Asen tồn tại trong tự nhiên ở dạng Asen hữu cơ và Asen vô cơ (iAs), dạng Asen vô cơ có độc tính cao hơn dạng Asen hữu cơ. Thủy hải sản là một nguồn tích tụ Asen sinh học, hàm lượng Asen tổng trong các sinh vật của thủy quyển luôn cao hơn nhiều so với các loài động vật trên đất liền, việc đánh giá chất lượng thủy hải sản thông qua hàm lượng Asen tổng là không chính xác.
Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 Nghiên cứu Y học XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH ASEN VƠ CƠ TRONG CÁ BẰNG PHƯƠNG PHÁP LC – ICP/MS Nguyễn Hữu Phát*, Cù Hồng Yến* TĨM TẮT Đặt vấn đề: Asen tồn tự nhiên dạng Asen hữu Asen vơ (iAs), dạng Asen vơ có độc tính cao dạng Asen hữu Thủy hải sản nguồn tích tụ Asen sinh học, hàm lượng Asen tổng sinh vật thủy cao nhiều so với loài động vật đất liền, việc đánh giá chất lượng thủy hải sản thơng qua hàm lượng Asen tổng khơng xác Để đánh giá xác chất lượng thủy hải sản, việc xác định dạng tồn khác Asen cần thiết, kỹ thuật sắc ký lỏng kết nối khối phổ plasma (LC-ICP/MS) lựa chọn hàng đầu với ưu điểm lượng mẫu ít, độ chọn lọc độ nhạy cao Mục tiêu nghiên cứu: Xây dựng quy trình xác định Asen vơ cá phương pháp LC-ICP/MS Phương pháp nghiên cứu: Khảo sát trình tách định lượng Asen vô khỏi dạng Asen hữu cá nước nước mặn cột trao đổi anion hệ thống sắc ký lỏng kết nối khối phổ plasma Kết nghiên cứu: Quy trình xác định Asen vơ cá phương pháp LC-ICP/MS có giới hạn phát (MLOD) giới hạn định lượng (MLOQ) 15 ng/g 50 ng/g Độ lặp lại phương pháp nồng độ iAs 50, 1000 2000 ng/g có RSD < 15%, hiệu suất thu hồi nồng độ tương ứng dao động từ 97,9-99,1% độ không đảm bảo đo phương pháp 11% Kết luận: Phương pháp sắc ký lỏng kết nối khối phổ plasma sử dụng cột trao đổi anion phương pháp phân tích xác để định lượng Asen vơ mẫu cá Từ khóa: Asen vơ cơ, cá, LC-ICP/MS ABSTRACT DEVELOPMENT OF LIQUID CHROMATOGRAPHY-INDUCTIVELY COUPLED PLASMA MASS SPECTROMETRY METHOD FOR THE DETERMINATION OF INORGANIC ARSENIC IN FISH Nguyen Huu Phat, Cu Hoang Yen * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Supplement of Vol 20 - No - 2016: 381 - 386 Background: Arsenic is usually divided into two main groups: organic arsenic form and inorganic arsenic form (iAs) in natural environment The inorganic forms of arsenic are more toxic than organic form Arsenic does bio accumulate in seafood Total arsenic level of organisms in the hydrosphere are always higher than landanimals Quality evaluation of aquatic products through total arsenic levels are inaccuracy Recently, HPLC followed by detection using ICP-MS allows low sample volume injection, with high selectivity and high sensitivity Objectives: Establishment of a new method for determination of inorganic arsenic in fish by LC-ICP-MS Methods: Survey of separation