Nghiên cứu định lượng đồng phân đối quang của atenolol bằng điện di mao quản

Trong những năm gần đây, kỹ thuật điện di mao quản Capillary Electrophoresis - CE là phương pháp hóa lý được các nhà phân tích lựa chọn trong lĩnh vực tách các đồng phân quang học với nh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGÔ MINH THÚY

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG

ĐỒNG PHÂN ĐỐI QUANG CỦA

ATENOLOL BẰNG ĐIỆN DI MAO QUẢN

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2014

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGÔ MINH THÚY

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG

ĐỒNG PHÂN ĐỐI QUANG CỦA

ATENOLOL BẰNG ĐIỆN DI MAO QUẢN

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT

MÃ SỐ: 60 72 04 10

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh

Th.S NCS Tạ Mạnh Hùng

HÀ NỘI 2014

LỜI CẢM ƠN

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn tới PGS.TS

Nguyễn Thị Kiều Anh - Phòng Quản lý khoa học - Trường Đại học Dược Hà Nội, Th.S NCS Tạ Mạnh Hùng - Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương, đã tận tình

hướng dẫn, giúp đỡ em trong quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn

Em xin gửi lời cảm ơn đến Th.S Vũ Ngân Bình và các thầy cô, anh/ chị kỹ

thuật viên tại Bộ môn Hóa phân tích và độc chất- Trường Đại học Dược Hà Nội cũng như ban lãnh đạo và toàn thể anh/ chị cán bộ, công nhân viên tại Labo Hóa –

Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia đã tạo điều kiện tốt nhất về

cơ sở vật chất để em hoàn thành luận văn này

Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong Ban Giám hiệu, Phòng Sau đại học

và các thầy cô giáo Trường Đại học Dược Hà Nội đã truyền đạt cho em những kiến thức, kinh nghiệm quý báu trong suốt thời gian em học tập tại trường

Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình và bạn bè, những người luôn động viên, khích lệ và tạo động lực cho em trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài

Hà Nội, ngày 1 tháng 10 năm 2014 Học viên

DS Ngô Minh Thúy

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 TỔNG QUAN VỀ ATENOLOL 3

1.1.1 Tính chất 3

1.1.2 Dược lý và cơ chế tác dụng 3

1.2 TỔNG QUAN VỀ KỸ THUẬT ĐIỆN DI MAO QUẢN 5

1.2.1 Khái niệm 5

1.2.2 Nguyên lý của quá trình điện di mao quản 6

1.2.3 Điện di mao quản vùng 7

1.3 VÀI NÉT VỀ PHÂN TÍCH ĐỒNG PHÂN QUANG HỌC 9

1.3.1 Đồng phân quang học 9

1.3.2 Phương pháp phân tách đồng phân đối quang 9

1.3.2.1 Phương pháp phân tách đồng phân đối quang gián tiếp 9

1.3.2.2 Phương pháp phân tách đồng phân đối quang trực tiếp 10

1.3.3 Ứng dụng điện di mao quản (CE) trong phân tích đồng phân quang học 12

1.4 TÁCH ĐỒNG PHÂN ĐỐI QUANG BẰNG CE SỬ DỤNG CYCLODEXTRIN LÀM TÁC NHÂN CHỌN LỌC ĐỐI QUANG 13

1.4.1 Tổng quan về cyclodextrin 13

1.4.2 Tách đồng phân đối quang bằng CE sử dụng cyclodextrin là tác nhân chọn lọc đối quang 15

1.5 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH ĐỒNG PHÂN ĐỐI QUANG CỦA ATENOLOL 16

1.5.1 Nghiên cứu trong nước 16

1.5.2 Nghiên cứu trên thế giới 17

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU, HÓA CHẤT, TRANG THIẾT BỊ 20

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 20

2.1.2 Hóa chất, trang thiết bị 20

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 21

2.2.1 Hoàn thiện phương pháp định lượng đồng phân đối quang của atenolol bằng điện di mao quản 21

2.2.2 Thẩm định phương pháp phân tích 21

2.2.3 Ứng dụng 22

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.3.1 Chuẩn bị các dung dịch chuẩn, dung dịch mẫu và các dung dịch làm việc 22

2.3.2 Khảo sát và lựa chọn điều kiện điện di 23

2.3.3 Thẩm định phương pháp phân tích 24

2.3.4 Ứng dụng 26

2.3.5 Phương pháp xử lý số liệu 27

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 28

3.1 KHẢO SÁT VÀ LỰA CHỌN ĐIỀU KIỆN ĐIỆN DI 28

3.1.1 Lựa chọn dung dịch điện ly nền 28

3.1.2 Lựa chọn bước sóng phát hiện 29

3.1.3 Lựa chọn cột mao quản 29

3.1.4 Lựa chọn hiệu điện thế áp vào hai đầu mao quản 30

3.1.5 Lựa chọn nồng độ tác nhân chọn lọc đối quang 33

3.2 THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 35

3.2.1 Xác định hàm lượng đồng phân R, S-atenolol trong chuẩn atenolol racemic 35

3.2.2 Độ phù hợp hệ thống 36

3.2.3 Độ đặc hiệu 37

3.2.4 Khoảng nồng độ tuyến tính 38

3.2.5 Độ chính xác 41

3.2.6 Độ đúng 42 3.3 ỨNG DỤNG

3.3.1 ĐỊNH LƯỢNG CÁC ĐỒNG PHÂN ĐỐI QUANG CỦA ATENOLOL TRONG MỘT SỐ CHẾ PHẨM 44 3.3.2 ĐÁNH GIÁ ĐỘ HÒA TAN CÁC ĐỒNG PHÂN CỦA ATENOLOL TRONG CHẾ PHẨM VIÊN NÉN 45 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 47 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

cyclodextrin

cyclodextrin HPLC ( High Performance Liquid Chromatography) Sắc ký lỏng hiệu năng cao

amimomethan

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Tính chất của một số CD tự nhiên 14

Bảng 3.1 Xác định hàm lượng các đồng phân trong chuẩn atenolol racemic 35

Bảng 3.2 Độ phù hợp hệ thống 36

Bảng 3.3 Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn atenolol racemic 39

Bảng 3.4 Quan hệ giữa nồng độ và diện tích pic của atenolol racemic 39

Bảng 3.5 Quan hệ giữa nồng độ và diện tích pic của S-atenolol 40

Bảng 3.6 Quan hệ giữa nồng độ và diện tích pic của R-atenolol 40

Bảng 3.7 Kết quả đánh giá độ lặp lại trên mẫu Atenolol STADA 50 mg 41

Bảng 3.8 Kết quả đánh giá độ chính xác trung gian trên mẫu Atenolol STADA 50mg 42

Bảng 3.9 Kết quả đánh giá khả năng tìm lại với S-atenolol 43

Bảng 3.10 Kết quả đánh giá khả năng tìm lại với R-atenolol 43

Bảng 3.11 Kết quả định lượng mẫu chế phẩm viên nén chứa atenolol 44

Bảng 3.12 Kết quả định lượng các đồng phân đối quang của atenolol trong mẫu thử hòa tan 46

