XÂY DỰNG các KIT CHẨN đoán tác NHÂN gây BỆNH TAI XANH và BỆNH TIÊU CHẢY cấp TRÊN HEO NUÔI BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH học PHÂN tử

1 B1-2-TMĐT THUYẾT MINH ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ 1 I. THÔNG TIN CHUNG VỀ ĐỀ TÀI 1 Tên đề tài XÂY DỰNG CÁC KIT CHẨN ĐOÁN TÁC NHÂN GÂY BỆNH TAI XANH VÀ BỆNH TIÊU CHẢY CẤP TRÊN HEO NUÔI BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ 2 Mã số (được cấp khi Hồ sơ trúng tuyển) 3 Thời gian thực hiện: 24 tháng 4 Cấp quản lý (Từ tháng 01 /2010 đến tháng 12 /2011 Nhà nước Bộ Tỉnh Cơ sở 5 Kinh phí 1.175,168 triệu đồng, trong đó: Nguồn Tổng số - T ừ Ngân sách sự nghiệp khoa học 1.135,168 triệu đồng - Từ nguồn tự có của tổ chức - Từ nguồn khác 6 Thuộc Chương trình (Ghi rõ tên chương trình, nếu có), Mã số: Thuộc dự án KH&CN; Đề tài độc lập; 7 Lĩnh vực khoa học Tự nhiên; Nông, lâm, ngư nghiệp; Kỹ thuật và công nghệ; Y dược. 1 Bản Thuyết minh này dùng cho hoạt động nghiên cứu ứng dụng và phát triển công nghệ thuộc 4 lĩnh vực khoa học nêu tại mục 7 của Thuyết minh. Thuyết minh được trình bày và in trên khổ A4 2 8 Chủ nhiệm đề tài Họ và tên: Nguyễn Thị Hoàng Ngày, tháng, năm sinh: 16/04/1972 Nam/ Nữ: Nữ Học hàm, học vị: Thạc sĩ Chức danh khoa học: Chức vụ: Giám đốc Trung tâm Ứng dụng Công nghệ Sinh học Đồng Nai. Điện thoại: 0613.822297-8388 Tổ chức: 0613.82297-8600 Nhà riêng: 0613.952827 Mobile:0908174171 Fax: 0613.825585 E-mail: hoangnt@vnn.vn; dosthoang@gmail.com Tên tổ chức đang công tác: Trung tâm Ứng dụng Công nghệ Sinh học Đồng Nai. Địa chỉ tổ chức: 260 Phạm Văn Thuận, Phường Thống Nhất, Biên Hòa, Đồng Nai. Địa chỉ nhà riêng: 45 KP4, Phường Bửu Long, Biên Hòa, Đồng Nai. Đồng chủ nhiệm đè tài Họ và tên: PGS.TS. Hồ Huỳnh Thùy Dương Ngày, tháng, năm sinh: 19/10/1959 Nam/ Nữ: Nữ Học hàm, học vị: PGS Chức danh khoa học: PGS Chức vụ: Trưởng Phòng Đào tạo Sau Đại Học, Trưởng Bộ môn Di truyền Điện thoại: Tổ chức: 38350097 Nhà riêng: Mobile: 0918033123 Fax: 38304924 E-mail: hhtduong@hcmuns.edu.vn Tên tổ chức đang công tác: Trường Đại học Khoa học và Tự nhiên tp HCM Địa chỉ tổ chức: 227 Nguyễn Văn Cừ, Q.5, Tp HCM. Địa chỉ nhà riêng: 9 Thư ký đề tài Họ và tên: Trịnh Thị Thanh Huyền Ngày, tháng, năm sinh: 27/03/1985 Nam/ Nữ: Nữ Học hàm, học vị: Kỹ sư Chức danh khoa học: 3 Chức vụ: Chuyên viên sở Khoa học công nghệ Đồng Nai. Điện thoại: Tổ chức: 0613.82297 Nhà riêng: 0613990118 Mobile: 0917737270. Fax: 0613.825585 E-mail: thanhhuyencnsh@yahoo.com Tên tổ chức đang công tác: Trung tâm Ứng dụng Công nghệ sinh học-Sở Khoa học công nghệ Đồng Nai Địa chỉ tổ chức: 260, Phạm Văn Thuận, phường thống nhất, Biên Hòa, Đồng Nai Địa chỉ nhà riêng: 45D/Cư Xá Lắp Máy 45/4, Kp5, P.Trảng Dài, Biên Hòa, Đồng Nai 10 Tổ chức chủ trì đề tài Tên tổ chức chủ trì đề tài: Trung Tâm Ứng Dụng Công Nghệ Sinh Học - Sở Khoa Học Và Công Nghệ Đồng Nai Điện thoại: 0613.82297 Fax: 0613.825585 E-mail: Website: http://www.dost-dongnai.gov.vn Địa chỉ: 260, Phạm Văn Thuận, phường thống nhất, Biên Hòa, Đồng Nai Họ và tên thủ trưởng tổ chức: Giám đốc trung tâm: ThS.: Nguyễn Thị Hoàng Số tài khoản: 946.04.00.01266 tại Kho bạc Nhà nước Việt Nam Tên cơ quan chủ quản đề tài: Sở Khoa học và công nghệ tỉnh Đồng Nai 11 Các tổ chức phối hợp chính thực hiện đề tài (nếu có) 1. Tổ chức 1: Công ty TNHH CNSH Khoa Thương Điện thoại: (08)3761 2606 Fax: (08) 3761 2603 Địa chỉ: 17 Đường Số 4, KDC Gia Hòa, Phong Phú, Bình Chánh, TP. Hồ Chí Minh Họ và tên thủ trưởng tổ chức: Trần Mỹ Quan Số tài khoản: 9628359 Ngân hàng: Tại Ngân Hàng TMCP Á Châu (ACB) 2. Tổ chức 2: Chi Cục Thú Y Dồng Nai 4 Tên cơ quan chủ quản: Sở Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn Đồng Nai Điện thoại: Fax: Địa chỉ: Đường Đồng Khởi, KP3, P.Tam Hòa, TP Biên Hòa Họ và tên thủ trưởng tổ chức: Trần Văn Quang – Chi cục phó Chi cục Thú y Đồng Nai. Số tài khoản: Ngân hàng: 12 Các cán bộ thực hiện đề tài (Ghi những người có đóng góp khoa học và chủ trì thực hi ện những nội dung chính thuộc tổ chức chủ trì và tổ chức phối hợp tham gia thực hiện đề tài, không quá 10 ngư ời kể cả chủ nhiệm đề tài) Họ và tên, học hàm học vị Tổ chức công tác Nội dung công việc tham gia Thời gian làm việc cho đề tài (Số tháng quy đổi 2 ) 1 Nguyễn Thị Hoàng Sở Khoa Học & Công Nghệ Đồng Nai Chủ nhiệm đề tài – chịu trách nhiệm về điều phối thực hiện đề tài 24 2 Hồ Huỳnh Thùy Dương Trường ĐH Khoa Học Tự Nhiên – ĐHQG HCM Đồng chủ nhiệm đề tài – chịu trách nhiệm về nội dung nghiên cứu 12 3 Trần Văn Quang Chi cục Thú y Đồng Nai Chịu trách nhiệm quản lý nội dung lấy mẫu 18 2 Một (01) tháng quy đổi là tháng làm việc gồm 22 ngày, mỗi ngày làm việc gồm 8 tiếng 5 4 Nguyễn Tuấn Anh Công ty TNHH CNSH Khoa Thương Thành viên – chịu trách nhiệm thực hiện nội dung xây dựng các kit PRRSV và real-time PRRSV, TGEV/PEDV/rotavirus 24 5 Nguyễn Tân Lang Chi cục Thú y Đồng Nai Chịu trách nhiệm nội dung lấy mẫu 18 6 Trịnh Thị Thanh Huyền Trung Tâm Ứng Dụng Công Nghệ Sinh Học Đồng Nai Thành viên – chịu trách nhiệm nội dung nghiên cứu về bệnh tích trên bệnh tai xanh và tiêu chảy cấp 24 7 Đào Thụy Mỹ Châu Công ty TNHH CNSH Khoa Thương Thành viên – chịu trách nhiệm thực hiện nội dung xây dựng kit các vi khuẩn gây tiêu chảy cấp 12 8 Nguyễn Thành Khôi Công ty TNHH CNSH Khoa Thương Thành viên – chịu trách nhiệm thực hiện nội dung thiết kế và kiểm tra primer, probe cho các kit 12 II. MỤC TIÊU, NỘI DUNG KH&CN VÀ PHƯƠNG ÁN TỔ CHỨC THỰC HIỆN ĐỀ TÀI 13 Mục tiêu của đề tài (Bám sát và cụ thể hoá định hướng