and quantification inorganic arsenic species are conducted by anion exchange liquid chromatography inductively coupled plasma - mass spectrometry Results: The limits of determination (MLOD) and the limits of quantitation (MLOQ) for iAs in fish were 15ng/g and 50ng/g respectively At three fortification levels (50 – 1000 – 2000 ng/g), the overall recoveries range from 97.9 to 99.1% with RSD values less than 15% * Viện Y tế Cơng cộng TP Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: Ths Nguyễn Hữu Phát Chuyên Đề Y Tế Công Cộng ĐT: 0969241883 Email: huuphatk@gmail.com 381 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 Conclusion: Anion exchange liquid chromatography inductively coupled plasma - mass spectrometry was accurate analytical method for quantitation of inorganic arsenic in fish samples Keywords: inorganic Arsenic, fish, LC-ICP/MS ĐẶT VẤN ĐỀ: Thủy hải sản nguồn tích tụ Asen sinh học vơ lớn tự nhiên, hàm lượng Asen tổng sinh vật thủy cao nhiều so với loài động vật đất liền Tuy nhiên, q trình chuyển hóa Asen thủy thường tạo hợp chất Asenbetoine, dạng Asen hữu bền độc tính thấp(3) Trong lồi tơm cá, hàm lượng Asen vô thường thấp 0,1 % tổng số Asen có sinh vật DMA (dimethylarsinic acid) MMA (monomethylarsonic acid, monomethylarsonous acid) tồn lượng thấp thủy hải sản, số lồi cá ngừ thường khơng tích tụ DMA, MMA thể(2) Như vậy, việc đánh giá chất lượng mặt hàng thủy hải sản thông qua hàm lượng Asen tổng khơng xác Các kết phân tích cơng bố gây ảnh hưởng không nhỏ đến nhà sản xuất gây bất an dư luận Hiện kỹ thuật LC-ICP/MS lựa chọn hàng đầu cho ứng dụng phân tích dạng tồn khác Asen Kỹ thuật có ưu điểm lượng mẫu ít, độ nhạy cao(4) Hai dạng sắc ký lỏng thường dùng phân tích nguyên dạng Asen sắc ký ghép cặp ion sắc ký trao đổi ion (trao đổi anion cation) Tuy nhiên, để phân tích nguyên dạng Asen vô (tồn dạng anion môi trường trung tính kiềm), phương pháp sắc ký trao đổi anion nhà khoa học giới lựa chọn nghiên cứu tác giả LAsen – 2005(5), Sang-Ho Nam – 2006(6), Georg Raber – 2012(7), Rasmussen – 2012(8) dùng phương pháp đề xuất quan kiểm soát chất lượng thực phẩm Hoa Kỳ (FDA – EAM 4-11) với hãng thiết bị LC-ICP/MS (Agilent, PerkinElmer) 382 Nhằm phục vụ cơng tác đảm bảo an tồn vệ sinh thực phẩm, cụ thể kiểm sốt hàm lượng Asen vơ sản phẩm cá, tiến hành thực xây dựng quy trình xác định Asen vơ cá phương pháp LCICP/MS cột trao đổi anion Mục tiêu nghiên cứu: Xây dựng quy trình xác định Asen vô cá phương pháp LC-ICP/MS ĐỐITƯỢNG-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU Đối tượng nghiên cứu Quy trình xác định Asen vô mẫu cá nước cá nước mặn thiết bị sắc ký lỏng kết nối quang phổ ghép cặp plama đầu dò khối phổ Phương pháp nghiên cứu Thiết bị Cân phân tích (độ nhạy 0,1 mg), máy xử lý mẫu vi sóng