Nghiên cứu này xây dựng bộ KIT để phân biệt thịt heo và thịt bò dựa vào kỹ thuật multiplex PCR để giúp quá trình phân biệt các loại thịt này trở nên đơn giản hơn. Kết quả này hi vọng góp phần giảm vấn nạn gian lận thương mại đối với sản phẩm thịt tươi cũng như các sản phẩm chế biến từ thịt. Mời các bạn cùng tham khảo!
Kỷ yếu Hội nghị khoa học XÂY DỰNG BỘ KIT PHÂN BIỆT THỊT HEO VÀ THỊT BÒ BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ Hồ Viết Thế*, Ngô Thị Kim Anh, Phạm Thị Tuyết Trinh Nguyễn Hiếu Thuyên, Hồ Lê Quỳnh Trinh Trường Đại học Công nghiệp Thực phẩm TP.HCM *Tác giả liên lạc: thehv@cntp.edu.vn TÓM TẮT Xác định loại thịt phương pháp sinh học phân tử trở nên phổ biến thập niên qua mức độ xác cao Trong nghiên cứu này, chúng tơi phát triển KIT phân biệt thịt heo thịt bị dựa kỹ thuật multiplex PCR thơng qua việc khuếch đại đoạn DNA đặc trưng hai gene ty thể COI ND5 Kết tối ưu hóa phản ứng multiplex PCR đượ hồn thiện thành KIT Kết thực nghiệm cho thấy KIT đạt độ xác cao áp dụng thịt tươi sản phẩm thịt qua chế biến Từ khóa: Thịt bị, thịt heo, multiplex PCR, KIT DEVELOP MOLECULAR BIOLOGY- BASED KIT TO DISTINGUISH BETWEEN PORK AND BEEF Ho Viet The*, Ngo Thi Kim Anh, Pham Thi Tuyet Trinh Nguyen Hieu Thuyen, Ho Le Quynh Trinh Ho Chi Minh city University of Food Industry *Corresponding Author: thehv@cntp.edu.vn ABSTRACT Identifying meat by molecular markers has become ubiquitous in the past decades In this study, multiplex PCR –based detectionn KIT was developed to distinguish between pork and beef relying on the presence of specific DNA fragments on two mitochondrial genes consisting of COI and ND5 After optimization, the obtained KIT could differentiate beef from pork with high accuracy and this KIT is also applicable for identifiying both raw meats and meat-proccessed products Keywords: Beef, pork, multiplex PCR, KIT MỞ ĐẦU Cùng với phát triển kinh tế, nhu cầu sử dụng thực phẩm chất lượng cao tăng theo, đặc biệt có thịt bò [1] Tuy nhiên, nhiều trường hợp người bn bán lợi nhuận dùng hóa chất để làm giả thịt bò từ nguyên liệu loại thịt khác [2] Điều gây ảnh hưởng đến việc kinh doanh, sản xuất sức khỏe người tiêu dùng Vì vậy, việc tìm phương pháp phân biệt thịt heo thịt bị cách nhanh chóng, xác phục vụ người tiêu dùng nhân viên kiểm tra thực phẩm cần thiết Những phương pháp phân biệt thịt heo, thịt bò chủ yếu dựa màu sắc, mùi vị, độ dai thịt bò loại thịt bò tẩm hóa chất hay sản phẩm qua chế biến phương pháp cho độ xác thấp thực [2] Trong thập niên gần đây, nhờ phát triển sinh học phân tử nên phương pháp phân biệt thịt dựa vào DNA cho kết xác Trong đó, phương pháp PCR dễ thực hiện, cho kết xác với độ nhạy cao thời gian ngắn [3] Năm 1999, nhóm nghiên cứu Matsunaga phát loại thịt (bò, heo, cừu, dê, ngựa, gà) từ thịt tươi thịt chế biến kỹ thuật multiplex PCR [4] Gần đây, Kitpipit cộng đưa bước tiến việc phát loại thịt cách thực PCR trực tiếp mà không cần tách chiết DNA trước với primer thiết kế từ cytochrome ty thể (cyt b), cytochrome