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của Atenolol 3

Hình 1.2 Sơ đồ hệ thống điện di mao quản 6

Hình 1.3 Sự hình thành dòng EOF 7

Hình 3.1 Điện di đồ khi sử dụng các dung dịch điện ly nền khác nhau 28

Hình 3.2 Điện di đồ của dung dịch atenolol racemic 100 ppm khi sử dụng với các mao quản khác nhau 30

Hình 3.3 Điện di đồ của dung dịch chuẩn atenolol racemic ở 3 điện thế sử dụng 32

Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của thời gian di chuyển các đồng phân quang học của atenolol vào giá trị điện thế sử dụng 32

Hình 3.5 Điện di đồ dung dịch atenolol racemic 100 ppm khi thay đổi nồng độ tác nhân chọn lọc đối quang 34

Hình 3.6 Điện di đồ mẫu placebo 37

Hình 3.7 Điện di đồ mẫu atenolol racemic chuẩn 37

Hình 3.8 Điện di đồ mẫu atenolol STADA 37

Hình 3.9 Điện di đồ mẫu S-atenolol 38

Hình 4.1 Vị trí tương tác liên kết hydro 49

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hiện nay, trong điều trị trên lâm sàng đã sử dụng ngày càng nhiều các thuốc

có chứa hoạt chất là các dạng đồng phân quang học tinh khiết, giúp nâng cao hiệu quả điều trị, giảm liều dùng và hạn chế được nhiều tác dụng không mong muốn so với khi dùng thuốc có chứa hoạt chất ở dạng hỗn hợp racemic Ví dụ: levofloxacin (đồng phân tả tuyền của ofloxacin) có tác dụng kháng khuẩn mạnh gấp hàng chục

đến hàng trăm lần dextrofloxacin (đồng phân hữu tuyền của ofloxacin) [4], hoặc

dexchlorpheniramin maleat (đồng phân hữu tuyền của chlorpheniramin maleat) là

chlorpheniramin maleat (dạng racemic) với cùng liều lượng do dạng đồng phân tả tuyền không có tác dụng, cho phép liều dùng chỉ còn một nửa [3], lamivudin có hai

đồng phân đối quang có tác dụng trên HIV tương đương nhau, nhưng đồng phân (-)

lamivudin có độc tính trên tế bào thấp hơn so với đồng phân (+) lamivudin [18] Trong cuộc sống hiện đại ngày nay, xu hướng các bệnh tiểu đường, rối loạn lipid máu, các bệnh tim mạch ngày càng tăng nhanh Đặc biệt, với nhóm thuốc tim mạch thời gian điều trị thường kéo dài, do đó việc sử dụng thuốc ở dạng đồng phân quang học tinh khiết lại càng có ý nghĩa quan trọng Atenolol là dẫn chất của

điều trị tăng huyết áp, đau thắt ngực mạn tính ổn định, nhồi máu cơ tim sớm (trong

vòng 12 giờ đầu) và dự phòng sau nhồi máu cơ tim, loạn nhịp nhanh trên thất [2] Với một carbon bất đối trong phân tử, atenolol là hỗn hợp racemic của hai đồng phân đối quang: S-atenolol và R-atenolol Một số nghiên cứu đã chứng minh và chỉ

ra rằng S-atenolol có vai trò chính chẹn beta giao cảm khi dùng atenolol dạng hỗn hợp racemic, đồng thời độc tính cũng thấp hơn so với dạng R-atenolol [20], [25], [26] Do đó việc sản xuất và sử dụng đồng phân S-atenolol ngày càng được quan tâm nhiều hơn Điều này đòi hỏi phải xây dựng phương pháp phân tách và định lượng được từng dạng đơn đồng phân trong hỗn hợp racemic của atenolol

Trong những năm gần đây, kỹ thuật điện di mao quản (Capillary Electrophoresis - CE) là phương pháp hóa lý được các nhà phân tích lựa chọn trong lĩnh vực tách các đồng phân quang học với nhiều lý do: hiệu lực tách cao, lượng mẫu sử dụng ít, dung môi sử dụng trong quá trình phân tích chỉ là dung dịch đệm do

đó không ảnh hưởng đến môi trường, việc tách các đồng phân quang học có thể đạt được khi chỉ cần thêm một lượng nhỏ tác nhân chọn lọc đối quang (chiral selector)

vào dung dịch điện ly nền [8]

Tại Việt Nam, việc áp dụng kỹ thuật điện di mao quản trong phân tích kiểm nghiệm vẫn còn hạn chế Để nâng cao năng lực kiểm tra chất lượng thuốc của hệ thống kiểm nghiệm cũng như hội nhập với xu hướng phát triển của ngành Dược trên

thế giới, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu định lượng đồng phân đối quang

của Atenolol bằng điện di mao quản” Với hai mục tiêu:

atenolol bằng điện di mao quản

2 Ứng dụng phương pháp này định lượng và đánh giá độ hòa tan các đồng

phân đối quang của atenolol trong một số chế phẩm có chứa atenolol trên thị trường phục vụ công tác kiểm nghiệm

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ ATENOLOL

Công thức cấu tạo

OH H

CH3

CH 3

H2N

O

và đồng phân đối quang

Hình 1.1: Công thức cấu tạo của Atenolol

methanol, khó tan trong methylen clorid

chống tăng huyết áp Thuốc có tác dụng làm giảm lực co cơ và giảm tần số tim Atenolol không có tác dụng ổn định màng Atenolol tan trong nước, do đó ít thấm vào hệ thần kinh trung ương

Ðiều trị atenolol sẽ ức chế tác dụng của catecholamin khi gắng sức và căng thẳng tâm lý, dẫn đến làm giảm tần số tim, giảm cung lượng tim và giảm huyết

áp

Ðiều trị atenolol không làm tăng hoặc làm tăng rất ít sức cản của mạch ngoại biên Ở liều điều trị, tác dụng co cơ trơn phế quản của atenolol kém hơn so với những thuốc chẹn thụ thể beta không chọn lọc Tính chất này cho phép điều trị cả những người có bệnh hen phế quản nhẹ hoặc bệnh phổi tắc nghẽn khác Atenolol ít ảnh hưởng đến giải phóng insulin và chuyển hóa carbohydrat Bởi vậy, atenolol có thể dùng được cho người đái tháo đường Ở người tăng huyết áp, atenolol làm giảm một cách có ý nghĩa huyết áp cả ở tư thế đứng lẫn tư thế nằm

Ðể điều trị tăng huyết áp, nếu cần, có thể kết hợp atenolol với thuốc chống tăng huyết áp khác, chủ yếu là thuốc lợi niệu và/hoặc thuốc giãn mạch ngoại biên [2]

Một số nghiên cứu so sánh tác dụng giữa các đồng phân quang học của atenolol:

* Nghiên cứu so sánh tác dụng giảm nhịp tim của atenolol racemic và atenolol, S-atenolol so với giả dược trên người tình nguyện sau khi tập thể dục

R-do Stoschitzky K và cộng sự thực hiện cho thấy tác dụng giảm nhịp tim sau khi uống 100 mg atenolol racemic tương đương với uống 50 mg S- atenolol, trong khi không thấy tác dụng giảm nhịp tim sau khi uống 50 mg R- atenolol [25], [26]

