Nghiên cứu định lượng đồng phân đối quang của atenolol bằng điện di mao quản

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGÔ MINH THÚY NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG PHÂN ĐỐI QUANG CỦA ATENOLOL BẰNG ĐIỆN DI MAO QUẢN LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGÔ MINH THÚY NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG PHÂN ĐỐI QUANG CỦA ATENOLOL BẰNG ĐIỆN DI MAO QUẢN LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 60 72 04 10 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh Th.S NCS Tạ Mạnh Hùng HÀ NỘI 2014 LỜI CẢM ƠN Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn tới PGS.TS. Nguyễn Thị Kiều Anh - Phòng Quản lý khoa học - Trường Đại học Dược Hà Nội, Th.S NCS. Tạ Mạnh Hùng - Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương, đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em trong quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn. Em xin gửi lời cảm ơn đến Th.S Vũ Ngân Bình và các thầy cô, anh/ chị kỹ thuật viên tại Bộ môn Hóa phân tích và độc chất- Trường Đại học Dược Hà Nội cũng như ban lãnh đạo và toàn thể anh/ chị cán bộ, công nhân viên tại Labo Hóa – Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia đã tạo điều kiện tốt nhất về cơ sở vật chất để em hoàn thành luận văn này. Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong Ban Giám hiệu, Phòng Sau đại học và các thầy cô giáo Trường Đại học Dược Hà Nội đã truyền đạt cho em những kiến thức, kinh nghiệm quý báu trong suốt thời gian em học tập tại trường. Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình và bạn bè, những người luôn động viên, khích lệ và tạo động lực cho em trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài. Hà Nội, ngày 1 tháng 10 năm 2014 Học viên DS. Ngô Minh Thúy MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3 1.1. TỔNG QUAN VỀ ATENOLOL 3 1.1.1. Tính chất 3 1.1.2 Dược lý và cơ chế tác dụng 3 1.2 TỔNG QUAN VỀ KỸ THUẬT ĐIỆN DI MAO QUẢN 5 1.2.1 Khái niệm 5 1.2.2 Nguyên lý của quá trình điện di mao quản 6 1.2.3 Điện di mao quản vùng 7 1.3 VÀI NÉT VỀ PHÂN TÍCH ĐỒNG PHÂN QUANG HỌC 9 1.3.1 Đồng phân quang học 9 1.3.2 Phương pháp phân tách đồng phân đối quang 9 1.3.2.1 Phương pháp phân tách đồng phân đối quang gián tiếp 9 1.3.2.2 Phương pháp phân tách đồng phân đối quang trực tiếp 10 1.3.3 Ứng dụng điện di mao quản (CE) trong phân tích đồng phân quang học 12 1.4 TÁCH ĐỒNG PHÂN ĐỐI QUANG BẰNG CE SỬ DỤNG CYCLODEXTRIN LÀM TÁC NHÂN CHỌN LỌC ĐỐI QUANG 13 1.4.1 Tổng quan về cyclodextrin 13 1.4.2 Tách đồng phân đối quang bằng CE sử dụng cyclodextrin là tác nhân chọn lọc đối quang 15 1.5 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH ĐỒNG PHÂN ĐỐI QUANG CỦA ATENOLOL 16 1.5.1 Nghiên cứu trong nước 16 1.5.2 Nghiên cứu trên thế giới 17 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU, HÓA CHẤT, TRANG THIẾT BỊ 20 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 20 2.1.2 Hóa chất, trang thiết bị 20 2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 21 2.2.1 Hoàn thiện phương pháp định lượng đồng phân đối quang của atenolol bằng điện di mao quản 21 2.2.2 Thẩm định phương pháp phân tích 21 2.2.3 Ứng dụng 22 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.3.1 Chuẩn bị các dung dịch chuẩn, dung dịch mẫu và các dung dịch làm việc 22 2.3.2 Khảo sát và lựa chọn điều kiện điện di 23 2.3.3 Thẩm định phương pháp phân tích 24 2.3.4 Ứng dụng 26 2.3.5 Phương pháp xử lý số liệu 27 