oxidase I (COI), 12s rRNA [5] Phương pháp đại xác để phát phân biệt loại thịt PCR định lượng [6], nhiên phương pháp địi hỏi thiết bị đại hóa chất đắt tiền nên chưa sử dụng phổ biến Một bước cải tiến phương pháp PCR 171 Kỷ yếu Hội nghị khoa học loại thịt thu thập chợ siêu thị Sau thu thập, mẫu mã hóa bảo quản -80 oC đến sử dụng Phương pháp Mẫu rã đơng mẫu nhiệt độ phịng, tiến hành tách chiết DNA theo dẫn liệu Lương Quý Phương [7] Tuy nhiên, thay đổi thời gian ly giải thịt từ 30 phút lên tủa DNA isopropan thay sử dụng ethanol tuyệt đối DNA sau tách chiết định tính phương pháp điện di 110V 20 phút định lượng phương pháp đo quang phổ Sau đó, tiến hành phản ứng PCR với cặp primer thiết kế dựa đoạn gene COI PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU heo đoạn gene ND5 bò Vật liệu Mẫu thu thập từ lò mổ, siêu thị (Bảng 1) Các cặp primer sử dụng chợ địa bàn quận Tân Phú, thành phố nghiên cứu nhóm Spychaj [8] Hồ Chí Minh Các sản phẩm chế biến từ hai Motalib [9] Bảng Trình tự primer xi ngược Độ dài Tài liệu sản Thịt Trình tự (5’ – 3’) Gene tham phẩm khảo (bp) 5’- GGAGCAGTGTTCGCCATTAT-3’ Heo 294 [8] COI 5’- TTCTCGTTTTGATGCGAATG-3’ multiplex PCR, kỹ thuật giúp nhanh chóng phát nhiều gen mục tiêu phản ứng từ rút ngắn thời gian đưa kết tận dụng thiết bị PCR truyền thống có mặt phổ biến phịng thí nghiệm Trong nghiên cứu xây xây dựng KIT để phân biệt thịt heo thịt bò dựa vào kỹ thuật multiplex PCR để giúp trình phân biệt loại thịt trở nên đơn giản Kết hi vọng góp phần giảm vấn nạn gian lận thương mại sản phẩm thịt tươi sản phẩm chế biến từ thịt Bò 5’- GGTTTCATTTTAGCAATAGCATGG-3’ 5’- GTCCAATCAAGGGTATGTTTGAG-3’ Phản ứng PCR thực theo cặp primer với loại DNA mẫu thịt khác heo bị Sau chúng tơi tiến hành khảo sát nồng độ DNA tối ưu cho phản ứng PCR, bao gồm nồng độ 50 ng/µl, 100 ng/µl, 150 ng/µl nồng độ primer tối ưu bao gồm nồng độ µM, 10 µM, 15 µM cho phản ứng Sau tối ưu hóa nồng độ DNA nồng độ primer thí nghiệm trước, chúng tơi thử nghiệm tính chuyên biệt cặp primer phản ứng multiplex PCR Tiếp theo, chúng tơi tối ưu hóa nồng độ cặp primer cho phản ứng multiplex PCR tối ưu hóa nhiệt độ bắt cặp nhiệt độ 52oC, 53oC, 54oC, 55oC, 56oC, 57oC Tổng thể tích phản ứng PCR 20 µl, bao gồm: MyTaqTM HS Mix White 2X µl, primer µl, DNA loại thịt µl nước Phản ứng PCR thực theo chu trình nhiệt sau: biến tín ban đầu 94oC - phút; 35 chu kỳ: 94oC - phút, 54oC - 45 giây, 72oC - phút; kéo dài kết thúc 72oC - phút ND5 106 [9] Sau đó, quy trình multiplex PCR hoàn thiện sử dụng để phát thịt heo thịt bò mẫu thực phẩm chế biến từ thịt KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Kết tách chiết DNA Kết tách chiết DNA từ thịt tươi thể Hình Các band DNA thu sau ly trích rõ ràng, nồng độ cao Đối với mẫu DNA tách chiết từ thực phẩm trình bày Hình Kết điện di cho thấy DNA bị đứt gãy nhiễm tạp nhiều nên band mờ, kéo vạch dài Nguyên nhân sản phẩm chứa nhiều bột, chất phụ gia, thịt qua chế biến nên gây cản trở cho việc tách chiết Tuy nhiên, nồng độ DNA thu