Một số nghiên cứu định lượng đồng phân quang học của Atenolol đã được công bố trên thế giới.
Nghiên cứu của Santoro M.I [23], sử dụng điều kiện sắc ký như sau:
•Cột sắc ký hoạt quang: Chiralcel OD (250 x 4,6 mm; 10 µm).
•Pha động: Hexan - ethanol - diethylamine = 75: 25: 0,1.
•Tốc độ dòng: 0,7 ml/ phút.
•Bước sóng phát hiện: 276 nm.
Nghiên cứu của Eaga M.C [13], sử dụng điều kiện sắc ký như sau:
- 18 -
•Pha động: Dung dịch đệm phosphat 10 mM ( pH 7,0 ) - methanol = 95: 5.
•Tốc độ dòng: 0,9 ml/ phút.
•Bước sóng phát hiện: 225 nm.
Trong hai nghiên cứu phân tách đồng phân quang học của atenolol dùng phương pháp HPLC sử dụng pha tĩnh hoạt quang, nghiên cứu của Santoro M.I thời gian lưu các đồng phân quang học của atenolol khoảng 10 và 12 phút, nghiên cứu của Eaga M.C có thời gian lưu 8 và 9 phút. Tuy nhiên, phương pháp sắc ký pha thuận dùng cột Chiracel OD chi phí rất đắt tiền, trong khi dùng phương pháp sắc ký pha đảo dùng cột Chiral AGP khi phân tích atenolol racemic từ chế phẩm viên nén pic các đồng phân quang học của atenolol chưa tách khỏi nhau hoàn toàn.
Nghiên cứu của Wei Wang, Jiande Lu, Xiaoyun Fu, Yaozu Chen [28], sử dụng
điều kiện điện di như sau:
• Cột mao quản silica nung chảy, chiều dài tổng cộng 50 cm, chiều dài hiệu dụng 45 cm, đường kính trong 50 µm.
• Tiêm mẫu 3psi x 1s.
• Điện thế 18 kV.
• Nhiệt độ mao quản 250C.
• Bước sóng phát hiện : 214 nm.
• Dung dịch điện di: đệm H3PO4-Triethanolamin100mM; pH 3,1; nồng độ
CM-β-CD 7,8 mg/ml.
Nghiên cứu của Wuhong Li, Changhai Liu, Guangguo Tan, Xinrong Zhang, Zhenyu Zhu, Yifeng Chai [29] sau khi khảo sát và lựa chọn, đưa ra điều kiện
điện di như sau:
• Cột mao quản silica nung chảy, chiều dài tổng cộng 48,5 cm, chiều dài hiệu dụng 40 cm, đường kính trong 50 µm.
• Tiêm mẫu: 50 mbar x 3s.
• Hiệu điện thế: 24 kV.
• Nhiệt độ mao quản: 20oC
- 19 -
• Dung dịch điện di: Tris 50mM và CM-β-CD 8 mM, được điều chỉnh bằng acid phosphoric tới pH 4,0.
• Dung dịch chuẩn gốc: hòa tan trong dung dịch đệm Tris 50 mM ở nồng
độ 10 mM. Dung dịch phân tích được chuẩn bị bằng cách pha loãng dung dịch chuẩn gốc với đệm Tris tới nồng độ 0,2 mM. Tất cả các dung dịch
được lọc qua màng lọc 0,22 µm.
Trong hai nghiên cứu phân tách đồng phân quang học của atenolol dùng phương pháp CE, nghiên cứu của Wei Wang và cộng sự có thời gian di chuyển các đồng phân quang học của atenolol khoảng 40 phút, nghiên cứu của Wuhong Li và cộng sự có thời gian di chuyển khoảng 18 phút. Thời gian di chuyển của các đồng phân quang học của atenolol khá dài chưa phù hợp cho công tác kiểm nghiệm thực tế.
- 20 -
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1.ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU, HÓA CHẤT, TRANG THIẾT BỊ
2.1.1.Đối tượng nghiên cứu
* Chế phẩm viên nén có chứa Atenolol 50 mg (dạng racemic):
- Viên nén Atenolol STADA 50 mg, SĐK: VD-12619-10, số lô: 051113, hạn dùng: 04/11/18, nhà sản xuất: công ty TNHH liên doanh STADA-VN.