* Theo nghiên cứu của McCoy R và cộng sự khi tiến hành thử nghiệm trên

và có ít tác dụng phụ như loạn nhịp, đánh trống ngực so với R- atenolol [20]

b) Dược động học

Sau khi uống thuốc đạt nồng độ tối đa trong huyết tương trong vòng từ 2 -

4 giờ Sinh khả dụng xấp xỉ 45%, nhưng có sự khác nhau tới 3 - 4 lần giữa các người bệnh Thể tích phân bố là 0,7 lít/kg Atenolol chỉ được chuyển hóa một lượng nhỏ Phần lớn liều thuốc dùng được bài tiết qua thận dưới dạng không

thay đổi Nửa đời trong huyết tương của thuốc từ 6 - 9 giờ đối với người lớn có chức năng thận bình thường Nửa đời trong huyết tương của thuốc tăng lên đối với người có chức năng thận giảm và không bị ảnh hưởng bởi bệnh gan

c) Chỉ định

Tăng huyết áp, đau thắt ngực mạn tính ổn định, nhồi máu cơ tim sớm (trong

vòng 12 giờ đầu) và dự phòng sau nhồi máu cơ tim, loạn nhịp nhanh trên thất

d) Chống chỉ định

Sốc tim, suy tim không bù trừ, blốc nhĩ - thất độ II và độ III, chậm nhịp tim

có biểu hiện lâm sàng Không được dùng kết hợp với verapamil

1.2 TỔNG QUAN VỀ KỸ THUẬT ĐIỆN DI MAO QUẢN

1.2.1 Khái niệm

Điện di là hiện tượng di chuyển của tiểu phân tích điện hòa tan hay phân tán

trong chất điện giải khi có dòng điện đi qua Cation di chuyển về phía cực âm (catod), anion di chuyển về phía cực dương (anod) Các phần tử không tích điện không bị hút về phía hai điện cực

Điện di mao quản (CE) là một kỹ thuật tách các chất trong mao quản silica

dài 25 - 100 cm, đường kính trong 25 - 100 µm, đường kính ngoài 300 - 400 µm

Điện thế một chiều áp vào hai đầu mao quản 10 - 30 kV (cường độ điện trường có

thể đến 500 V/cm) tạo ra quá trình chia tách, các chất phân tích được phát hiện khi

di chuyển về một đầu mao quản nhờ một detector thích hợp [1], [6]

Hình 1.2: Sơ đồ hệ thống điện di mao quản

1.2.2 Nguyên lý của quá trình điện di mao quản

Quá trình vận hành của CE điển hình với mao quản silica chứa dung dịch

đệm làm việc, thì nhóm silanol (SiOH) ở trên thành trong của mao quản sẽ giải

âm ngay cả ở pH rất thấp Cation hay các chất hòa tan tích điện dương một phần trong môi trường bị hút tĩnh điện vào thành mao quản tích điện âm tạo nên một lớp

điện kép để cân bằng điện tích và tạo nên một hiệu điện thế ở vùng sát thành mao

quản gọi là thế Zeta (ξ)

Khi áp thế vào mao quản, các cation trong lớp điện kép khuếch tán sẽ di chuyển về phía catod Nhưng các cation này bị solvat hóa nên kéo cả khối dung dịch trong mao quản đi về catod Sự chuyển động của khối dung dịch trong mao quản silica dưới tác dụng của lực điện trường được gọi là dòng điện thẩm (electro-osmotic flow - EOF)

Điện tích bề mặt trong của thành mao quản phụ thuộc chủ yếu vào pH của

dung dịch đệm làm việc, do đó trị số EOF thay đổi theo pH Ở pH thấp, nhóm silanol nói chung có độ ion hóa thấp và dòng EOF nhỏ Ở pH cao hơn, nhóm silanol

bị ion hóa nhiều hơn và dòng EOF tăng

Hình 1.3: Sự hình thành dòng EOF

Ngoài pH dung dịch đệm, dòng EOF sẽ thay đổi khi:

được cho thêm vào dung dịch đệm để dễ hòa tan chất phân tích, hằng số điện

môi của dung dịch điện di giảm xuống kéo theo sự giảm của EOF

Detector được đặt về phía đầu catod của mao quản Dòng EOF thường lớn hơn linh độ điện di Do vậy, ngay cả anion cũng bị đẩy về phía catod và detector Khi sử dụng đệm phosphat pH 7,0 ở mao quản không có lớp bao, thông thường trình tự xuất hiện các chất tan trong điện di đồ là các cation, các chất trung tính và các anion

Hiện nay, có 5 loại điện di mao quản chủ yếu:

• Điện di mao quản vùng (capillary zone electrophoresis - CZE) còn gọi là điện di dung dịch tự do hay điện di mao quản dòng tự do

electrokinetic chromatography - MEKC)

• Điện di mao quản gel (capillary gel electrophoresis - CGE)

• Điện di mao quản hội tụ đẳng điện (capillary isoelectric focusing - CIEF)

• Điện di mao quản đẳng tốc (capillary isotachophoresis - CITP) [1], [6]

1.2.3 Điện di mao quản vùng

Trong điện di mao quản vùng, quá trình tách được kiểm soát bằng sự khác nhau về linh độ tương đối của từng thành phần trong mẫu thử hoặc dung dịch thử

Linh độ là hàm số của điện tích chất phân tích và kích thước trong điều kiện nhất

định của phương pháp Chúng được tối ưu hóa bằng cách kiểm soát các thành phần

của đệm, pH và lực ion

Điện di mao quản vùng sử dụng nguyên lý của điện di và điện thẩm để tách

trình:

µep = q/(6πηr)

ion hydrat hóa Từ mối liên hệ này suy ra, chất phân tích kích thước nhỏ, điện tích lớn có linh độ lớn Chất phân tích kích thước lớn, điện tích nhỏ có linh độ thấp

phương trình: νi = µ ep (V/L)

cộng của mao quản

νeo = µ eo (V/L)

biểu thị bằng hệ thức sau:

t m = l/E.(µ ep + µ eo )= lL/V.(µ ep + µ eo )

Trong đó: E là cường độ điện trường (E = V/L)

Hiệu lực của hệ thống điện di được biểu thị bằng số đĩa lý thuyết (N), được tính bằng phương trình:

N = (µ ep + µ eo )El/2D

khác được định nghĩa như trên

Độ phân giải (R) của hai chất hòa tan được rửa giải kế tiếp nhau, có thể xác định bằng phương trình:

bình của hai chất tan và các ký hiệu khác được định nghĩa như trên [1], [6]

1.3 VÀI NÉT VỀ PHÂN TÍCH ĐỒNG PHÂN QUANG HỌC

1.3.1 Đồng phân quang học

Đồng phân là những hợp chất khác nhau có cùng một công thức phân tử Đồng phân quang học là hiện tượng đồng phân có liên quan đến sự khác nhau về

góc quay của mặt phẳng ánh sáng phân cực

Dạng đồng phân quang học đơn giản nhất xuất hiện trong trường hợp khi hợp chất có thể tồn tại dưới hai dạng đồng phân lập thể có cấu tạo không chồng khít lên nhau được Ngoài sự khác biệt trong cấu trúc phân tử theo kiểu như sự khác biệt giữa bàn tay phải và bàn tay trái, còn tất cả các tính chất lý học thông thường của các đồng phân đó là giống nhau, trừ khả năng quay mặt phẳng ánh sáng phân cực theo những góc bằng nhau nhưng ngược chiều

