đồ 3.1 đạt hiệu tốt DNA li trích có độ tinh khiết cao, không bị lẫn tạp DNA lạ Dịch trích DNA chứa chất mercaptoethalnol có khả phá vỡ thành tế bào mạnh Bƣớc sử dụng Chloroform đƣợc lặp lại lần liên tiếp kết hợp với li tâm loại bỏ hết protein polysaccharide có mẫu Do đó, DNA thu đƣợc tƣơng đối tốt, đảm bảo cho phản ứng PCR xảy Bƣớc pha tủa pha loãng mẫu giúp giảm nồng độ tạp chất cịn lẫn sản phẩm li trích sau cùng, bƣớc li tâm giúp thu đƣợc DNA tinh với nồng độ thấp khoảng ống không bị lẫn tạp chất lắng xuống đáy ống Hình điện di sản phẩm ly trích DNA 4.2 Phản ứng PCR 54 Phản ứng PCR qua nhiều thí nghiệm với nhiều quy trình nhiệt độ thành phần thay đổi tìm đƣợc điều kiện thích hợp Quy trình PCR phù hợp cho kết tin cậy Do đoạn DNA thu đƣợc từ sản phẩm PCR có kích thƣớc khơng q khác biệt nên đa hình khó nhận thấy sản phẩm điện di gel thông thƣờng Vì cần phải tiếp tục phân tích máy giải trình tự ABI 3100 để thu đƣợc kết xác Sau tách chiết, mẫu ADN tách chiết từ mẫu thí nghiệm đƣợc sử dụng để lọc mồi SSR để tìm đa hình xem mồi đƣợc sử dụng để đánh giá mối quan hệ di truyền cá thể Keo tràm nghiên cứu Kết lọc cặp mồi thu đƣợc : Thanh lọc với cặp mồi Am341: Cá thể số 91 không xuất band Có khác trọng lƣợng band cá thể Đồng thời có biến động di truyền cá thể Thanh lọc với cặp mồi Am 522: Có thu đƣợc đa hình số dòng Cá thể số 142 178 có trọng lƣợng phân tử nhỏ dịng khác 55 Thanh lọc với cặp mồi Am 502 Thanh lọc với cặp mồi Am 770: Cặp mồi Am 770 sử dụng để nhận biết khác biệt cá thể: cá thể số 36 khơng có band Thanh lọc với cặp mồi Am 326 56 Tƣơng tự nhƣ mồi Am 770, cặp mồi Am 326 đƣợc dùng để nhận biết cá thể 116, 10, 30, 169 134 với cá thể khác Nhƣ cặp mồi Am 326, Am 341 Am 770 đƣợc sử dụng để phân biệt với cá thể khác thí nghiệm Cần thử nghiệm tiếp để tìm đƣợc căp mồi chung cho toàn cá thể nghiên cứu Kết lọc mồi SSR thí nghiệm này, bƣớc đầu cho thấy mồi cho dạng đa hình cá thể, mồi Am 341 phân biệt dùng để phân biệt cá thể số 91 (thuộc nhóm sinh trƣởng trung bình) với cá thể khác Cặp mồi Am 770 đƣợc dùng để nhận biết cá thể số (thuộc nhóm cá thể có sinh trƣởng nhanh), mồi Am 326 dùng để nhận biết cá thể 116, 10, 30, 169 134 với thể khác Tuy nhiên, cặp mồi Am 326 sử dụng để tìm hiểu mối quan hệ di truyền cá thể không sử dụng đƣợc để tìm hiểu mối liên kết thị phân tử tính trạng tăng trƣởng nhanh quần thể Keo tràm đƣợc Những thí nghiệm lọc với cặp mồi khác đƣợc tiếp tục tiến hành để phát thêm cặp mồi dùng để phân biệt cá thể , đặc biệt có liên quan đến tính trạng sinh trƣởng nhanh , đƣợc sử dụng cơng tác chọn giống Keo tràm theo hƣớng chất lƣợng với độ xác cao 57 Phần KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Từ kết thu đƣợc, rút số kết luận nhƣ sau: Sử dụng keo non để ly trích thu đƣợc lƣợng DNA mẫu tốt Kết lọc cho thấy cặp mồi Am 341, Am 326 Am 770 đƣợc sử dụng để tìm hiểu mối quan hệ cá