ETHOS-1, máy vortex, cột sắc ký PRP-X100 (150mm × 4,1 mm (id), anion exchange – HAMILTON), hệ thống LCICP/MS AGILENT 7700x Hóa chất Nước cất siêu — 18 MΩ; Ammonium hydroxide suprapur (NH4OH 25%), Hydrochloric acid (HCl 37%), Nitric acid (HNO3 65%), Hydrogen peroxide (H2O2 30%), Ammonium carbonate ((NH4)2CO3), Asenate Stock Standard (As(V)) 1000 mg/L MERCK, Asenite Stock Standard (As(III)) 1000 mg/L INORGANIC VENTURE, Dimethylarsinic acid (DMA), Disodium methyl arsonate hexahydrate (monomethylarsonic acid, MMA), Asenobetaine (AsB) SIGMA ALDRICH Điều kiện sắc ký lỏng kết nối khối phổ plasma (LC-ICP/MS): Sử dụng thiết bị LC-ICP/MS với kỹ thuật sắc ký trao đổi anion môi trường pH 8,5 để Chuyên Đề Y Tế Cơng Cộng Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 tách dạng Asen (V) khỏi dạng Asen hữu Các thơng số cụ thể trình bày Nghiên cứu Y học bảng Bảng 1: Điều kiện vận hành thiết bị LC-ICP/MS ICP/MS Năng lượng Dòng Argon tạo plasma Khí phụ trợ Khí mang Kiểu phun sương Độ sâu torch Tốc độ bơm Nhiệt độ buồng phun sương Bộ va chạm Khối ion Thời gian lấy tín hiệu Xử lý mẫu Asen mẫu cá chiết khỏi mẫu hỗn hợp dịch chiết (HCl 0,06 M – 3% H2O2) lò vi sóng 25 phút nhiệt độ 900C Sau mẫu ly tâm 10 phút với tốc độ 4500 vòng/phút, lọc qua màng lọc 0,45 µL pha lỗng với tỉ lệ 1: (NH4)2CO3 60mM(8) Xác định thông số phương pháp (a) Độ chọn lọc phương pháp LCICP/MS xác định dựa số khối đặc trưng Asen khả phân tách cột sắc ký (b) Độ tuyến tính đánh giá thơng qua hệ số tương quan r > 0,997 phương trình hồi quy đường chuẩn thể mối tương quan tỷ lệ diện tích peak sắc ký nồng độ chất phân tích (c) Giới hạn phát (MLOD) giới hạn định lượng (MLOQ) phương pháp thực thí nghiệm tính tốn theo hệ số R với lượng thêm chuẩn 50 ng/g, giá trị MLODđược xác định sau: R LOD SD LC 1500 W 15 L/phút 1,0 L/phút Tùy thuộc vào chế độ Auto Tune Glass concentric Tùy thuộc vào chế độ Auto Tune 0,3 vòng/phút (~1 mL/phút) 2°C Khơng sử dụng nhằm tăng tín hiệu m/z 75 0,8 s (m/z 75) x LOD Nếu < R < 10 giá trị MLOD phù hợp đáng tin cậy, < R thỉ cần thêm chuẩn nồng độ cao thực lại thí nghiệm, tính tốn lại giá trị R, R > 10 cần thêm chuẩn nồng Chuyên Đề Y Tế Công Cộng Pha động pH Tốc độ dòng Thể tích tiêm Loại khí Nhiệt độ cột 30 mM (NH4)2CO3 8,50 (± 0,05) 1,0 mL/phút 100 µL Có Nhiệt độ phòng Loại cột 150mm×4,1 mm (id) Hamilton PRP-X100 anion exchange Thời gian lấy tín hiệu 10 phút độ thấp thực lại thí nghiệm, tính tốn lại giá trị R (d) Độ xác độ phương pháp đánh giá thông qua độ lặp lại với độ tái lặp nội (RSD %) hiệu suất thu hồi H (%) mẫu thêm chuẩn nồng độ: 50 ng/g, 1000 ng/g 2000 ng/g Độ lặp lại thực kiểm nghiệm viên độ tái lặp nội thực tương tự với kiểm nghiệm viên khác Hệ số RSD (%) phải < 15% H (%) phải nằm khoảng 75 – 125% (e) Độ khơng đảm bảo đo tính