Chất có khả năng làm quay mặt phẳng của ánh sáng phân cực một góc α nào

đó, người ta gọi chất đó là chất hoạt quang (hoạt động quang học) Hỗn hợp racemic

có chứa số phân tử bằng nhau của mỗi dạng đối quang, độ quay cực tổng cộng do

đó bằng không [5]

1.3.2 Phương pháp phân tách đồng phân đối quang

1.3.2.1 Phương pháp phân tách đồng phân đối quang gián tiếp

Phương pháp này dựa trên một phản ứng hóa học giữa hai đồng phân đối quang với một hợp chất bất đối tạo thành hỗn hợp hai đồng phân lập thể nhưng không đối quang trước khi được phân tách bằng điện di Được thể hiện như sơ đồ:

Trong đó:

1 2

1 / 18

,

C: Hỗn hợp racemic cần phân tích

D: Thuốc thử bất đối

R-, S- tương ứng là đồng phân quay phải và đồng phân quay trái

Hỗn hợp thu được có thể được tách bằng GC và HPLC Về nguyên tắc, có thể dùng CE để phân tích hỗn hợp trên, sử dụng dung dịch điện ly nền không chọn lọc đối quang, bởi các thành phần trong hỗn hợp có tính chất lý hóa khác nhau.Tuy nhiên phương pháp này rất khó áp dụng trong CE So với phương pháp phân tách trực tiếp thì phương pháp gián tiếp này có một số nhược điểm sau đây:

carboxylic

quang sẽ tạo ra thêm hai đồng phân lập thể không đối quang nữa và gây khó khăn cho quá trình phân tích

cùng mức độ và tốc độ

• Đáp ứng của detector với hai dẫn xuất tạo thành phải tương đương nhau

• Điều kiện phản ứng phải thích hợp để tránh sự chuyển dạng lập thể của

thuốc thử bất đối, đồng phân quang học của chất phân tích và dẫn xuất

đồng phân lập thể không đối quang

Thông thường, không phải dễ dàng để giải quyết tất cả các vấn đề trong quá trình thực nghiệm như mô tả ở trên Tuy nhiên, phương pháp gián tiếp có thể được

áp dụng trong những trường hợp mà phương pháp trực tiếp không thể áp dụng được hoặc khi cần tăng độ nhạy Phương pháp gián tiếp trong CE chủ yếu được áp dụng cho phân tách đồng phân quang học của acid amin [15]

1.3.2.2 Phương pháp phân tách đồng phân đối quang trực tiếp

Phương pháp phân tách trực tiếp được áp dụng thành công trong CE cho việc tách đồng phân đối quang của một số nhóm hợp chất, chủ yếu là dược chất

Các đồng phân quang học rất giống nhau về tính chất lý hóa nên áp dụng các

khả năng tương tác khác nhau với một số chất đặc biệt, gọi là tác nhân chọn lọc đối quang Khi có mặt trong hệ thống phân tích, chúng sẽ tương tác với hỗn hợp đồng phân quang học Quá trình tách đồng phân này đạt được do sự khác nhau về năng lượng tương tác của tác nhân chọn lọc đối quang với mỗi đồng phân

Tác nhân chọn lọc đối quang hoặc có thể được thêm vào dung dịch điện ly nền hoặc được gắn lên thành mao quản, hoặc được cố định hay gắn lên các hệ gel

để tạo một môi trường chọn lọc đối quang mà tương tác với hai đồng phân đối

quang trong suốt quá trình điện di dựa trên sự hình thành phức đồng phân lập thể không đối quang tạm thời Các phức tạm thời di chuyển về phía detector với vận tốc khác nhau chỉ khi chúng có hằng số bền khác nhau Các tương tác tương đối yếu tham gia vào quá trình hình thành đồng phân lập thể không đối quang gồm liên kết hydro, tương tác kỵ nước, liên kết π-π, lưỡng cực - lưỡng cực Độ tinh khiết quang học của tác nhân chọn lọc đối quang trong phương pháp tách trực tiếp không phải là một yếu tố quan trọng như trong phương pháp tách gián tiếp; trên thực tế, các tạp chất chỉ ảnh hưởng đến độ phân giải và đã được chỉ ra rằng kết quả tương đối tốt có thể thu được bằng cách sử dụng tác nhân chọn lọc đối quang có chứa tới 10% đồng phân đối quang còn lại [15], [16], [22]

Các tác nhân chọn lọc đối quang có bản chất hóa học khá đa dạng và được chia thành các nhóm chính sau [11]:

glycoprotein – AGP, ovalbumin trong trứng gà…), cyclopeptid, một số kháng sinh macrocyclic glycopeptid (vancomycin, teicoplanin, avoparcin, tubocuracin…) đã được dùng để tách nhiều đồng phân đối quang

phân tử hay dùng như dẫn chất maltose, lactose, sucrose, amylose, cellulose

chọn lọc đối quang (chiral cavity) Gồm các cyclodextrin (CD) và dẫn chất (β – CD, dẫn chất sulfat hóa, alkylhydroxy hóa của β - CD), ether vòng, polymer

− Nhóm 4: chất chọn lọc đối quang dựa trên tương tác giữa nhóm cho điện tử π

và nhóm nhận điện tử π (chất chọn lọc kiểu Pirkle)

Trong các nhóm chất chọn lọc đối quang ở trên, nhóm cyclodextrin đặc biệt

là β-cyclodextrin và dẫn xuất của chúng được sử dụng rộng rãi nhất, có khả năng tách đồng phân quang học rất mạnh, cho kết quả tốt trên hầu hết các nhóm dược chất hoạt quang phổ biến [12]

Sử dụng các tác nhân chọn lọc đối quang kể trên, nhiều phương pháp tách đã

được sử dụng để phân tích các đồng phân đối quang, chủ yếu dựa trên các quá trình

sắc ký (như sắc ký lỏng, sắc ký khí, sắc ký lỏng siêu tới hạn) và điện di Trong đó, hai kỹ thuật phổ biến nhất hiện nay được áp dụng để phân tích các đồng phân đối quang là sắc ký lỏng hiệu năng cao và điện di mao quản [19] Phương pháp HPLC

có ba kỹ thuật để tách các đồng phân quang học trong hỗn hợp racemic:

Sử dụng chất tạo dẫn xuất hoạt quang

Sử dụng pha động chứa tác nhân chọn lọc hoạt quang và pha tĩnh không hoạt quang thông thường

Sử dụng cột tách chọn lọc (chiral stationary phases): Tác nhân chọn lọc hoạt quang được hấp phụ hoặc liên kết với pha tĩnh

Trong đó kỹ thuật sử dụng cột pha tĩnh hoạt quang là phương pháp được sử dụng phổ biến nhất do tính tiện lợi, nhanh chóng và chính xác, nhiều cột được thương mại hóa nhưng chi phí rất đắt Phương pháp CE cũng được sử dụng khá phổ biến trong phân tách đồng phân quang học với nhiều ưu điểm và chi phí kinh tế hơn