thể Tuy nhiên để sử dụng thị tìm hiểu liên hệ với tính trạng tăng trƣởng nhanh thi sử dụng mồi Am 341 Am 770 Luận văn thực phần đề tài lớn với việc ứng dụng thị phân tử ADN chọn giống Keo tràm theo hƣớng tăng trƣởng nhanh Tổng số mồi SSR dự kiến sử dụng 50 cặp Tuy nhiên số kinh phí cấp hàng năm hạn chế nên năm đủ kinh phí mua 5-6 cặp mồi hố chất thí nghiệm Vì thế, luận văn thực bƣớc lọc đƣợc cặp mồi Do số cặp mồi lọc cịn nên việc sử dụng phần mềm NTSYS để phân tích mối quan hệ di truyền chƣa đƣợc xác, luận văn chƣa thể có kết luận mối quan hệ di truyền cá thể nghiên cứu 58 5.2 Đề nghị Trong cơng trình nghiên cứu Microsatellite để mang lại kết khả quan việc thu nhận đoạn DNA mã hố cho tính trạng chiều cao cây, thể tích thân, phẩm chất gỗ, khả chống chịu sâu bệnh cần lƣu ý số vấn đề sau: - Tiếp tục áp dụng hoàn thiện kỹ thuật Microsatellite để lập hồ sơ kiểu gene cho giống keo phục vụ cho việc trao đổi liệu, thông tin đa dạng di truyền giống, đồng thời phục vụ cho công tác lai tạo chọn lọc giống - Từ kết nghiên cứu lần tiếp tục phát triển thêm, nhiều cặp mồi SSR cần phải đƣợc thử nghiệm, lọc để chọn lựa primer phù hợp cho việc đánh giá mối quan hệ di truyền gữa cá thể Keo tràm cách xác, để xây dựng sở di truyền hoàn chỉnh tin cậy cho giống có phẩm chất cao Việt Nam nhằm tạo thuận lợi cho nhận định, kiểm tra, phân tích sau -Cần ý thu thập thơng tin QTL (Quantitive trait loci) có liên quan đến tính trạng tăng trƣởng nhanh để tìm đƣợc cặp mồi thích hợp cho q trình phân tích Trên sở đó, cặp mồi tìm đƣợc đƣợc dùng để xác định liên hệ với tính trạng tăng trƣởng nhanh quần thể Keo tràm nghiên cứu 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Bùi Chí Bửu – Nguyễn Thị Lang – 1999: Di truyền phân tử - Những nguyên tắc chọn giống trồng- Nhà xuất Nông nghiệp Thành Phố Hồ Chí Minh Lê Trọng Cúc – 2002: Đa dạng sinh học bảo tồn thiên nhiên – Nhà xuất Đại học Quốc gia Hà Nội Đỗ Thị Hồng Diễm :Luận văn khóa luận tốt nghiệp 2002-2006 Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng – 1997: Sinh học phân tử - Nhà xuất giáo dục Bùi Việt Hải – 1998:Nghiên cứu số sở khoa học cho kỹ thuật tỉa thƣa rừng trồng Keo tràm cung cấp gỗ nguyên liệu giấy sợi vùng miền Đông Nam Bộ 60 Phạm Thành Hổ : Bài giảng CNSH trồng Nguyễn Thị Lang – 2002: Các phƣơng pháp nghiên cứu công nghệ sinh học – Nhà xuất Nông nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh Lâm Vỹ Nguyên: Luận văn khóa luận tốt nghiệp 2002-2006 Phạm Bình Quyền - Nguyễn Nghĩa Thìn – 2002 Đa dạng sinh học - Nhà xuất Đại học Quốc gia Hà Nội 10 Nguyễn Nghĩa Thìn – 2005: Đa dạng sinh học tài nguyên di truyền thực vật Nhà xuất Đại học Quốc gia Hà Nội 11 Trần Ngọc Việt : Luận văn khóa luận tốt nghiệp 2002-2006 TÀI LIỆU TIẾNG NƢỚC NGOÀI 13 Butcher PA.; Decroocq S.;Gray Y Moran GF.,2000: Development, inheritance and cross- species amplification of