mục tiêu theo đặt hàng - nếu có) Xây dựng 04 bộ kit sinh học phân tử phát hiện nhanh bệnh “tai xanh” và tiêu chảy cấp ở heo nuôi, phân biệt chủng độc lực cao với chủng thường đối với tác nhân gây bệnh tai xanh, để kịp thời có biện pháp phòng trị bệnh trên heo nuôi tại địa bàn tỉnh Đồng Nai, gồm: 6 - 01 bộ kit PCR phát hiện PRRSV gây bệnh tai xanh (phân biệt chủng độc lực cao - đang gây khó khăn cho các phương pháp chẩn đoán khác - và chủng thường) - 01 bộ kit PCR multiplex phát hiện nhóm rotavirus, TGEV và PEDV gây bệnh tiêu chảy cấp - 01 bộ kit PCR multiplex phát hiện Salmonella spp., E. coli ETEC và Clostridium perfringens gây bệnh tiêu chảy cấp - 01 bộ kit real-time PCR phát hiện PRRSV 14 Tình trạng đề tài Mới Kế tiếp hướng nghiên cứu của chính nhóm tác giả Kế tiếp nghiên cứu của người khác 15 Tổng quan tình hình nghiên cứu, luận giải về mục tiêu và những nội dung nghiên cứu của Đề tài 15.1 Đánh giá tổng quan tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực của Đề tài Ngoài nước (Phân tích đánh giá được những công trình nghiên cứu có liên quan và những kết quả nghiên cứu mới nhất trong lĩnh vực nghiên cứu của đề tài; nêu được những bước tiến về trình độ KH&CN của những kết quả nghiên cứu đó) Bệnh “tai xanh” hay còn gọi là hội chứng hô hấp và sinh sản ở heo (PRRS – Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome) được ghi nhận lần đầu tiên ở Mỹ vào khoảng năm 1987. Tác nhân gây bệnh được xác định năm 1991, là virus RNA thuộc bộ Nidovirales, họ Arteriviridae, giống Arterivirus. Hai chủng chính được xác định gồm: (1) genotype 1 với prototype Lelystad (thường được gọi là chủng Châu Âu) và genotype 2 với prototype VR2332 (chủng Bắc Mỹ). Gần đây, một biến thể của genotype 2 có độc lực cao hơn đã gây nhiều tổn thất ở châu Á. Bệnh làm giảm tỉ lệ sinh sản, gây sảy thai, heo chết lúc sinh ở heo nái, và gây rối loạn hô hấp dẫn đến tử vong cho heo con. Bệnh có thể lây lan nhanh trong đàn heo trong 7-10 ngày. Theo Tổ chức Lương Nông Thế giới (FAO), các yếu tố chủ chốt kiểm soát và loại bỏ dịch PRRS bao gồm phát hiện bệnh sớm và có phương pháp phân tích nhanh và chính xác, nhận diện nhanh các đàn heo nhiễm và sử dụng những biện pháp dập tắt 7 dịch hiệu quả. Năm 2007, dịch PRRS xảy ra tại Trung Quốc làm chết gần 70.000 con heo và buộc nước này phải tiêu hủy khoảng 200.000 heo nghi bệnh tạo nên cơn sốt giá trên thị trường thịt lên đến 74.6%. Người ta cho rằng virus gây bệnh PRRS tại nước này là chủng Châu Mỹ độc lực cao. Chủng virus này sau đó cũng đã lây lan sang nhiều nước trên thế giới gây khó khăn, phức tạp trong quá trình chẩn đoán, phân biệt giữa chủng thường và chủng độc lực cao này. Các phương pháp chẩn đoán: (1) dựa trên biểu hiện lâm sàng không rõ ràng vì