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 28 3.1 KHẢO SÁT VÀ LỰA CHỌN ĐIỀU KIỆN ĐIỆN DI 28 3.1.1 Lựa chọn dung dịch điện ly nền 28 3.1.2 Lựa chọn bước sóng phát hiện 29 3.1.3 Lựa chọn cột mao quản 29 3.1.4 Lựa chọn hiệu điện thế áp vào hai đầu mao quản 30 3.1.5 Lựa chọn nồng độ tác nhân chọn lọc đối quang 33 3.2 THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 35 3.2.1 Xác định hàm lượng đồng phân R, S-atenolol trong chuẩn atenolol racemic 35 3.2.2 Độ phù hợp hệ thống 36 3.2.3 Độ đặc hiệu 37 3.2.4 Khoảng nồng độ tuyến tính 38 3.2.5 Độ chính xác 41 3.2.6 Độ đúng 42 3.3 ỨNG DỤNG 3.3.1 ĐỊNH LƯỢNG CÁC ĐỒNG PHÂN ĐỐI QUANG CỦA ATENOLOL TRONG MỘT SỐ CHẾ PHẨM 44 3.3.2 ĐÁNH GIÁ ĐỘ HÒA TAN CÁC ĐỒNG PHÂN CỦA ATENOLOL TRONG CHẾ PHẨM VIÊN NÉN 45 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 47 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT AGP Acid α1-glycoprotein BGE ( Background Electrolyte ) Dung dịch điện ly nền BSA ( Bovine Serum Albumine ) Albumin huyết thanh bò CE ( Capillary Electrophoresis ) Điện di mao quản CGE (Capillary Gel Electrophoresis) Điện di mao quản gel CZE (Capillary Zone Electrophoresis) Điện di mao quản vùng β-CD Beta cyclodextrin CM-β-CD Carboxymethyl beta cyclodextrin DM-β-CD Dimethyl beta cyclodextrin EOF ( Electro-osmotic flow ) Dòng điện thẩm HP-β-CD Hydroxypropyl beta cyclodextrin HPLC ( High Performance Liquid Chromatography) Sắc ký lỏng hiệu năng cao HSA ( Human Serum Albumine ) Albumin huyết thanh người MEKC (Micellar Electrokinetic Chromatography) Sắc ký điện động mixen R s (Resolution) Độ phân giải RSD ( Relative Standard Deviation ) Độ lệch chuẩn tương đối SD (Standard Deviation) Độ lệch chuẩn SĐK Số đăng ký t m Thời gian di chuyển TRIS Tris (Hydroxymethy) amimomethan DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Tính chất của một số CD tự nhiên 14 Bảng 3.1 Xác định hàm lượng các đồng phân trong chuẩn atenolol racemic 35 Bảng 3.2 Độ phù hợp hệ thống 36 Bảng 3.3 Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn atenolol racemic 39 Bảng 3.4 Quan hệ giữa nồng độ và diện tích pic của atenolol racemic 39 Bảng 3.5 Quan hệ giữa nồng độ và diện tích pic của S-atenolol 40 Bảng 3.6 Quan hệ giữa nồng độ và diện tích pic của R-atenolol 40 Bảng 3.7 Kết quả đánh giá độ lặp lại trên mẫu Atenolol STADA 50 mg 41 Bảng 3.8 Kết quả đánh giá độ chính xác trung gian trên mẫu Atenolol STADA 50mg 42 Bảng 3.9 Kết quả đánh giá khả năng tìm lại với S-atenolol 43 Bảng 3.10 Kết quả đánh giá khả năng tìm lại với R-atenolol 43 Bảng 3.11 Kết quả định lượng mẫu chế phẩm viên nén chứa atenolol 44 Bảng 3.12 Kết quả định lượng các đồng phân đối quang của atenolol trong mẫu thử hòa tan 46 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ Hình 1.1 Công thức cấu tạo của Atenolol 3 Hình 1.2 Sơ đồ hệ thống điện di mao quản 6 Hình 1.3 Sự hình thành dòng EOF 7 Hình 3.1 Điện di đồ khi sử dụng các dung dịch điện ly nền khác nhau 28 Hình 3.2 Điện di đồ của dung dịch atenolol racemic 100 ppm khi sử dụng với các mao quản khác nhau 30 Hình 3.3 Điện di đồ của dung dịch chuẩn atenolol racemic ở 3 điện thế sử dụng 32 Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của thời gian di chuyển các đồng phân quang học của atenolol vào giá trị điện thế sử dụng 32 Hình 3.5 Điện di đồ dung dịch atenolol racemic 100 ppm khi thay đổi nồng độ tác nhân chọn lọc đối quang 34 Hình 3.6 Điện di đồ mẫu placebo 37 Hình 3.7 Điện di đồ mẫu atenolol racemic chuẩn 37 Hình 3.8 Điện di đồ mẫu atenolol