1.3.3 Ứng dụng CE trong phân tích đồng phân quang học

Điện di mao quản là kỹ thuật ngày càng được áp dụng rộng rãi hơn trong

phân tích đồng phân đối quang CE là một kỹ thuật bổ sung cho HPLC, đặc biệt đối

với việc phân tích hợp chất phân cực và tích điện Các chất chọn lọc hoạt quang sử dụng trong điện di mao quản chính là các chất chọn lọc đối quang được sử dụng các pha tĩnh của HPLC Tuy nhiên trong phương pháp điện di mao quản, các chất chọn

lọc đối quang được hòa tan vào dung dịch điện ly nền (BGE) và tạo phức chất không đối quang (diastereomeric complexes) với các đồng phân R, S của chất phân tích Từ các tính chất điện di khác nhau của các phức này khiến chúng có thể tách khỏi hỗn hợp racemic

Ưu điểm của phương pháp CE cho phép điều chỉnh linh hoạt điều kiện phân

tích để tối ưu hóa kết quả, độ đặc hiệu cao và thời gian phân tích ngắn, giá thành phân tích cũng giảm đi nhiều so với phương pháp HPLC sử dụng cột sắc ký có gắn chất chọn lọc hoạt quang đắt tiền, đồng thời lượng mẫu sử dụng ít giúp tiết kiệm hóa chất phân tích [27]

Việc tách đồng phân đối quang bằng CE có thể được thực hiện bằng phương pháp gián tiếp hoặc trực tiếp Các phương pháp trực tiếp thuận lợi hơn các phương pháp gián tiếp do sự đơn giản và tính sẵn có của một loạt các tác nhân chọn lọc đối quang như cyclodextrins (CDs), ether vòng được tetracarboxylat hóa và kháng sinh tạo phức lồng với các đồng phân đối quang Trong số đó, CD là tác nhân chọn lọc

đối quang được sử dụng phổ biến nhất Ngoài các CD tự nhiên, các dẫn xuất CD

khác nhau đã được thương mại hóa và chúng mang lại độ chọn lọc cao trong tách

đồng phân đối quang Bên cạnh cơ chế tạo phức lồng, các cơ chế khác dùng để tách đồng phân đối quang gồm trao đổi phối tử, tương tác ái lực (ví dụ: việc sử dụng

protein, kháng sinh là tác nhân chọn lọc đối quang), và tương tác mixen (ví dụ: sử dụng các bề mặt tự nhiên hay tổng hợp là tác nhân chọn lọc đối quang)[17]

Một số nghiên cứu dùng phương pháp CE sử dụng CM-β-CD làm tác nhân chọn lọc đối quang trong phân tích đồng phân quang học như phân tách chlorpheniramin maleat, amlodipin, lamivudin, ofloxacin [7], [12]

CYCLODEXTRIN LÀ TÁC NHÂN CHỌN LỌC ĐỐI QUANG

1.4.1 Tổng quan về Cyclodextrin

Cyclodextrin (CD) là oligosaccharid mạch vòng, gồm các đơn vị glucose liên kết với nhau bằng liên kết α-(1,4)-glucosid và được tạo ra từ phản ứng thủy phân tinh bột bằng enzym Mặc dù trong thực tế, có những CD hình thành từ 6

D-(+)-lên đến 12 đơn vị D-(+)-glucose đã được phân lập, tuy nhiên chỉ CD có 6,7,8 đơn vị D-(+)-glucose (tương ứng với α, β, γ-CD) là được sử dụng phổ biến

Hình dạng của CD được mô phỏng như một hình nón cụt rỗng với một khoang tương đối kỵ nước, có thể lưu giữ chất phân tích và mặt ngoài thân nước do

sự có mặt của các nhóm hydroxyl (vị trí 2, 3 và 6 của glucopyranose) Vành rộng hơn có chứa các nhóm hydroxyl thứ cấp đối quang, trong khi vành hẹp hơn chứa nhóm hydroxyl sơ cấp không đối quang Tính chất hóa lý của CD được trình bày trong bảng 1.1

Đường kính trong của khoang (nm) 0,47-0,52 0,60-0,64 0,75-0,83

Đường kính ngoài của khoang (nm) 1,46 ± 0,05 1,54 ± 0,04 1,75 ± 0,04

Độ tan trong nước ở 25 0

Giá trị pK a cho nhóm hydroxyl 12,1-12,6 12,1-12,6 12,1-12,6

Các nhóm hydroxyl có mặt trên vành của CD có thể dễ dàng được thay thế bởi các phản ứng hóa học để có được các dẫn xuất CD với các mức độ thế khác nhau, các thành phần CD biến đổi phụ thuộc vào một số thông số như điều kiện

phản ứng, loại và tỷ lệ thuốc thử…Một số lượng lớn các dẫn xuất của CD hiện đang

được sử dụng trong CE để phân tích đồng phân đối quang như dẫn xuất methyl,

hydroxyethyl, hydroxypropyl, acetyl hóa không tích điện và các dẫn xuất methylamino, sulphobutylether, carboxymethyl, sulfat, photphat hóa tích điện Các dẫn xuất của CD có thể biểu hiện tính chất rất khác so với những CD tự nhiên, có thể được sử dụng dễ dàng để cải thiện độ chọn lọc trong tách đồng phân đối quang,

ví dụ như tăng độ tan, tăng khả năng tạo ra các liên kết thứ cấp khác nhau, tiềm năng trong phân tích những hợp chất không tích điện, mức độ kị nước khác nhau của hốc kị nước Ví dụ, so sánh β - CD và DM - β- CD, có thể thấy rằng sự có mặt của các nhóm methoxy làm tăng hoặc độ sâu hoặc độ tan của tác nhân chọn lọc đối quang Nhóm thế tích điện hoặc không tích điện thay thế cho nhóm hydroxyl trên cấu trúc CD có thể rất có ích cho tối ưu phương pháp CE Trong thực tế, đồng phân không tích điện có thể được chuyển đến detector như chất phân tích tích điện do sự hình thành phức lồng với dẫn xuất của CD có nhóm thế tích điện Hơn nữa sự chuyển động của tác nhân chọn lọc đối quang theo hướng ngược lại với chất phân tích là điều kiện lý tưởng để đạt được độ phân giải tốt vì làm tăng sự khác biệt về linh độ giữa chất phân tích tự do và chất phân tích trong phức lồng [14], [19]

1.4.2 Tách đồng phân đối quang bằng CE sử dụng Cyclodextrin là tác nhân

chọn lọc đối quang

Nhiều dẫn xuất CD đã được phát triển để tăng khả năng hòa tan trong nước

và để thay đổi hình dạng khoang Tách đồng phân đối quang bằng CZE với CD là tác nhân chọn lọc đối quang lần đầu tiên được giới thiệu bởi Fanali và là kỹ thuật thành công nhất trong số các kỹ thuật để tách đồng phân đối quang của CE; số lượng các bài báo mô tả kỹ thuật này gia tăng đáng kể [24]

Trong cơ chế tạo phức lồng, hợp chất lồng khít vào khoang CD với toàn bộ phân tử hoặc với phần kỵ nước của phân tử; do đó, loại CD có vai trò rất quan trọng trong quá trình tách Tương tác kỵ nước với mình khoang kỵ nước không đủ để cho phép tách các đồng phân đối quang, liên kết yếu giữa các nhóm nhóm thế với trung tâm bất đối của chất phân tích và các nhóm hydroxyl thứ cấp và / hoặc sơ cấp của