biểu hiện này biến động tùy thuộc chủng virus, tình trạng đàn heo, các yếu tố môi trường, (2) phân lập virus đối với PRRSV rất khó khăn, (3) huyết thanh học như phương pháp ELISA, và (4) RT- PCR. Phương pháp ELISA, với đại diện là kit HerdCkeck-PRRS  (IDEXX Laboratories Inc.) được sử dụng phổ biến do nhiều ưu điểm nhưng chỉ cho kết quả dương tính 9-13 ngày sau nhiễm. Theo khuyến cáo của Tổ chức Sức Khỏe Động vật (World Organisation for Animal Health) (2008), phương pháp RT-PCR cần được sử dụng trong việc kiểm soát tính sạch bệnh ở tinh dịch sử dụng trong thụ tinh nhân tạo và theo dõi các đàn heo nhiễm khi cần tái lập tình trạng sạch bệnh. Phương pháp RT-PCR đơn giản, ít tốn kém và nhanh hơn rất nhiều so với thử nghiệm có tên là “swine bioassay” vốn được xem là “tiêu chuẩn vàng” trong việc xác định PRRSV. Kỹ thuật RT-PCR nhạy hơn phân lập virus, có thể phát hiện 10 phần tử virus/ml tinh dịch và hoàn toàn đặc hiệu. Hai vùng gene bảo tồn cao là ORF 6 mã hoá protein màng và ORF 7 mã hoá protein nhân (nucleocapsid) thường được dùng để thiết kế primer (mồi) cho phản ứng RT-PCR phát hiện PRRSV. Một số vùng khác như ORF 5 mã hoá protein vỏ (envelope) được sử dụng khi cần phân biệt các chủng (chủng độc lực cao - chủng thường). Một số vaccine đã được thương mại hóa nhưng mỗi loại đều có ưu và nhược điểm, và điều quan trọng nhất là sử dụng đúng loại vaccine tùy theo chủng PRRSV lưu hành. Hiện nay vẫn chưa có khả năng phân biệt kháng thể do vaccine và kháng thể do virus từ môi trường. Đối với bệnh tiêu chảy cấp, các tác nhân gây bệnh rất đa dạng bao gồm virus, vi khuẩn và nguyên sinh động vật, trong đó virus là tác nhân gây hại lớn nhất. Nhìn chung. Clostridium perfringens được phát hiện trong 48 %, E. coli 20 %, C. difficile 10 %, rotavirus 8 9 % các trường hợp tiêu chảy cấp. Trong số các virus, nhóm rotavirus và hai coronavirus là PEDV (Porcine Epidemic Diarrhea Virus) và TGEV (Transmissible Gastroenteritis Virus) có khả năng lây nhiễm rất cao. PEDV được phân lập vào năm 1978 ở châu Âu nhưng tỉ lệ lưu hành ở châu Âu hiện nay đã giảm đáng kể. Trong khi đó ở châu Á từ những năm 1990, PEDV bắt đầu nổi lên như một tác nhân dịch bệnh quan trọng, đặc biệt là ở Hàn Quốc và Nhật Bản, với tỉ lệ gây chết lên đến 50 – 95 % ở heo con nhỏ hơn 2-3 tuần tuổi. PEDV là một virus RNA mạch đơn với bộ gene chứa các gene mã hóa cho các protein pol1 (P1), spike (S), envelope (E), membrane (M) và nucleocapsid (N); trong đó hai protein được quan tâm là protein S có chức năng gắn với thụ thể tế bào chủ và protein M tham gia vào quá trình “tự ráp” của virus. Cơ chế gây bệnh của PEDV bắt đầu với sự bám của protein S virus lên thụ thể aminopeptidase N trên bề mặt lông nhung ruột dẫn đến sự phá hủy biểu mô