cao, chứng tỏ quy trình tách chiết DNA sản phẩm từ thịt DNA sử dụng để thực phản ứng PCR multiplex PCR (Hình Hình 8) 172 Kỷ yếu Hội nghị khoa học Hình 1a Kết tách chiết DNA từ thịt tươi (H1, H2: mẫu thịt heo tươi; B1, B2: mẫu thịt bị tươi) Hình 1b Kết tách chiết DNA từ sản phẩm thịt qua chế biến (XH, XB: xúc xích heo, bị; CH: chả heo; BV: bị viên) Kết tối ưu hóa nồng độ primer nồng độ PCR tốt [10] Nghiên cứu Jonker cs (2008) nồng độ DNA khoảng DNA cho loại thịt Nồng độ DNA nồng độ primer có ảnh hưởng 50 đến 250 ng không gây phản ứng chéo quan trọng đến tính xác, độ nhạy phản DNA động vật Vì vậy, chúng tơi tiến hành ứng PCR (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2002) Bên khảo sát nồng độ primer nồng độ DNA cho cạnh đó, vào năm 2013 Marin cộng phản ứng PCR phát DNA thịt heo thịt bị tiến hành tối ưu hóa nồng độ primer để thu kết Kết trình bày Hình Hình Hình Kết tối ưu hóa nồng độ DNA nồng độ primer cho phản ứng PCR phát DNA heo (M: thang chuẩn DNA) 173 Kỷ yếu Hội nghị khoa học Hình Kết tối ưu hóa nồng độ DNA nồng độ primer cho phản ứng PCR phát DNA bò (M: thang chuẩn DNA) Từ kết quan sát Hình Hình cho thấy sản phẩm khuếch đại chun biệt cho heo bị có kích thước phù hợp với nghiên cứu trước [8,9] Chúng tơi nhận thấy nồng độ primer có ảnh hưởng lớn tới kết phản ứng PCR nồng độ DNA cho sản phẩm khuếch đại có độ sáng khác tăng dần theo nồng độ primer Đối với phản ứng phát thịt heo, nồng độ DNA µM cho kết tốt nhất, Hình Kết multiplex PCR chuyên biệt nồng độ 10 µM phù hợp với việc phát (N: mẫu đối chứng âm; 1: primer heo, primer bò thịt bị Vì vậy, chúng tơi định chọn nồng độ tối ưu cho phản ứng sau: nồng độ DNA heo; 2: primer heo, primer bò DNA bị; 3: DNA 50 ng/µl cho hai loại thịt nồng độ primer primer heo, primer bò, DNA heo DNA bò; M: heo, bò µM, 10 µM để thực phản thang chuẩn DNA) ứng multiplex PCR cho thịt heo thịt bò thí Kết cho thấy mẫu khơng bị nhiễm chéo, band sản phẩm khuếch đại rõ ràng, kích thước nghiệm Kết thử nghiệm tính chuyên biệt cặp tương ứng với nghiên cứu trước [8,9] Các cặp primer có tính chun biệt cao đáp ứng cho primer phản ứng multiplex PCR phản ứng multiplex PCR phân biệt thịt heo Trong phản ứng multiplex PCR việc kết hợp nhiều primer nhiều DNA dễ dẫn đến trường hợp thịt bò nhiễm chéo hay gây tượng dương tính Kết tối ưu hóa nồng độ primer nhiệt độ giả nên việc tìm cặp primer chuyên biệt cho bắt cặp cho phản ứng multiplex PCR loại DNA quan trọng Chính vậy, Do kết hợp nhiều primer với nồng độ không tiến hành khảo sát mức độ chuyên biệt phù hợp phản ứng multiplex PCR xảy phản ứng multiplex hai cặp primer khuếch đại không đồng locus, số sản phẩm khuếch đại khó quan sát chọn Kết trình bày Hình sau phản ứng [11] Vì vậy, chúng tơi tiến hành khảo sát nồng độ primer cho phản ứng này, kết trình bày Hình 174 Kỷ yếu Hội nghị khoa học Hình Kết tối ưu hóa nồng độ primer cho phản ứng multiplex PCR phát DNA heo DNA bò (M: thang chuẩn DNA) Quan sát Hình 5, chúng tơi thấy có khác biệt độ primer bị 10 µM (giếng số 