- Viên nén Tenormin 50 mg, SĐK: VN-1585-06, số lô: KD508, hạn dùng: 25/03/18, nhà sản xuất: Astra-Zeneca, Anh quốc.
* Mẫu placebo: chứa các thành phần tá dược của viên do công ty STADA cung cấp gồm: tinh bột ngô, tinh bột tiền hồ hóa, lactose monohydrat, povidon K25, natri laurylsulfat, colloidal silica khan, magnesi stearat.
2.1.2.Hóa chất, trang thiết bị
a) Hóa chất, chất chuẩn.
•Chất chuẩn Atenolol (racemic) của Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương, hàm lượng: 100,17%, độẩm: 0,11% , số kiểm soát: 0102093.
•Chuẩn S-atenolol, hãng sản xuất Sigma – Aldrich, Mỹ, hàm lượng 99%, số
lô 021M4620V.
•Carboxymethyl-β-cyclodextrin (CM-β-CD), dạng muối natri của Sigma- Aldrich, Mỹ
Hóa chất, dung môi đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích của Merck KGaA, Đức.
• Natri hydroxyd
• Tris (hydroxymethyl amino methan (Tris)
• Acid phosphoric 85%
• Acid hydrocloric
• Methanol
b) Trang thiết bị
• Máy điện di mao quản Agilent, model: G1600AX, số seri: DE1603499, của Agilent, Mỹ.
- 21 -
• Cột mao quản silica nung chảy, có vỏ bao polyimid loại có chiều dài hiệu dụng 48,5 cm và 64,5 cm , đường kính trong 50 µm của hãng Agilent.
• Máy thửđộ hòa tan Logan UDT 804, Mỹ
• Máy quang phổ UV-VIS SHIMADZU 1800, Nhật Bản.
• Máy đo pH (744 pH meter), của Metrohm, Thụy Sỹ.
• Cân phân tích Mettler Toledo AL2004, d= 0,1 mg và XS105DU, d=0,01 mg, Thụy Sỹ.
• Máy siêu âm Ultrasonic LC 30, hãng cung cấp: Elma, Đức
• Máy cất nước hai lần Hamilton WSC/4D, Anh.
• Hệ thống lọc nước siêu sạch Labostar-1, hãng sản xuất Siemens, Đức.
• Màng lọc cellulose acetat với kích thước lỗ lọc 0,2 µm của Sartorius, Đức.
• Bộ lọ nhựa đựng mẫu và nắp đậy.
• Các dụng cụ chính xác: các pipet chính xác với thể tích khác nhau, bình định mức với thể tích khác nhau.
• Các dụng cụ khác: cốc có mỏ, giấy lọc, phễu thủy tinh…
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
2.2.1.Hoàn thiện phương pháp định lượng đồng phân đối quang của atenolol bằng điện di mao quản. bằng điện di mao quản. • Lựa chọn dung dịch điện ly nền. • Lựa chọn bước sóng phát hiện. • Lựa chọn cột mao quản. • Lựa chọn hiệu điện thế. • Lựa chọn nồng độ tác nhân chọn lọc đối quang. 2.2.2.Thẩm định phương pháp phân tích.
• Xác định hàm lượng đồng phân (R), (S)-atenolol trong chuẩn atenolol racemic.
• Độ phù hợp hệ thống.
• Khoảng nồng độ tuyến tính.
- 22 -
• Độ lặp lại.
• Độđúng.
2.2.3. Ứng dụng:
* Định lượng các đồng phân đối quang của atenolol trong một số chế phẩm có chứa atenolol trên thị trường.
* Đánh giá độ hòa tan các đồng phân quang học của atenolol trong chế phẩm viên nén.
2.3.PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1.Chuẩn bị các dung dịch chuẩn, dung dịch mẫu và các dung dịch làm việc.
