Xây dựng quy trình xác định tạp đối quang lamivudin điện dì mao quản có sử dụng chất chọn lọc đối quang Nguyễn Thị Thao*, Thái Nguyễn Hùng Thu*, Lê Đình Chi** *Trường Đại học DượcHà Nội **Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương SUMMARY A simple, selective cydodextrin-based Œ m ethod has been developed for the determ ination o f enantiom eric im purity oflam ivudine This m ethod was carried o u t in a fused-silica capillary (effective length 60 cm, inner diameter 50 ịum) w ith a 30 m M solution o f tris(hydroxymethyl) aminomethane, adjusted to pH 2.5, containing 0.5% iw /v) o f carboxym ethyl-^-cydodextrin per m ililitre as electrolyte The m ethod was validated in terms o f specificity, linerity, accuracy, precision, lim it o f quantification (LOQ) and lim it o f detection (LOD) Từ khóa: capillary electrophoresis, cyclodextrin, enantiom eric impurity, lamivudin Đặt Vấn đề Lamivudin m ột hợp chất có hoạt tính kháng virus sử dụng rộng rãi điểu trị HIV/AIDS bệnh nhiễm virus khác Hoạt chất m ột phân đối quang tinh khiết nên m ột tiêu chất lượng cần lưu tâm kiểm soát giới hạn tạp đối quang lamivudin Cho tới nay, Dược điển Việt Nam IV[1] USP 32 [2] quỵ định kiểm tra tạp chất đối quang nguyên liệu lamivudin sắc ký lỏng với cột hoạt quang gắn p-cyclodextrin với giới hạn cho phép 0,3% Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu th iết lập phương pháp xác định tạp đối quang lamivudin chế phẩm thuốc Do đó, nghiên cứu sử dụng phương pháp điện di mao quản với chất chọn lọc hoạt quang carboxymethỵlp-cyclodextrin (CMCD), m ột chất chọn lọc hoạt quang ứng dụng thành công việc tách đồng phân đối quang nhiểu hợp chất có hoạt tính dược lý [3, 4] để xác định tạp đối quang lamivudin m ột số chê' phẩm thuốc chứa lamivudin Đối tượng phưomg pháp nghiên cứu Nguyên vật liệu - Chất đối chiếu Lamivudin (Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương), SKS: VVS.0209146, hàm lượng 99,42 % theo nguyên trạng - Chuẩn USP Lamivudin Resolution M ixture A (RMA) Lô P0D024, chứa 98,9 % lamivudin 1,1 % 122 Nghiên Cứu duọc Thống tlnthuõc' Sỗ 4/2011 đồng phân đổi quang lamivudin theo nguyên trạng - Viên nén Nevilas (Hetero Drugs Ltd, Ấn Độ), lô AI 00452, hạn dùng 07/2012, có 150mg lamivudin, 30 mg stavudin, 200 mg nevirapin viên - Viên nén Stavudin & Lamivudin (Strides Arcolab Limited, Ấn Độ), lô 7209028, hạn dùng 09/2011, có 150 mg lamivudin, 30 mg stavudin viên - Viên nén Lam ivudin/Zidovudin (Matrix Laboratory Limited, Ấn Độ), lô 1025182, hạn dùng 11/2011, có 150 mg Lamivudin, 300mg zidovudin viên - Hóa chất tinh khiết phân tích: Acid phosphoric 85% (Merck), natri hydroxyd (Merck), carboxymethylp-cỵclodextrin (Sigma-Aldrich), tris(hỵdroxymethyl) aminomethan (Merck) Thiết bị - Máy điện di mao quản Hewlett PackardSECE (Mỹ) trang bị detector PDA - Máy đo pH Metrohm 691 (Đức) - Bộ lọc nước siêu tinh khiết Elga (Đức) - Cân phân tích M ettler Toledo AB204S có độ xác tới , mg - Dụng cụ thủy tinh xác loại A (bình định mức, pipet ), màng lọc , |am Phương pháp nghiên cứu - Dựa vào tính chất lamivudin tạp phân đối quang lamivudin thay đổi điểu kiện thực nghiệm để chọn thông sổ điện di tách đối tượng nghiên cứu thẩm định phương -ẩ pháp xác định tạp đối quang lamivudin - Tính toán xử lý thống kê kết Microsoft Excel Thực nghiệm kết Xây dựng phương pháp xác định tạp đối quang lamivudin bàng CE Qua khảo sát điều kiện vể: nồng độ CMCD, pH dung dịch điện ly nền, loại dung dịch điện lỵ sử dụng, điểu kiện xử lý, cân mao quản, điện chạy điện di, bước sóng d ete cto r điều kiện điện di chọn chuẩn bị sau: - Mao quản silica nung chảy (chiểu dài hữu ích 60 cm, đường kính 50 |am) -Đ iện th ế :+ 25 kv - Nhiệt độ mao quản: 25°c - Áp suất, thời gian tiêm mẫu: 50 mbar X giây - Detector PDA đặt bước sóng 270 nm - Dung dịch điện di: Lựa chọn dung dịch TRIS 30 mM làm dung dịch điện ly CMCD làm chất chọn lọc đổi quang, khảo sát sơ điểu kiện khác dung dịch điện di với nồng độ CMCD dao động từ 0,3 - 0,75% (kl/tt) pH dung dịch điện ly thay đổi từ 2,5 - 4,5 Kết khảo sát cho thấy dung dịch TRIS 30 mM điểu chỉnh đến pH 2,5 acid phosphoric 85% chứa CMCD nống độ 0,5 % (kl/tt) điều kiện tối ưu để tách lamivudin đồng phân đối quang lamivudin - Quy trình rửa mao quản: Mao quản trước sử dụng hoạt hóa dung dịch NaOH 0,1 M 60 phút, sau rửa nước trao đổi ion 10 phút Trong trình phân tích trước lẩn chạy điện di, rửa mao quản theo thứtự: nước trao đổi ion phút, dung dịch NaOH 0,1 M phút, nước trao đổi ion phút, dung dịch điện di phút Khi kết thúc ngày làm việc, rửa mao quản theo thứ tự: nước trao đổi ion phút, dung dịch NaOH 0,1 M phút, nước trao đổi ion phút Bảo quản mao quản cách làm đầy mao quản nước trao đổi ion - Chuẩn bị dung dịch; + Dung dịch chuẩn USP Lamivudin Resolution M ixture A (RMA - chứa 1,1% tạp đổi quang lamivudin) chuẩn bị nước trao đổi ion có nóng độ tạp đổi quang lamivudin xác khoảng 2,75 |jg/m l (tương ứng với nồng độ tổng RMA khoảng 0,25 m g/ml) Lọc qua màng lọc 0,2 Ịitn + Dung dịch chuẩn lamivudin: chuẩn bị nước trao đổi ion, có nồng độ lamivudin xác khoảng 0,25 mg/m l + Dung dịch thử: hòa tan bột viên đâ nghiển mịn (với chê' phẩm dạng viên) pha loãng chế phẩm (với chê phẩm dạng dung dịch) nước trao đổi ion để thu dung dịch có nồng độ lamivudin xác khoảng 0,25 m g/m l Lọc qua màng lọc 0,2 |jm Thẩm định phương pháp xác định tạp đối quang lamivudin Đ ôđảchiêu \ỉ Hình Két khảo sứ độ độc hiệu ũìchuănRMA, bìíĩiẵu viên nén Hevks, c) ĩĩìỗu viên nén Nevỉlos có thêm lỉMA với nóng đậ top đối quang lò l,67ụg/ml Thêm RMA vào chế phẩm Nevilas (đã kiểm tra trước tạp đổi quang lamivudin) để có nồng độ tạp đối quang lamivudin thêm vào mức xấp xỉ l,67ng/m l Kết thực nghiệm cho