5) để thực phản kết hợp nồng độ primer khác ứng multiplex PCR heo, bò viết hướng dẫn sử phản ứng multiplex PCR Kết cho thấy cần dụng cho KIT có nồng độ primer tương ứng kết hợp Bên cạnh đó, nhiệt độ bắt cặp yếu tố primer phản ứng multiplex PCR Trước quan trọng multiplex PCR cặp primer đó, nhóm nghiên cứu Markoulatos sử có nhiệt độ bắt cặp khác nên kết hợp dụng nồng độ primer khác phản phản ứng cần tìm nhiệt độ phù hợp ứng multiplex PCR [12] Ở Hình 5, mẫu để kết phản ứng tốt [11] Nên chúng giếng số 5, 6, 8, cho hai sản phẩm khuếch đại heo tiến hành khảo sát nhiệt độ bắt cặp cho phản ứng bò sáng rõ dễ quan sát Vì vậy, chúng tơi multiplex PCR heo bị Kết trình bày định chọn nồng độ primer heo µM, nồng Hình Hình Tối ưu hóa nhiệt độ bắt cặp cho phản ứng multiplex PCR heo, bò (M: thang chuẩn DNA; N: đối chứng âm, 52oC, 53oC, 54oC, 55oC, 56oC, 57oC) Tại Hình 6, kết thu tất nhiệt độ bắt cặp Chúng thử nghiệm với mẫu thực phẩm khảo sát cho sản phẩm khuếch đại rõ, sáng lấy từ khu chợ siêu thị khu vực quận Tân Nên nhiệt độ khảo sát khơng Phú, thành phố Hồ Chí Minh Các mẫu thử: gây thay đổi cho sản phẩm multiplex PCR heo xúc xích heo, chả quế, xúc xích bị bị viên Kết bị Vì vậy, định chọn nhiệt độ tách DNA thể Hình 1b Qua bắt cặp 57oC làm nhiệt độ thích hợp cho cho thấy DNA sản phẩm từ thịt bị đứt gãy phản ứng multiplex PCR heo bị Vì nhiệt độ làm chất lượng giảm rõ rệt so với DNA ly trích bắt cặp cao, khả xảy bắt cặp nhầm thấp từ thịt tươi (Hình 1a), nhiên kết ly trích hơn, ngồi quy trình PCR tiến hành DNA ly trích từ sản phẩm từ thịt qua chế biến nhanh mức dao động nhiệt độ biến tính phù hợp để thực phản ứng PCR phát riêng nhiệt độ bắt cặp thấp biệt loại (Hình 7) phản ứng muliplex PCR để phát lúc loại thịt (Hình 8) Thử nghiệm số sản phẩm thực phẩm 175 Kỷ yếu Hội nghị khoa học Hình Kết PCR đơn DNA từ mẫu thực phẩm qua chế biến (M: thang chuẩn DNA; N: đối chứng âm, XB: xúc xích bị, BV: bị viên, XH: xúc xích heo, CH: chả heo) Hình Kết multiplex PCR DNA từ mẫu thực phẩm qua chế biến (M: thang chuẩn DNA; N: đối chứng âm, XB: xúc xích bị, BV: bị viên, XH: xúc xích heo, CH: chả heo) Qua kết Hình 8, chúng tơi nhận thấy nước không sử dụng thịt heo nước đạo Hồi sản phẩm xúc xích heo, bị viên xúc xich heo Duy mẫu chả heo khơng phát diện có diện DNA bị heo, chứng tỏ có DNA từ bị, chứng tỏ quy trình sản xuất sản phẩm lẫn tạp thành phần nguyên liệu pha đạt tiêu chuẩn chất, điều dễ trộn loại thịt Đối với mẫu xúc xích bị hiểu sản phẩm cơng ty thực phẩm bị viên hành vi gian dối kinh doanh sản lớn thị trường Từ quy trình trên, chúng tơi phát xuất có sai khác với nguyên liệu in triển thành KIT phân biệt thịt heo thịt bị bao bì, điều cần phải kiểm tra kỹ (Hình 9) hơn, mặt hàng xuất sang Hình Bộ kít phát phân biệt thịt heo thịt bò dựa kỹ thuật multiplex- PCR KẾT LUẬN Qua nghiên cứu này, xây dựng thành công quy trình multiplex PCR để phân biệt thịt heo thịt bị Quy trình có khả phát 176 Kỷ yếu Hội nghị khoa học có mặt thịt heo, thịt bò số sản phẩm thực phẩm qua chế