tốn theo độ tái lặp nội phòng thí nghiệm độ chệch phương pháp KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Điều kiện phân tích LC-ICP/MS Sau áp dụng thông số sắc ký lỏng khối phổ vào phân tích dịch chiết mẫu cá lóc thêm chuẩn dạng Asen: DMA, MMA, AsB, As(III), As(V) Kết thu sắc ký đồ hình Từ sắc ký đồ mẫu thực thấy cá tồn lượng đáng kể dạng Asen hữu không tương tác với cột sắc ký AsB dùng chất đại diện cho tất dạng Asen hữu khơng có tương tác với cột sắc ký trao đổi anion (dạng Asen hữu dạng cation trung hòa) Bên cạnh đó, với pha động lựa chọn, dạng As(V) cần phân tích tách tốt khỏi 383 Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 Nghiên cứu Y học dạng Asen khác thời gian phân tích cho mẫu tương đối ngắn giúp giảm lượng muối đóng vào gây tắc nghẽn thiết bị pháp chiết cho thấy khơng có khác biệt kết (bảng 2), tthực nghiệm ( 1,50) < tlý thuyết (2,07) Như khẳng định dung dịch chiết (HCl 0,06 M – H2O2 3%) chiết toàn dạng Asen khỏi mẫu thời gian 25 phút nhiệt độ 90oC Đánh giá khả oxi hóa As (III) Sau thêm chuẩn mức nồng độ 50, 1000 2000 ng/g As(III) vào mẫu cá lóc Hiệu suất oxy hóa As(III) đánh giá thơng qua tỷ lệ nồng độ As(V) có dịch chiết nồng độ As(III) thêm vào ban đầu Thực phân tích mẫu thêm chuẩn ghi nhận lượng As(V) có dịch chiết, kết bảng Mẫu cá lóc A Bảng 3: Khả oxi hóa As(III) dung dịch chiết Hình 1: Sắc ký đồ mẫu thật mẫu thêm chuẩn hỗn hợp dạng Asen Đánh giá khả chiết Phân tích mẫu sau vơ hóa theo AOAC 986.15 (xử lý khô - ướt kết hợp) chiết theo quy trình tác giả Rasmussen, kết thể bảng Bảng 2: Kết phân tích Asen tổng mẫu cá lóc theo phương pháp AOAC 986.15 phương pháp chiết theo quy trình tác giả Rasmussen(1,8) Hàm lượng As trung bình (ng/g) Hàm lượng As lớn (ng/g) Hàm lượng As nhỏ (ng/g) %RSD 38,3 48,4 33,2 9,8 39,7 45,7 32,9 10 Công cụ “t-Test: Paired Two Sample for Means” phần mềm EXCEL – 2010 sử dụng nhằm so sánh kết phân tích hàm lượng Asen tổng mẫu cá lóc phương pháp vơ hóa theo AOAC 986.15 phương Nồng độ As (III) thêm vào mẫu(ng/g) Nồng độ As (V) (ng/g) %RSD H% trung bình H% Min H% Max 50 1000 2000 51,5 3,00 103,0 97,0 109,0 1005 4,74 100,4 94,0 109,5 1915 4,58 95,8 87,3 102,5 Khảo sát khả oxy hóa dịch chiết cho thấy 95,8% As(III) (ở mức 2000 ng/g) 100% As(III) (ở mức 50, 1000 ng/g) oxy hóa thành As(V), dạng Asen hữu hồn tồn khơng bị phân hủy thành As(V) (ở mức 2000 ng/g) Đánh giá độ bền Asen hữu Asen hữu thêm vào mẫu sau trải qua q trình xử lý mẫu nhằm đánh giá khả bị phân hủy thành As(V) gây sai lệch dương cho kết phân tích Hàm lượng As(V) dịch chiết thí nghiệm thấp dạng Asen hữu bền Bảng 4: Độ bền Asen hữu dịch chiết STT 10 384 DMA (ppb) MMA (ppb) 2000 2000 2000 2000 2000 2000 2000 2000 2000 2000 2000 2000 2000 2000 2000 2000 2000 2000 2000 2000 AsB (ppb) As(V) (ppb) 2000