Microsatellite markers from Acacia mangium 14 Wickneswari R and Norwati M 199: Genetic diversity of natural population of Acacia auriculifofmis Aust.J.Bot 41:65-77 15 Kenneth Berendzen, Iain Searle, Dean Ravenscroft, v.v ,2005: A rapid and versatile combined DNA/RNA extraction protocol and its application to the analysis of a novel DNA marker set polymorphic between Arabidopsis thalian ecotypes Col-0 and Landsberg erecta 61 16 T A Holton, 1999 Plant Genotyping by Analysis of Microsatellites – Centre for Plant Conservation Genetics Southern Cross University, Lisomore, Australia 17 Powell W; Morgante M; Andre C; Hanafey M; Vogel J; Tingey S; Rafalski A: The comparison of RFLP, RAPD, AFLP and SSR (Microsatellite) markers for germplasm analysis 18 Antonio A.F Garcia, Luciana L Benchimo, Antônia M.M Barbosa, Isaias O Geraldi: Comparison of RAPD, RFLP, AFLP and SSR markers for diversity studies in tropical maize inbred lines TRANG WEB http://www.nea.gov.vn/nIndex.asp?ID=22275 http://www.weihenstephan.de/pbpz/bambara/html/rapd.html http://www.ncbi.nih.gov http://www.nea.gov.vn/html/DDSH/dulieu1/khainiem/ http://webdoc.sub.gwdg.de/ebook/y/1999/whichmarker/index.htm PHỤ LỤC Phụ lục 1: Danh sách dịng Keo thí nghiệm STT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 Các dòng PT tốt Dòng số V(cm3) Dòng PT TB Dòng số V (cm3) Dòng PT chậm Dòng số V(cm3) 12 19.42 70 15.07 177 6.61 33 19.6 140 15.1 51 7.58 41 19.64 167 15.18 132 7.67 30 19.73 99 15.2 176 7.88 1b 19.85 94 15.23 104 7.9 1c 20.18 138 15.41 151 8.04 29 20.8 76 15.42 88 8.08 38 20.92 91 15.52 131 8.87 159 21.06 67 15.59 178 9.03 84 21.11 15.6 9.09 21.3 61 16.06 170 10 145 21.42 50 16.15 150 10.75 25 21.52 72 16.37 144 10.84 19 21.54 162 16.42 166 11.21 1f 21.59 11 16.48 148 11.32 158 21.73 16.95 92 11.43 21.86 10 16.99 47 11.79 22.51 23 17.22 175 11.82 36 23.21 71 17.22 135 12.26 23.4 65 17.23 103 12.36 34 23.76 16 17.25 142 12.48 18 24.02 71b 17.49 163 12.6 1k 24.27 89 17.66 168 12.75 44 24.45 31 17.75 169 12.86 57 24.5 137 17.84 136 12.88 85 25.16 97 18.02 86 13.26 13 25.45 152 18.1 56 13.33 25.57 78 18.15 73 13.49 58 25.82 172 18.22 83 13.56 147 26.65 81 18.23 87 13.72 64 27.87 60 18.41 82 13.85 1e 27.94 133 18.62 100 13.97 26 28.08 32 18.64 14 14,16 43 29.83 ... đổi tiến hóa 2.3.7 Các phƣơng pháp phát Microsatellite Có phƣơng pháp để phát microsatellite: phƣơng pháp lai phƣơng pháp PCR 2.3.7.1 Phƣơng pháp lai Phƣơng pháp lai phân tử cho phép xác định xác... đề tồn việc phân biệt định loại loài thực tế thƣờng phức tạp nhiều so với lý thuyết Một lồi có nhiều phân lồi mà ta dễ dàng phân biệt dựa theo đặc điểm cấu tạo hình thái Nhƣng, đơi phân loài giống... Sự khác biệt gene cho phép lồi thích ứng đƣợc với thay đổi mơi trƣờng 2.2 Một số DNA marker sử dụng nghiên cứu đa dạng di truyền 2.2.1 Phân loại Về chất, chuỗi mã DNA đƣợc dùng để phân biệt hai