biến Qua nghiên cứu cho thấy tiềm lớn việc sử dụng sinh học phân tử, đặc biệt kỹ thuật multiplex PCR để phát thịt heo thịt bò nguyên liệu thực phẩm sản phẩm chế biến từ thịt Với KIT này, tiếp tục hồn thiện để sản phẩm sớm triển khai vào thực tế TÀI LIỆU THAM KHẢO Phịng thương mại cơng nghiệp Việt Nam, 2016, wesite:http://vcci-hcm.org.vn/diem-nhan-thitruong/nganh-thit-viet-nam-%E2%80%93-co-hoi-va-thach-thuc-tt6357.html Http://tuoitre.vn/lai-phat-hien-thit-heo-gia-bo-1082770.htm Martín I, García T, Fajardo V, López-Calleja I, Rojas M, Pavón MA, Hernández PE, González I, Martín R (2007) Technical note: detection of chicken, turkey, duck, and goose tissues in feedstuffs using species-specific polymerase chain reaction Meat Science 76: 721-729 Matsunaga, T., Chikuni K., Tanabe R et al (1999) A quick and simple method for the identification of meat species and meat product by PCR assay Meat science 51 (2): 143-148 Kitpipit, T., Thanakiatkrai, P., & Chotigeat, W (2013) Direct PCR-FINS: Wildlife species identification without DNA extraction Forensic Science International, Genetics Supplement Series Iwobi, A., Sebah, D., Kraemer, I et al (2015) "A multiplex real-time PCR method for the quantification of beef and pork fractions in minced meat" Food Chemistry 169: 305-313 Lương Quý Phương (2006), Sản xuất kit tách chiết DNA kit PCR phát gene halothan heo, Khóa luận tốt nghiệp kỹ sư công nghệ sinh học, Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh Spychaj A, Marlena Szalata, Ryszard Słomski and Edward Pospiech (2015) Identifi cation of Bovine, Pig and Duck Meat Species in Mixtures and in Meat Products on the Basis of the mtDNA Cytochrome Oxidase Subunit I (COI) Gene Sequence, Pol J Food Nutr Sci., 66(1): 31–36 Motalib Hossain M A., Eaqub Ali, Sharmin Sultana, Asing, Sharmin Quazi Bonny, Md Abdul Kader and M Aminur Rahman (2017) Quantitative Tetraplex Real-Time Polymerase Chain Reaction Assay with TaqMan Probes Discriminates Cattle, Buffalo, and Porcine Materials in Food Chain, Journal of Agricultural and Food Chemistry 65(19):3975-3985 Marín A, Takafumi Fujimoto, Katsutoshi Arai (2013) Rapid species identification of fresh and processed scallops by multiplex PCR, Food Control, 32: 472-476 Henegarui O, Heerema N.A, Dlouhy.S.R, Vance G.H Vogt P.H (1997) Multiplex PCR: critical parameters and step-by-step protocol Biotechniques Journal, 23: 504-511 177 ... phịng thí nghiệm Trong nghiên cứu chúng tơi xây xây dựng KIT để phân biệt thịt heo thịt bò dựa vào kỹ thuật multiplex PCR để giúp trình phân biệt loại thịt trở nên đơn giản Kết hi vọng góp phần... nguyên liệu in triển thành KIT phân biệt thịt heo thịt bò bao bì, điều cần phải kiểm tra kỹ (Hình 9) hơn, mặt hàng xuất sang Hình Bộ kít phát phân biệt thịt heo thịt bò dựa kỹ thuật multiplex-... nghiên cứu này, chúng tơi xây dựng thành cơng quy trình multiplex PCR để phân biệt thịt heo thịt bò Quy trình có khả phát 176 Kỷ yếu Hội nghị khoa học có mặt thịt heo, thịt bò số sản phẩm thực phẩm