thấy, phân tích quỵ trình thiết lập, pic tạp đổi quang lamivudin không trùng với pic nển mẫu chế phẩm (Hình 1b) tách riêng khỏi lamivudin chuẩn RMA (Hình la) mẫu có thêm chuẩn (Hình 1c) Như vậy, quy trình xây dựng đảm bảo độ đặc hiệu xác định tạp đối quang lamivudin chê' phẩm thuốc chứa lamivudin, kể chế phẩm đa thành phần Độ tuyến tính Kết xác định diện tích pic nổng độ khoảng nống độ tạp đối quang lamivudin từ 1,67|jg/ml đến 8,36 ụg/m l trình bày Bảng sau lẩn phân tích có độ lặp lại tố t (RSD = 5,36 %) tỷ lệ tìm lại đạt 100,4% (dao động khoảng 92,6 - 107,3 %) nống độ tương đương giới hạn định lượng Như vậy, quy trình xây dựng có độ đúng, độ lặp lại phù hợp cho việc phân tích tạp đối quang lamivudin chế phẩm có hoạt chất Độ xác trung gian phương pháp xác định qua so sánh kết lẩn phân tích đánh giá độ lặp lại với lán phân tích độc lập thực khác ngày mẫu chế phẩm Qua lần phân tích thực nghiệm, phương pháp thể độ xác trung gian tương đối tố t với RSD 5,29% Bảng Két quổ đánh giá độ lặp lợi rà độ đóngphân đói quang cũũlũíĩìmền TT Bàng Ouơnhệ diện tíchpic vò nóng độ tạp đỗi quang cùũlũmivudin Nóng độ c ([ig/ml) Diện tích picS (mV.s) 1,67 2,79 4,18 5,57 : 2,485 5,035 7,898 ỉ 10,658 8,36 16,156 Trong khoảng nồng độ khảo sát có tương quan tuyến tính chặt chẽ diện tích pic nồng độ tạp đổi quang lamivudin với hệ số tương quan r 0,9997 Phương trình hồi quỵ tuyến tính: s = 2,03 c - 0,72 Độ lặp lại, độ Độ độ lặp lại quy trình tiến hành kết hợp đánh giá mẫu tự tạo cách thêm xác tạp đối quang lamivudin (dưới dạng chuẩn RMA) vào nến viên nén Nevilas (đã kiểm tra trước tạp đối quang lamivudin) Mẫu tự tạo chuẩn bị sau; cân m ột lượng xác bột viên nghiền mịn cho nống độ lamivudin nển mẫu đạt khoảng 0,25 m g/m l Thêm xác m ột lượng RMA cho nồng độ đồng phân đổi quang lamivudin dung dịch thu đạt khoảng 1,67ng/ml Cho vào bình định mức ml, thêm 15 ml nước trao đổi ion vào bình, lắc siêu âm phút, thêm nước trao đổi ion đến vạch, lắc đểu, lọc qua giấy lọc màng lọc 0,2 um Sở dĩ lựa chọn khảo sát độ mức nồng độ 1,67|jg/nnl đóng phân đối quang lamivudin kết thực nghiệm cho thấy giới hạn định lượng quy trình với hợp chất nên đánh giá độ có ý nghĩa phân đối quang lamivudin m ột tạp chất Kết Bảng cho thấy, nống độ tạp đổi quang lamivudin xác định mẫu tự tạo 124 Nghiên Cứu dược Thòng tin thuớc Sỗ 4/201 ì Lượng bột viên nến mẫu thử (mg) 22,1 21,7 20,9 215 23,6 21,4 23,1 21.4 223 Trunq bình Diện tích pic đóng phân đỗi quang cùa lamivudln (mV.s) 2,419 2,916 2,708 2,519 2,709 2,824 2,633 2,542 im Nóng độ tạp đói quang lamivudin tìm tháy mẫu tự tạo (liq/ml) 1,55 1.79 1,69 1.60 1,59 1,75 1.75 1,69 1,84 "^ RSD(%) ^ V I 5,29 Tỷ lệ tìm lai (%) 92.6 107J 101,1 95,6 101,2 104,5 (**) (*•) {**) 100,4 5,36 Gtìictìú: (**) két quáphân tích độclộp khóc ngòỵ Giới hạn định lượng, giới hạn phát Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) phương