lông nhung. Điều này sẽ làm biến đổi quá trình tiêu hóa sữa, vận chuyển tế bào và hấp thụ chất dinh dưỡng ở heo con. Các phương pháp chẩn đoán dựa trên nuôi cấy phân lập virus, miễn dịch học, phổ biến là ELISA, sử dụng kính hiển vi điện tử, và một số phương pháp sinh học phân tử phổ biến là RT-PCR. Các phương pháp ELISA và PCR tiến hành trực tiếp trên phân hoặc trên mẫu mô ruột non heo. Trong phương pháp RT-PCR, primer sử dụng thường được thiết kế trong vùng gene S hay M. Hiện nay đã có một số vaccine được phát triển dựa trên chủng PPEDV-9 (Hàn Quốc) hay P- 5V (Nhật Bản), được chỉ định dùng cho heo nái nhưng chưa phổ biến. TGEV được phát hiện đầu tiên năm 1946 ở Hoa Kỳ, và được ghi nhận sau đó ở tất cả các nước có ngành chăn nuôi heo phát triển, gây tổn thất kinh tế lớn. Chỉ riêng ở Iowa (Hoa Kỳ) trong khoảng 1987-1988, tổn thất do TGEV gây ra cho đàn heo là 10 triệu USD. TGEV là một virus RNA mạch đơn có bộ gene với 8 mRNA: mRNA 2 (S), 3, 3-1, 4 (sM), 5 (M), 6 (N) và 7 mã hóa cho các protein S, sM, M, N và một protein màng. Tác hại TGEV gây ra trên đàn heo thay đổi tùy thuộc tình trạng miễn dịch của heo: (1) có thể gây chết 100 % heo con ở đàn chưa từng tiếp xúc với virus, (2) gây chết khoảng 20 % ở những đàn đã được miễn dịch một phần hoặc (3) gây những đợt dịch ngắt quãng ở những đàn trong đó heo nái đã được miễn dịch. Cơ chế gây bệnh tương tự như PEDV. Các phương pháp chẩn đoán giống 9 với trường hợp PEDV. Trong phương pháp RT-PCR phát hiện TGEV, primer sử dụng thường được thiết kế trong vùng gene N có tính bảo tồn cao. Vaccine thương mại hóa đối với TGEV đã xuất hiện từ 1966 nhưng chưa có vaccine nào tỏ ra thực sự hiệu quả; người ta vẫn đang tiếp tục cải tiến chúng. Rotavirus là một virus RNA mạch đôi thuộc họ Reoviridae, với bộ gene bao gồm 11 trình tự, mỗi trình tự mã hóa ít nhất một protein. Rotavirus được phân thành nhiều nhóm từ A đến G, trong đó các nhóm A, B, C và E có hiện diện ở heo nhưng nhóm A là nhóm phổ biến nhất ở heo con. Nhóm C cũng được xem là tác nhân gây rối loạn tiêu hóa ở heo mọi lứa tuổi tuy ít phổ biến hơn nhóm A. Rotavirus có tính bền cao trong môi trường. Cơ chế gây bệnh liên quan đến sự biến đổi các tế bào chịu trách nhiệm hấp thu chất dinh dưỡng ở ruột non, làm giảm hàm lượng enzyme lactase dẫn đến nôn mửa và tiêu chảy ở heo con. Đến 33 % heo con còn bú bị nhiễm có thể chết khi có dịch. Các phương pháp chẩn đoán bao gồm soi kính hiển vi điện tử, điện di phát hiện RNA virus trên gel polyacrylamide, các phương pháp miễn dịch học và sinh học phân tử, phổ biến nhất là RT-PCR. Trong phương pháp RT-PCR, primer thường được thiết kế trong vùng gene VP6 hay VP7 của bộ gene. Vaccine đã được phát triển nhưng chưa phổ biến đại trà ở nhiều quốc