CD đóng vai trò trong nhận dạng đối quang [14], [15], [24]

CD là một hợp chất trung hòa về điện và do đó chúng di chuyển với tốc độ của dòng EOF trong CZE Khi một chất tan tích điện được lồng vào khoang của

CD, phức lồng tạo thành có điện tích giống với chất tan tự do nhưng khối lượng phân tử tăng lên, và do đó linh độ điện di thấp hơn so với chất tan tự do Trong tách

đồng phân đối quang, các đồng phân có linh độ điện di đồng nhất và các đồng phân

trong phức lồng có thể có linh độ tương tự nhau Vì vậy, nguyên tắc của CZE sử dụng CD là tác nhân chọn lọc đối quang (CD - CZE) để tách đồng phân đối quang

là sự khác biệt giữa các hằng số bền của phức lồng tạo ra giữa các đồng phân đối quang với CD Đồng phân tạo phức lồng bền hơn thì có linh độ hiệu dụng thấp hơn Linh độ hiệu dụng là linh độ trung bình hoặc biểu kiến của chất tan trong điều kiện thử nghiệm, nhưng trong hầu hết các trường hợp, chúng ta sử dụng đơn giản là linh

độ [24]

Phân tách đồng phân đối quang có thể bị ảnh hưởng bởi các yếu tố như: loại

và nồng độ CD, pH, thành phần của BGE, nhiệt độ mao quản, hiệu điện thế…[14]

1.5 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH ĐỒNG PHÂN ĐỐI QUANG CỦA ATENOLOL

1.5.1 Nghiên cứu trong nước

Nhóm tác giả Tạ Mạnh Hùng, Trịnh Văn Lẩu, Nguyễn Thị Thu Hiền, Nguyễn Thị Kiều Anh [9], đã tách và định lượng đồng phân đối quang của atenolol bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao sử dụng:

Nghiên cứu tách đồng phân đối quang sử dụng HPLC đòi hỏi phải sử dụng cột sắc ký rất đắt tiền (pha tĩnh có gắn tác nhân chọn lọc đối quang) và mỗi loại cột chỉ sử dụng được với một số nhóm dược chất hoạt quang nhất định, đồng thời phương pháp này tiêu hao nhiều dung môi do lượng pha động sử dụng lớn, dung môi hữu cơ độc hại gây ô nhiễm môi trường

Nhóm tác giả Tạ Mạnh Hùng, Trịnh Văn Lẩu, Đinh Thị Thanh, Vũ Ngân Bình, Nguyễn Thị Kiều Anh [10], đã tách và định tính các đồng phân của atenolol bằng phương pháp điện di mao quản với điều kiện phân tích:

•Điện thế: 16 kV

Nghiên cứu này có thời gian phân tích các đồng phân khá dài khoảng 30 phút, và mới sơ bộ tách, định tính các đồng phân này Chúng tôi sẽ tiếp tục nghiên cứu phát triển, hoàn thiện phương pháp để ứng dụng vào định lượng các đồng phân quang học của atenolol

1.5.2 Nghiên cứu trên thế giới

Một số nghiên cứu định lượng đồng phân quang học của Atenolol đã được công bố trên thế giới

Nghiên cứu của Santoro M.I [23], sử dụng điều kiện sắc ký như sau:

Nghiên cứu của Eaga M.C [13], sử dụng điều kiện sắc ký như sau:

• Pha động: Dung dịch đệm phosphat 10 mM ( pH 7,0 ) - methanol = 95: 5

Trong hai nghiên cứu phân tách đồng phân quang học của atenolol dùng phương pháp HPLC sử dụng pha tĩnh hoạt quang, nghiên cứu của Santoro M.I thời gian lưu các đồng phân quang học của atenolol khoảng 10 và 12 phút, nghiên cứu của Eaga M.C có thời gian lưu 8 và 9 phút Tuy nhiên, phương pháp sắc ký pha thuận dùng cột Chiracel OD chi phí rất đắt tiền, trong khi dùng phương pháp sắc ký pha đảo dùng cột Chiral AGP khi phân tích atenolol racemic từ chế phẩm viên nén pic các đồng phân quang học của atenolol chưa tách khỏi nhau hoàn toàn

Nghiên cứu của Wei Wang, Jiande Lu, Xiaoyun Fu, Yaozu Chen [28], sử dụng

điều kiện điện di như sau:

điện di như sau:

hiệu dụng 40 cm, đường kính trong 50 µm

• Dung dịch điện di: Tris 50mM và CM-β-CD 8 mM, được điều chỉnh bằng acid phosphoric tới pH 4,0

độ 10 mM Dung dịch phân tích được chuẩn bị bằng cách pha loãng dung

dịch chuẩn gốc với đệm Tris tới nồng độ 0,2 mM Tất cả các dung dịch

được lọc qua màng lọc 0,22 µm

Trong hai nghiên cứu phân tách đồng phân quang học của atenolol dùng phương pháp CE, nghiên cứu của Wei Wang và cộng sự có thời gian di chuyển các đồng phân quang học của atenolol khoảng 40 phút, nghiên cứu của Wuhong

Li và cộng sự có thời gian di chuyển khoảng 18 phút Thời gian di chuyển của các đồng phân quang học của atenolol khá dài chưa phù hợp cho công tác kiểm nghiệm thực tế

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1.ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU, HÓA CHẤT, TRANG THIẾT BỊ

2.1.1.Đối tượng nghiên cứu

* Chế phẩm viên nén có chứa Atenolol 50 mg (dạng racemic):

- Viên nén Atenolol STADA 50 mg, SĐK: VD-12619-10, số lô: 051113, hạn dùng: 04/11/18, nhà sản xuất: công ty TNHH liên doanh STADA-VN

- Viên nén Tenormin 50 mg, SĐK: VN-1585-06, số lô: KD508, hạn dùng: 25/03/18, nhà sản xuất: Astra-Zeneca, Anh quốc

* Mẫu placebo: chứa các thành phần tá dược của viên do công ty STADA cung cấp gồm: tinh bột ngô, tinh bột tiền hồ hóa, lactose monohydrat, povidon K25, natri laurylsulfat, colloidal silica khan, magnesi stearat

2.1.2.Hóa chất, trang thiết bị

a) Hóa chất, chất chuẩn

hàm lượng: 100,17%, độ ẩm: 0,11% , số kiểm soát: 0102093

• Cột mao quản silica nung chảy, có vỏ bao polyimid loại có chiều dài hiệu dụng 48,5 cm và 64,5 cm , đường kính trong 50 µm của hãng Agilent

Thụy Sỹ

mức với thể tích khác nhau

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

2.2.1.Hoàn thiện phương pháp định lượng đồng phân đối quang của atenolol bằng điện di mao quản

2.3.PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1.Chuẩn bị các dung dịch chuẩn, dung dịch mẫu và các dung dịch làm việc

nước, chuyển vào bình định mức 250 ml, bổ sung nước tới vạch, lắc đều

đệm Tris 50 mM, điều chỉnh bằng acid phosphoric đặc tới pH 4,0 Cân chính xác

khoảng 0,0616 g CM-β-CD cho vào bình định mức 5 ml, bổ sung dung dịch đệm Tris 50 mM, pH 4,0 tới vạch, lắc đều