pháp xác định cách pha loãng dẩn dung dịch chuẩn RMA nhiều mức độ khác nhau, so sánh đáp ứng pic phân đối quang lamivudin với dao động đường Với nồng độ phân đối quang lamivudin khoảng 1,67|jg/ml, đáp ứng pic thu điện di đổ đểu cao lẩn so với dao động đường Tương tự, nóng độ đồng phân đối quang lamivudin 0,51|jg/nnl, đáp ứng pic điện di đỗ đểu cao lẩn so với dao động đường Như vậy, LOD LOQ phương pháp lẩn lượt 0,51|jg/ml 1,67|ag/ml, tính nồng độ tạp đối quang lamivudin dung dịch tiêm vào hệ thống điện di Với nống độ lamivudin dung dịch thử khoảng 0,25 m g/m l, giới hạn phát tương đương với tỷ lệ tạp đống phân đối quang ,2 % Trong dược điển quy định giới hạn tạp phân đối quang nguyên liệu lamivudin 0,3 % [1,2], quy trình thiết lập ề có giới hạn phát thấp hơn, hoàn toàn đáp ứng yêu cầu dược điển ứng dụng kiểm tra tạp đối quang lamivudin số chế phẩm Phương pháp áp dụng để kiểm tra tạp đối quang lamivudin chế phẩm viên nén Lamivudin/Zidovudin, Stavudin & Lamivudin Nevilas Sau chuẩn bị mẫu tiến hành phân tích quy trình xây dựng, điện di đồ mẫu đểu không xuất pic tạp đối quang lamivudin (Hình 2) Kết cho phép kết luận lượng tạp đối quang lamivudin chế phẩm kiểm tra giới hạn phát quy trình (0 ,2 %) Kết luận Trong nghiên cứu này, kỹ thuật điện di mao quản ứng dụng thành công để xác định tạp đối quang lam ivudin Kết thẩm định cho thấy phương pháp xây dựng hoàn toàn phù hợp để áp dụng định lượng phân đối quang lam ivudin định tính phân biệt lam ivudỉn đối quang m ột số dạng chê' phẩm 75 10 1Ỉ5 tí 17Í » Fìe InlotMbon líAtliMXBBlD Hình ỉ Điện di đỗcùa mẫu Lomivudin/lidovudine (ũ), mẫu Stovudine& Lũmivudin (b), mẫu Nevilas (c) rà chuẩn RMA (d) TÀI LIỆU THAM KHẢO Dược điển Việt Nam IV (2009), 346 - 348 USP 32 (2009), 2747 - 2748 M.Wind, P.Hoffmann, H.Wagner, W.Thormann (2000), "Chiral capillary electrophoresis as a predictor for separation o f drug enantiomers in continuous flow zone electrophoresis", Journal o f Chromatography A, 895,51 - 65 A van Eeckhaud, M.R Detaevernier, Y.Michotte (2002), "Development o f a validated capillary electrophoresis method for enantiomeric im purity testing o f dexchlorpheniramine maleate", Journal o f Chromatography A, 958,291 - 297 ... lamivudin chế phẩm viên nén Lamivudin/ Zidovudin, Stavudin & Lamivudin Nevilas Sau chuẩn bị mẫu tiến hành phân tích quy trình xây dựng, điện di đồ mẫu đểu không xuất pic tạp đối quang lamivudin. .. lượng tạp đối quang lamivudin chế phẩm kiểm tra giới hạn phát quy trình (0 ,2 %) Kết luận Trong nghiên cứu này, kỹ thuật điện di mao quản ứng dụng thành công để xác định tạp đối quang lam ivudin... đặc hiệu xác định tạp đối quang lamivudin chê' phẩm thuốc chứa lamivudin, kể chế phẩm đa thành phần Độ tuyến tính Kết xác định di n tích pic nổng độ khoảng nống độ tạp đối quang lamivudin từ 1,67|jg/ml