gia. Trong số các vi khuẩn gây tiêu chảy cấp ở heo con thì một số chủng E. coli, Salmonella spp. và Clostridium perfringens được xem là những tác nhân gây bệnh phổ biến. Các chủng E. coli gây độc đường ruột (ETEC – enterotoxigenic E. coli) gây bệnh thông qua việc tiết một số độc tố đường ruột như LT, STa (STI) và STb (STII). Các chủng này còn tạo ra các adhesin diềm (fimbrial), như K88 (F4), K99 (F5), 987P (F6), F41, và F18, giúp vi khuẩn bám vào bề mặt màng nhày ruột non. Một số ít chủng, được gọi là STEC (Shiga toxin-producing E. coli) có thể tạo cả độc tố Shiga (Shiga toxin) như Stx2e. Bên cạnh đó, một số chủng E. coli không tạo độc tố nhưng có khả năng làm tiêu biến các lông nhung của tế bào biểu mô ruột khi bám vào, chúng có tên là AEEC (Attaching and Effacing E. coli). Các phương pháp chẩn đoán đa dạng, bao gồm soi kính hiển vi, nuôi cấy định danh, nhuộm mô với Hematoxylin-eosin hay Wright-Giemsa, miễn dịch học phát hiện adhesin vi khuẩn, và các phương pháp sinh học phân tử, phổ biến là PCR. Phương pháp PCR cho phép phát 10 hiện các gen adhesin, các gene mã hóa độc tố đường ruột như LT, Sta, STb đối với chủng ETEC, gene Stxe đối với chủng STEC và eaeA đối với chủng AEEC. Clostridium là nhóm vi khuẩn được xem là tác nhân gây bệnh đường ruột phổ biến ở người và động vật. Trong đó C. perfringens là tác nhân gây bệnh đường ruột chính ở vật nuôi. Đây là một vi khuẩn Gram (+), kỵ khí, được phân thành nhiều type. C. perfringens type C từ lâu đã được biết là tác nhân phổ biến gây viêm ruột hoại tử xuất huyết ở heo con nhỏ hơn 10 ngày tuổi. Sau đó type A cũng được xem là có khả năng gây bệnh ở heo và nhiều động vật khác. Vi khuẩn này có thể tạo ra từ 1 đến 20 loại ngoại độc tố, trong đó có 5 loại chính , , ,  và CPE. Độc tố  đóng vai trò chủ chốt trong tính gây bệnh của C. perfringens type A. Còn ở type C người ta phát hiện cả hai loại độc tố  và  . Chẩn đoán hiện nay dựa trên việc phát hiện cả hai type với type A khó phát hiện hơn do không có biểu hiện biến đổi hình thái tế bào rõ ràng. Các phương pháp chẩn đoán chính bao gồm: chẩn đoán lâm sàng, soi kính hiển vi nhằm phát hiện các thương tổn mô và tế bào, nuôi cấy định danh, phát hiện các độc tố dựa trên kỹ thuật miễn dịch như ELISA hay tụ latex, và các phương pháp sinh học phân tử như lai phân tử và PCR. Các phương pháp sinh học phân tử chủ yếu tập trung phát hiện sự hiện diện của các gene độc tố như  ,  ,  ,  , và cpe. Phương pháp PCR đặc biệt hữu dụng để phát hiện các chủng độc khi biết rằng tương quan kiểu gene (có gene độc tố) và kiểu hình (tạo độc tố) gần bằng 100%. Salmonella cũng được xem là một tác nhân gây nên bệnh tiêu chảy cấp ở heo. Cho đến nay, đã có 4 serotype Salmonella thuộc loài Salmonella enterica là