• Dung dịch đệm Tris 50mM: cân khoảng 1,51 g Tris vào cốc có mỏ, hòa tan bằng nước, chuyển vào bình định mức 250 ml, bổ sung nước tới vạch, lắc đều.
• Dung dịch điện di Tris 50 mM chứa CM-β-CD 8mM, pH 4,0: pha dung dịch
đệm Tris 50 mM, điều chỉnh bằng acid phosphoric đặc tới pH 4,0. Cân chính xác khoảng 0,0616 g CM-β-CD cho vào bình định mức 5 ml, bổ sung dung dịch đệm Tris 50 mM, pH 4,0 tới vạch, lắc đều.
• Dung dịch NaOH 1 N: cân khoảng 4 g NaOH cho vào cốc có mỏ, hòa tan trong 100 ml nước, lắc đều.
• Dung dịch NaOH 0,1 N: Lấy 10 ml dung dịch NaOH 1 M, pha loãng và vừa đủ
thành 100 ml, lắc đều.
• Dung dịch chuẩn gốc atenolol 1000 ppm: cân chính xác khoảng 25 mg chuẩn atenolol racemic vào bình định mức 25 ml, thêm khoảng 20 ml dung dịch đệm Tris 50 mM, siêu âm 15 phút, sau đó bổ sung dung dịch đệm vừa đủ. Bảo quản ở
4o C, tránh ánh sáng. Các dung dịch phân tích được chuẩn bị bằng cách pha loãng dung dịch chuẩn gốc bằng dung dịch đệm Tris 50 mM đến nồng độ yêu cầu trước khi phân tích.
• Dung dịch thử:
- Định lượng (chế phẩm viên nén atenolol 50 mg): cân chính xác 20 viên tính khối lượng trung bình viên, nghiền mịn. Cân lượng bột viên tương ứng với khoảng 25 mg atenolol cho vào bình định mức 25 ml, thêm khoảng 20 ml đệm
- 23 -
Tris, siêu âm 15 phút, sau đó bổ sung dung dịch đệm vừa đủ, lọc thu lấy dịch lọc. Lấy 0,5 ml dịch lọc cho vào bình định mức 5 ml, bổ sung dung dịch đệm Tris 50 mM đến vạch, lắc đều.
- Thử độ hòa tan: Lọc dung dịch sau khi thử độ hòa tan qua màng lọc 0,2 µm trước khi phân tích.
• Dung dịch placebo: cân khoảng 0,1 g bột mẫu placebo cho vào bình định mức 25 ml, thêm khoảng 20 ml dung dịch đệm Tris, siêu âm 15 phút, sau đó bổ sung dung dịch đệm vừa đủ, lắc đều sau đó lọc thu lấy dịch lọc. Lấy 0,5 ml dịch lọc cho vào bình định mức 5 ml, bổ sung dung dịch đệm Tris 50 mM đến vạch, lắc
đều.
Tất cả các dung dịch đều được lọc qua màng lọc 0,2 µm trước khi tiêm.
2.3.2. Khảo sát và lựa chọn điều kiện điện di
Tác giả Đinh Thị Thanh và cộng sự [10] đã khảo sát các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình điện di gồm: lựa chọn dung dịch điện ly nền, loại tác nhân chọn lọc đối quang, pH dung dịch đệm, hiệu điện thế và nồng độ atenolol trong mẫu phân tích. Dựa vào kết quả của đề tài này, chúng tôi đưa ra điều kiện điện di áp dụng cho nghiên cứu như sau:
• Phương pháp được tiến hành trên hệ thống điện di mao quản với detector mảng diod. Nhiệt độ mao quản 200C. Tiêm mẫu 50 mbar x 3s. Nồng độ
atenolol racemic trong mẫu phân tích khoảng 100ppm (kl/tt) (tương ứng với khoảng 50ppm mỗi đơn đồng phân).
• Xử lý mao quản mới: Trước khi sử dụng lần đầu tiên, cột mao quản mới
được rửa sạch với methanol trong 15 phút, tiếp theo là dung dịch acid hydrocloric 0,1 M trong 15 phút, và dung dịch NaOH 1M trong 30 phút.