STADA 37 Hình 3.9 Điện di đồ mẫu S-atenolol 38 Hình 4.1 Vị trí tương tác liên kết hydro 49 - 1 - ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, trong điều trị trên lâm sàng đã sử dụng ngày càng nhiều các thuốc có chứa hoạt chất là các dạng đồng phân quang học tinh khiết, giúp nâng cao hiệu quả điều trị, giảm liều dùng và hạn chế được nhiều tác dụng không mong muốn so với khi dùng thuốc có chứa hoạt chất ở dạng hỗn hợp racemic. Ví dụ: levofloxacin (đồng phân tả tuyền của ofloxacin) có tác dụng kháng khuẩn mạnh gấp hàng chục đến hàng trăm lần dextrofloxacin (đồng phân hữu tuyền của ofloxacin) [4], hoặc dexchlorpheniramin maleat (đồng phân hữu tuyền của chlorpheniramin maleat) là một thuốc kháng Histamin H 1 dùng điều trị dị ứng có tác dụng mạnh gấp hai lần chlorpheniramin maleat (dạng racemic) với cùng liều lượng do dạng đồng phân tả tuyền không có tác dụng, cho phép liều dùng chỉ còn một nửa [3], lamivudin có hai đồng phân đối quang có tác dụng trên HIV tương đương nhau, nhưng đồng phân (-) lamivudin có độc tính trên tế bào thấp hơn so với đồng phân (+) lamivudin [18]. Trong cuộc sống hiện đại ngày nay, xu hướng các bệnh tiểu đường, rối loạn lipid máu, các bệnh tim mạch ngày càng tăng nhanh. Đặc biệt, với nhóm thuốc tim mạch thời gian điều trị thường kéo dài, do đó việc sử dụng thuốc ở dạng đồng phân quang học tinh khiết lại càng có ý nghĩa quan trọng. Atenolol là dẫn chất của aryloxypropanolamin, có tác dụng chẹn chọn lọc trên thụ thể β 1 - adrenergic dùng điều trị tăng huyết áp, đau thắt ngực mạn tính ổn định, nhồi máu cơ tim sớm (trong vòng 12 giờ đầu) và dự phòng sau nhồi máu cơ tim, loạn nhịp nhanh trên thất [2]. Với một carbon bất đối trong phân tử, atenolol là hỗn hợp racemic của hai đồng phân đối quang: S-atenolol và R-atenolol. Một số nghiên cứu đã chứng minh và chỉ ra rằng S-atenolol có vai trò chính chẹn beta giao cảm khi dùng atenolol dạng hỗn hợp racemic, đồng thời độc tính cũng thấp hơn so với dạng R-atenolol [20], [25], [26]. Do đó việc sản xuất và sử dụng đồng phân S-atenolol ngày càng được quan tâm nhiều hơn. Điều này đòi hỏi phải xây dựng phương pháp phân tách và định lượng được từng dạng đơn đồng phân trong hỗn hợp racemic của atenolol. [...]... chứa số phân tử bằng nhau của mỗi dạng đối quang, độ quay cực tổng cộng do đó bằng không [5] 1.3.2 Phương pháp phân tách đồng phân đối quang 1.3.2.1 Phương pháp phân tách đồng phân đối quang gián tiếp Phương pháp này dựa trên một phản ứng hóa học giữa hai đồng phân đối quang với một hợp chất bất đối tạo thành hỗn hợp hai đồng phân lập thể nhưng không đối quang trước khi được phân tách bằng điện di Được... thiện và thẩm định phương pháp định lượng đồng phân đối quang của atenolol bằng điện di mao quản 2 Ứng dụng phương pháp này định lượng và đánh giá độ hòa tan các đồng phân đối quang của atenolol trong một số chế phẩm có chứa atenolol trên thị trường phục vụ công tác kiểm nghiệm -2- CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ ATENOLOL Công thức cấu tạo H OH H N O CH3 O CH3 H2N và đồng phân đối quang Hình 1.1:... đối quang (chiral selector) vào dung dịch điện ly nền [8] Tại Việt Nam, việc áp dụng kỹ thuật điện di mao quản trong phân tích kiểm nghiệm vẫn còn hạn chế Để nâng cao năng lực kiểm tra chất lượng thuốc của hệ thống kiểm nghiệm cũng như hội nhập với xu hướng phát triển của ngành Dược trên thế giới, chúng tôi thực hiện đề tài: Nghiên cứu định lượng đồng phân đối quang của Atenolol bằng điện di mao quản ... biến trong phân tách đồng phân quang học với nhiều ưu điểm và chi phí kinh tế hơn 1.3.3 Ứng dụng CE trong phân tích đồng phân quang học Điện di mao quản là kỹ thuật ngày càng được áp dụng rộng rãi hơn trong phân tích đồng phân đối quang CE là một kỹ thuật bổ sung cho HPLC, đặc biệt đối với việc phân tích hợp chất phân cực và tích điện Các chất chọn lọc hoạt quang sử dụng trong điện di mao quản chính... lượng phân tử tăng lên, và do đó linh độ điện di thấp hơn so với chất tan tự do Trong tách đồng phân đối quang, các đồng phân có linh độ điện di đồng nhất và các đồng phân trong phức lồng có thể có linh độ tương tự nhau Vì vậy, nguyên tắc của CZE sử dụng CD là tác nhân chọn lọc đối quang (CD - CZE) để tách đồng phân đối quang là sự khác biệt giữa các hằng số bền của phức lồng tạo ra giữa các đồng phân. .. Linh độ là hàm số của điện tích chất phân tích và kích thước trong điều kiện nhất định của phương pháp Chúng được tối ưu hóa bằng cách kiểm soát các thành phần của đệm, pH và lực ion Điện di mao quản vùng sử dụng nguyên lý của điện di và điện thẩm để tách các tiểu phân tích điện Linh độ điện di của ion (µep), được biễu di n bằng phương trình: µep= q/(6πηr) Trong đó: q là điện tích của ion, η là độ nhớt... electrokinetic chromatography - MEKC) • Điện di mao quản gel (capillary gel electrophoresis - CGE) • Điện di mao quản hội tụ đẳng điện (capillary isoelectric focusing - CIEF) • Điện di mao quản đẳng tốc (capillary isotachophoresis - CITP) [1], [6] 1.2.3 Điện di mao quản vùng Trong điện di mao quản vùng, quá trình tách được kiểm soát bằng sự khác nhau về linh độ tương đối của từng thành phần trong mẫu thử... được định nghĩa như trên [1], [6] 1.3 VÀI NÉT VỀ PHÂN TÍCH ĐỒNG PHÂN QUANG HỌC 1.3.1 Đồng phân quang học Đồng phân là những hợp chất khác nhau có cùng một công thức phân tử Đồng phân quang học là hiện tượng đồng phân có liên quan đến sự khác nhau về góc quay của mặt phẳng ánh sáng phân cực Dạng đồng phân quang học đơn giản nhất xuất hiện trong trường hợp khi hợp chất có thể tồn tại dưới hai dạng đồng phân. .. hoàn thiện phương pháp để ứng dụng vào định lượng các đồng phân quang học của atenolol 1.5.2 Nghiên cứu trên thế giới Một số nghiên cứu định lượng đồng phân quang học của Atenolol đã được công bố trên thế giới Nghiên cứu của Santoro M.I [23], sử dụng điều kiện sắc ký như sau: • Cột sắc ký hoạt quang: Chiralcel OD (250 x 4,6 mm; 10 µm) • Pha động: Hexan - ethanol - diethylamine = 75: 25: 0,1 • Tốc độ dòng:... dịch phân tích được chuẩn bị bằng cách pha loãng dung dịch chuẩn gốc với đệm Tris tới nồng độ 0,2 mM Tất cả các dung dịch được lọc qua màng lọc 0,22 µm Trong hai nghiên cứu phân tách đồng phân quang học của atenolol dùng phương pháp CE, nghiên cứu của Wei Wang và cộng sự có thời gian di chuyển các đồng phân quang học của atenolol khoảng 40 phút, nghiên cứu của Wuhong Li và cộng sự có thời gian di chuyển . Nghiên cứu định lượng đồng phân đối quang của Atenolol bằng điện di mao quản . Với hai mục tiêu: 1. Hoàn thiện và thẩm định phương pháp định lượng đồng phân đối quang của atenolol bằng điện. đối quang gián tiếp 9 1.3.2.2 Phương pháp phân tách đồng phân đối quang trực tiếp 10 1.3.3 Ứng dụng điện di mao quản (CE) trong phân tích đồng phân quang học 12 1.4 TÁCH ĐỒNG PHÂN ĐỐI QUANG BẰNG. Điện di mao quản vùng 7 1.3 VÀI NÉT VỀ PHÂN TÍCH ĐỒNG PHÂN QUANG HỌC 9 1.3.1 Đồng phân quang học 9 1.3.2 Phương pháp phân tách đồng phân đối quang 9 1.3.2.1 Phương pháp phân tách đồng phân đối