S. Typhimurium, S. Heidelberg, S. Agona, and S. Infantis được phát hiện ở heo bị bệnh trong các công trình nghiên cứu ở châu Âu và châu Mỹ (CDC, 2006), trong đó S. Typhimurium và S. Choleraesuis là hai serotype thường gặp nhất. Tuy nhiên, tại mỗi giai đoạn thường chỉ có một vài serotype Salmonella hoạt động nổi trội. Tại Mỹ, 1986 đến 1995 - serotype nổi bật là S. Choleraesuis; 1996 - S. Derby; 1997 và nhiều năm sau đó - S. Typhimurium; 2007, khảo sát trên 2175 mẫu - S. Typhimurium (n = 784), S. Derby (n = 386), S. Heidelberg (n = 164), S. Choleraesuis (n = 153), và S. Agona (n = 91). Cho đến hiện nay, phương phát hiện và định danh thông qua nuôi cấy vi khuẩn trên các môi trường chọn lọc được xem là tiêu chuẩn vàng [...]... ro và giải pháp khắc phục – nếu có Đề tài bao gồm hai nội dung chính: - Xây dựng các quy trình phát hiện các tác nhân gây bệnh tai xanh và tiêu chảy cấp ở heo - Tạo 4 kit chẩn đoán và thử nghiệm trên mẫu thực địa 1 Xây dựng các quy trình phát hiện các tác nhân gây bệnh tai xanh và tiêu chảy cấp ở heo Có 4 nhóm quy trình cần xây dựng là: quy trình xử lý mẫu và tách chiết RNA, DNA, quy trình PCR và. .. Đối với các tác nhân gây tiêu chảy cấp PEDV và TGEV, đã có đề tài luận văn Thạc sĩ của Vũ Thị Lan Hương (2007) nghiên cứu về tình hình phơi nhiễm ở heo với các tác nhân này bằng phương pháp ELISA Không thấy công trình công bố trên nhóm rotavirus gây tiêu chảy cấp ở Việt Nam Đối với các vi khuẩn gây tiêu chảy cấp trên heo, công trình của Hideki Kobayashi và cộng sự (2003) tiến hành trên mẫu heo và mẫu... phải đạt các mốc đánh giá chủ yếu (bắt đầu, kết Cá nhân, tổ chức thực hiện* Dự kiến kinh phí thúc) 1 2 1 3 4 5 Nội dung 1: Xây dựng các quy trình phát hiện các tác nhân gây bệnh tai xanh và tiêu chảy cấp ở heo Công việc 1: Thu mẫu thực - 500 mẫu heo bệnh địa và thu thập thông tin về tai xanh 6 tháng TT UDCNSH DN, 23 6 tình hình heo bệnh CCTYĐN - 500 mẫu heo bệnh tiêu chảy cấp Công việc 2: Xây dựng. .. tác nhân gây bệnh trên mẫu huyết thanh Dựa vào các nguyên lý hoạt động của các phương pháp chẩn đóan sinh học phân tử thì phương pháp PCR hoàn toàn có thể phân biệt nhờ thiết kế primer đặc hiệu cho mỗi chủng và thí nghiệm cũng có thể tiến hành trên mẫu huyết thanh hay các loại mẫu khác Hiện nay ngoài dịch tai xanh còn có bệnh tiêu chảy cấp có thể có xu hướng phát triển thành dịch Bệnh đe doạ nhóm heo. .. quả cho các kit ELISA vẫn được sử dụng hiện nay (ELISA khó phân biệt kháng thể do tiêm vaccine hay kháng thể do mầm bệnh) Chúng tôi tiến hành xây dựng các kit phát hiện các tác nhân gây bệnh tai xanh và tiêu chảy cấp trên heo có tính chính xác cao với mục đích góp phần vào công tác kiểm soát các dịch trên ở địa bàn tỉnh Đồng Nai nói riêng và các địa phương khác