100 ml nước, lắc đều

thành 100 ml, lắc đều

atenolol racemic vào bình định mức 25 ml, thêm khoảng 20 ml dung dịch đệm Tris 50 mM, siêu âm 15 phút, sau đó bổ sung dung dịch đệm vừa đủ Bảo quản ở

loãng dung dịch chuẩn gốc bằng dung dịch đệm Tris 50 mM đến nồng độ yêu cầu trước khi phân tích

- Định lượng (chế phẩm viên nén atenolol 50 mg): cân chính xác 20 viên tính khối lượng trung bình viên, nghiền mịn Cân lượng bột viên tương ứng với khoảng 25 mg atenolol cho vào bình định mức 25 ml, thêm khoảng 20 ml đệm

Tris, siêu âm 15 phút, sau đó bổ sung dung dịch đệm vừa đủ, lọc thu lấy dịch lọc Lấy 0,5 ml dịch lọc cho vào bình định mức 5 ml, bổ sung dung dịch đệm Tris 50 mM đến vạch, lắc đều

- Thử độ hòa tan: Lọc dung dịch sau khi thử độ hòa tan qua màng lọc 0,2 µm trước khi phân tích

25 ml, thêm khoảng 20 ml dung dịch đệm Tris, siêu âm 15 phút, sau đó bổ sung dung dịch đệm vừa đủ, lắc đều sau đó lọc thu lấy dịch lọc Lấy 0,5 ml dịch lọc cho vào bình định mức 5 ml, bổ sung dung dịch đệm Tris 50 mM đến vạch, lắc

đều

Tất cả các dung dịch đều được lọc qua màng lọc 0,2 µm trước khi tiêm

2.3.2 Khảo sát và lựa chọn điều kiện điện di

Tác giả Đinh Thị Thanh và cộng sự [10] đã khảo sát các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình điện di gồm: lựa chọn dung dịch điện ly nền, loại tác nhân chọn lọc đối quang, pH dung dịch đệm, hiệu điện thế và nồng độ atenolol trong mẫu phân tích Dựa vào kết quả của đề tài này, chúng tôi đưa ra điều kiện điện di áp dụng cho nghiên cứu như sau:

atenolol racemic trong mẫu phân tích khoảng 100ppm (kl/tt) (tương ứng với khoảng 50ppm mỗi đơn đồng phân)

được rửa sạch với methanol trong 15 phút, tiếp theo là dung dịch acid

hydrocloric 0,1 M trong 15 phút, và dung dịch NaOH 1M trong 30 phút

dịch NaOH 0,1 M 15 phút, nước 5 phút, và với dung dịch điện ly nền (BGE)

15 phút

với nước trong 1 phút, dung dịch NaOH 0,1 M trong 2 phút, nước 2 phút, và BGE 2 phút

• Thời điểm cuối ngày, mao quản được rửa với dung dịch NaOH 0,1 M trong

20 phút, nước 20 phút, sau đó thổi khí 3 phút

a) Lựa chọn dung dịch điện ly nền

Tiến hành điện di dung dịch chuẩn atenolol racemic 100 ppm (kl/tt) sử dụng dung dịch điện ly nền lần lượt là dung dịch đệm phosphat 50 mM, pH 4,0, chứa CM-β-CD 8 mM và dung dịch đệm Tris 50 mM, pH 4,0, chứa CM-β-CD 8 mM

Dựa vào tín hiệu trên điện di đồ thu được, lựa chọn dung dịch điện ly nền thích hợp

b) Lựa chọn bước sóng phát hiện

Tiến hành quét phổ dung dịch chuẩn atenolol racemic 100 ppm (kl/tt) trong Tris 50 mM với bước sóng từ 190 đến 225 nm Dựa vào phổ hấp thụ tìm bước sóng tại đó độ hấp thụ của atenolol là cực đại

c) Lựa chọn cột mao quản

Chúng tôi tiến hành điện di dung dịch chuẩn atenolol racemic 100 ppm (kl/tt) với điều kiện điện di trên, sử dụng các cột mao quản khác nhau

d) Lựa chọn hiệu điện thế áp vào hai đầu mao quản

Sau khi lựa chọn được cột mao quản chúng tôi tiến hành khảo sát lại hiệu

điện thế áp vào hai đầu mao quản Thay đổi hiệu điện thế áp vào hai đầu mao quản

từ 15 đến 30 kV (XE= 5 kV) và tiến hành phân tích mẫu, lựa chọn hiệu điện thế phù hợp

e) Lựa chọn nồng độ tác nhân chọn lọc đối quang

Tiến hành điện di dung dịch chuẩn atenolol racemic 100 ppm với điều kiện

điện di đã lựa chọn ở trên và thay đổi nồng độ tác nhân chọn lọc đối quang

CM-β-CD từ 6 mM đến 10 mM Dựa vào tín hiệu trên điện di đồ thu được, lựa chọn nồng

độ CM-β-CD thích hợp

2.3.3 Thẩm định phương pháp phân tích

Sau khi khảo sát, lựa chọn được điều kiện điện di tiến hành thẩm định để

đảm bảo phương pháp xây dựng được là phù hợp Các tiêu chí cần thẩm định bao

gồm: độ phù hợp của hệ thống, độ đặc hiệu, khoảng nồng độ tuyến tính, độ lặp lại

và độ đúng của phương pháp

Độ phù hợp hệ thống

Đánh giá độ phù hợp hệ thống là phép thử nhằm đánh giá độ ổn định của

toàn hệ thống phân tích bao gồm bởi các yếu tố như: máy móc, thiết bị, cách tiến hành phân tích, mẫu thử…

Các thông số được sử dụng để đánh giá độ phù hợp của hệ thống bao gồm độ

(RSD) của các đáp ứng phân tích khi tiêm mẫu lặp lại Yêu cầu các giá trị thời gian

Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần cùng một dung dịch chuẩn atenolol racemic 100 ppm trong cùng điều kiện điện di

Độ đặc hiệu

Chuẩn bị mẫu placebo, mẫu thử và mẫu chuẩn atenolol racemic 100 ppm, mẫu S- atenolol 50 ppm và tiến hành điện di với các điều kiện đã chọn được ở trên Yêu cầu trên điện di đồ pic của các đồng phân phải tách hoàn toàn so với pic của chất tạp Trên điện di đồ của mẫu placebo, tại thời điểm ứng với pic của R-/S- atenolol không được có pic xuất hiện Thời gian di chuyển và hình dáng pic trên

điện di đồ của mẫu thử và mẫu chuẩn phải như nhau

Khoảng nồng độ tuyến tính

Để đảm bảo phép định lượng cho kết quả chính xác, cần xác định khoảng nồng độ mà ở đó có sự tương quan tuyến tính giữa đáp ứng phân tích (diện tích pic) với nồng độ chất phân tích

Triển khai điện di dãy dung dịch chuẩn atenolol racemic có nồng độ từ 40 ppm đến 140 ppm Mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ chất phân tích

được biểu diễn bằng phương trình hồi quy tuyến tính và hệ số tương quan hồi quy Đường hồi quy có dạng gần như đường thẳng và hệ số tương quan hồi quy xấp xỉ 1