có nhu cầu 16 Liệt kê danh mục các công... bệnh phẩm đó nhiễm loại tác nhân nào Phương pháp mulplex PCR sẽ cho phép ta phát hiện và chỉ ra chính xác một loại hoặc đồng 14 thời các loại tác nhân nên rất phù hợp với mục tiêu này Việc xây dựng các phương pháp chẩn đoán nhanh, chính xác các tác nhân gây bệnh để kịp thời phát hiện ổ dịch, cách ly và tìm phương pháp xử lý là cần thiết Phương pháp PCR có độ nhạy, độ đặc hiệu cao và thời gian tiến hành... tìm ra một phương pháp chẩn đóan nhanh chóng, chính xác các tác nhân gây bệnh để kịp thời phòng ngừa đặc biệt từ đàn heo giống nhập về Bệnh do nhiều tác nhân gây ra nhưng chúng lại có triệu chứng tương tự nhau; mỗi loại tác nhân đòi hỏi phải có những biện pháp phù hợp để phòng ngừa, chẩn trị Để giải quyết vần đề này phải có một phương pháp chẩn đoán đồng thời các tác nhân trên và xác định mẫu bệnh phẩm... tài với các cơ quan chức năng - Điều phối kinh phí nghiên cứu Nhân lực: 02 2 Công ty TNHH CNSH Khoa Thương (CT TNHH CNSH KT) - Xây dựng các quy trình nhằm phát hiện các tác nhân gây bệnh tai xanh và tiêu chảy cấp ở heo đã đăng ký - Áp dụng các quy trình đã xây dựng vào việc tạo 4 loại kit như đã đăng ký; kiểm tra khả năng sử dụng thực tế của các kit này - Đào tạo và chuyển giao kỹ thuật cho các thành... tinh sạch và dạng khuẩn lạc Khi cần thiết khuẩn lạc được nuôi cấy tăng sinh và plasmid tái tổ hợp được tách chiết và tinh sạch cho sử dụng Từ các quy trình thiết lập ở trên, chúng tôi tiến hành xây dựng các kit 19 2 Tạo 4 kit chẩn đoán và thử nghiệm kit trên mẫu thực địa 2.1 Tạo 4 loại kit bao gồm kit real-time RT-PCR PRRSV, kit RT-PCR momoplex PRRSV, kit RT-PCR multiplex PEDV/TGEV/rotavirus và kit PCR... Thử nghiệm các - Kết quả thử các kit kit trên một số mẫu thực địa trên 100 mẫu heo và đánh giá thông qua so sánh mắc bệnh tai xanh với kết quả Southern blot và và 100 mẫu heo mắc kết quả giải trình tự trên một bệnh tiêu chảy cấp số mẫu đại diện - Kết quả Southern blot trên 10 mẫu đại diện cho mỗi tác 26 2 tháng CT TNHH CNSH KT nhân - Kết quả giải trình tự của 10 mẫu đại diện cho mỗi tác nhân * Chỉ . KHOA HỌC VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ 1 I. THÔNG TIN CHUNG VỀ ĐỀ TÀI 1 Tên đề tài XÂY DỰNG CÁC KIT CHẨN ĐOÁN TÁC NHÂN GÂY BỆNH TAI XANH VÀ BỆNH TIÊU CHẢY CẤP TRÊN HEO NUÔI BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH. bộ kit sinh học phân tử phát hiện nhanh bệnh tai xanh và tiêu chảy cấp ở heo nuôi, phân biệt chủng độc lực cao với chủng thường đối với tác nhân gây bệnh tai xanh, để kịp thời có biện pháp. latex, và các phương pháp sinh học phân tử như lai phân tử và PCR. Các phương pháp sinh học phân tử chủ yếu tập trung phát hiện sự hiện diện của các gene độc tố như  ,  ,  ,  , và cpe. Phương