Độ chính xác

Độ chính xác của một phương pháp phân tích là mức độ thống nhất giữa các

kết quả riêng biệt khi quy trình phân tích được tiến hành lặp đi lặp lại nhiều lần trên cùng một mẫu đồng nhất Độ chính xác được biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối

(RSD) Nghiên cứu cần tiến hành đánh giá độ lặp lại và độ chính xác trung gian

− Độ lặp lại: Cùng điều kiện thí nghiệm trong khoảng thời gian ngắn (như

trong cùng một ngày)

− Độ chính xác trung gian: Cùng phòng thí nghiệm, thực hiện ở các ngày khác

nhau và/ hoặc người phân tích khác nhau và/hoặc trên thiết bị khác nhau Tiến hành điện di xác định nồng độ atenolol trong 6 mẫu thử độc lập có nồng

độ khoảng 100 ppm Đánh giá độ lặp lại của kết quả thu được thông qua độ lệch

chuẩn tương đối RSD, yêu cầu RSD ≤ 2%

Độ đúng

Độ đúng của phương pháp là mức độ gần sát của kết quả phân tích với giá trị

thực của mẫu đã biết

Tiến hành: Thêm chuẩn vào các mẫu placebo ở các mức nồng độ 80%, 100%, 120% nồng độ định lượng Tiến hành điện di dung dịch thêm chuẩn, dựa vào diện tích pic của các dung dịch này và đường chuẩn ta tính % tìm lại lượng chất chuẩn thêm vào Độ đúng của phương pháp tại mỗi nồng độ phải nằm trong khoảng

lượng ghi trên nhãn [1]

* Đánh giá độ hòa tan các đồng phân quang học của atenolol trong chế phẩm viên nén

Tiến hành thử độ hòa tan các chế phẩm viên nén Tenormin 50 mg và Atenolol STADA 50 mg ở môi trường dung dịch HCl 0,1 N, sau đó định lượng các

đồng phân đối quang được hòa tan trong từng cốc thử bằng phương pháp đã xây

dựng, từ đó rút ra nhận xét sự giải phóng và hòa tan các đồng phân đối quang của atenolol trong các chế phẩm viên nén [1]

x n

x

1

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 KHẢO SÁT VÀ LỰA CHỌN ĐIỀU KIỆN ĐIỆN DI

3.1.1 Lựa chọn dung dịch điện ly nền

Nhằm giảm dâng cao đường nền, chúng tôi tiến hành điện di sử dụng dung dịch điện ly nền là dung dịch đệm phosphat 50 mM, pH 4,0 so với dung dịch đệm Tris 50 mM, pH 4,0 đã được lựa chọn ở nghiên cứu trước [10]

Tiến hành điện di theo điều kiện: cột mao quản chiều dài tổng cộng 48,5 cm,

tiêm mẫu 50 mbar x3s, điện thế 25 kV, dung dịch chuẩn atenolol racemic 100 ppm (kl/tt) sử dụng dung dịch điện di lần lượt là dung dịch đệm phosphat 50 mM, pH 4,0, chứa CM-β-CD 8 mM và dung dịch đệm Tris 50 mM, pH 4,0, chứa CM-β-CD

17.716

Area: 2

21.254

Nhận xét:

Từ kết quả ở hình 3.1, nhận thấy khi dùng dung dịch đệm phosphat 50 mM thì đường nền nhiễu, pic bị chẻ ngọn Trong khi sử dụng dung dịch đệm Tris thì

đường nền ổn định và các pic gọn, tách nhau hoàn toàn Do đó chúng tôi lựa chọn

dung dịch đệm Tris 50 mM là dung dịch điện ly nền cho nghiên cứu tiếp theo

3.1.2 Lựa chọn bước sóng phát hiện

Tiến hành quét phổ dung dịch chuẩn atenolol racemic 100 ppm (kl/tt) trong Tris 50 mM với bước sóng từ 190 đến 225 nm Dựa vào phổ hấp thụ tìm bước sóng tại đó độ hấp thụ của atenolol là cực đại

Kết quả:

Tại bước sóng 194 nm, độ hấp thụ của atenolol trong dung dịch Tris 50 mM

là cực đại Do đó, lựa chọn bước sóng phát hiện cho nghiên cứu định lượng atenolol tiếp theo là 194 nm

3.1.3 Lựa chọn cột mao quản

Theo tác giả Đinh Thị Thanh và cộng sự [10], khi sử dụng cột mao quản có chiều dài tổng cộng 60,0 cm, chiều dài hiệu dụng 50,0 cm, đường kính trong 75 µm thì thời gian phân tích mẫu khá dài (thời gian luyện cột- rửa cột giữa 2 lần phân tích liên tiếp là 16 phút, thời gian phân tích mẫu khoảng 30 phút) Do đó, chúng tôi khảo sát lựa chọn một số cột mao quản khác nhằm giảm thời gian phân tích mẫu và nhiễu

đường nền so với nghiên cứu trước

Tiến hành điện di dung dịch atenolol racemic chuẩn 100 ppm (kl/tt) với điều

dịch điện di Tris 50 mM, pH 4,0, chứa CM-β-CD 8 mM, sử dụng các cột mao quản silica nung chảy, có vỏ bao polyimid với các thông số cột như sau:

So sánh tín hiệu thu được để lựa chọn cột phù hợp cho nghiên cứu tiếp theo

Dữ liệu điện di đồ thu được như sau

a)

b)

Hình 3.2 Điện di đồ của dung dịch atenolol racemic 100 ppm khi sử dụng với

các mao quản khác nhau

a) Mao quản 1; b) Mao quản 2 Nhận xét:

Từ kết quả ở hình 3.3, nhận thấy khi dùng mao quản 1 có chiều dài hiệu dụng 56,0 cm thì đường nền nhiễu và thời gian di chuyển của các đồng phân của atenolol khá dài (trên 35 phút), trong khi sử dụng mao quản 2 có chiều dài hiệu dụng 40,0 cm thì điện di đồ thu được có đường nền ổn định và thời gian di chuyển của các đồng phân được rút ngắn lại (hơn 9 phút) và độ phân giải vẫn đạt yêu cầu Như vậy, chúng tôi lựa chọn cột mao quản số 2 có chiều dài tổng cộng 48,5 cm, chiều dài hiệu dụng 40,0 cm, đường kính trong 50 µm cho nghiên cứu tiếp theo

3.1.4 Lựa chọn hiệu điện thế áp vào hai đầu mao quản

Thay đổi hiệu điện thế áp vào hai đầu mao quản từ 15 đến 30 kV (XE= 5 kV)

và tiến hành điện di dung dịch chuẩn atenolol racemic 100 ppm (kl/tt) với các điều kiện điện di: cột mao quản chiều dài tổng cộng 48,5 cm, chiều dài hiệu dụng 40,0

72.35

A

rea:72 385

cm, đường kính trong 50 µm; nhiệt độ mao quản 200 C, tiêm mẫu 50 mbar x3s, dung dịch điện di Tris 50 mM, pH 4,0, chứa CM-β-CD 8 mM, từ dữ liệu điện di đồ thu

được lựa chọn điện thế sử dụng phù hợp Điện di đồ thu được như sau

41.40

Area: 2

46.70