• Hàng ngày, vào thời điểm đầu ngày các mao quản được rửa sạch bằng dung dịch NaOH 0,1 M 15 phút, nước 5 phút, và với dung dịch điện ly nền (BGE) 15 phút.
• Giữa mỗi lần chạy, chương trình luyện cột (preconditioning) được thực hiện với nước trong 1 phút, dung dịch NaOH 0,1 M trong 2 phút, nước 2 phút, và BGE 2 phút.
- 24 -
• Thời điểm cuối ngày, mao quản được rửa với dung dịch NaOH 0,1 M trong 20 phút, nước 20 phút, sau đó thổi khí 3 phút.
a) Lựa chọn dung dịch điện ly nền
Tiến hành điện di dung dịch chuẩn atenolol racemic 100 ppm (kl/tt) sử dụng dung dịch điện ly nền lần lượt là dung dịch đệm phosphat 50 mM, pH 4,0, chứa CM-β-CD 8 mM và dung dịch đệm Tris 50 mM, pH 4,0, chứa CM-β-CD 8 mM.
Dựa vào tín hiệu trên điện di đồ thu được, lựa chọn dung dịch điện ly nền thích hợp.
b) Lựa chọn bước sóng phát hiện
Tiến hành quét phổ dung dịch chuẩn atenolol racemic 100 ppm (kl/tt) trong Tris 50 mM với bước sóng từ 190 đến 225 nm. Dựa vào phổ hấp thụ tìm bước sóng tại đó độ hấp thụ của atenolol là cực đại.
c) Lựa chọn cột mao quản
Chúng tôi tiến hành điện di dung dịch chuẩn atenolol racemic 100 ppm (kl/tt) với điều kiện điện di trên, sử dụng các cột mao quản khác nhau.
d) Lựa chọn hiệu điện thế áp vào hai đầu mao quản
Sau khi lựa chọn được cột mao quản chúng tôi tiến hành khảo sát lại hiệu
điện thế áp vào hai đầu mao quản. Thay đổi hiệu điện thế áp vào hai đầu mao quản từ 15 đến 30 kV (XE= 5 kV) và tiến hành phân tích mẫu, lựa chọn hiệu điện thế phù hợp.
e) Lựa chọn nồng độ tác nhân chọn lọc đối quang
Tiến hành điện di dung dịch chuẩn atenolol racemic 100 ppm với điều kiện
điện di đã lựa chọn ở trên và thay đổi nồng độ tác nhân chọn lọc đối quang CM-β- CD từ 6 mM đến 10 mM. Dựa vào tín hiệu trên điện di đồ thu được, lựa chọn nồng
độ CM-β-CD thích hợp.
2.3.3 Thẩm định phương pháp phân tích
Sau khi khảo sát, lựa chọn được điều kiện điện di tiến hành thẩm định để đảm bảo phương pháp xây dựng được là phù hợp. Các tiêu chí cần thẩm định bao gồm: độ phù hợp của hệ thống, độ đặc hiệu, khoảng nồng độ tuyến tính, độ lặp lại và độđúng của phương pháp.
- 25 -
Độ phù hợp hệ thống
Đánh giá độ phù hợp hệ thống là phép thử nhằm đánh giá độ ổn định của toàn hệ thống phân tích bao gồm bởi các yếu tố như: máy móc, thiết bị, cách tiến hành phân tích, mẫu thử…
Các thông sốđược sử dụng đểđánh giá độ phù hợp của hệ thống bao gồm độ
phân giải Rs giữa các pic của đồng phân S và R-atenolol và độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của các đáp ứng phân tích khi tiêm mẫu lặp lại. Yêu cầu các giá trị thời gian di chuyển, diện tích pic của mỗi đồng phân có RSD ≤ 2 %, Rs > 2.
Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần cùng một dung dịch chuẩn atenolol racemic 100 ppm trong cùng điều kiện điện di.
Độđặc hiệu
Chuẩn bị mẫu placebo, mẫu thử và mẫu chuẩn atenolol racemic 100 ppm, mẫu S- atenolol 50 ppm và tiến hành điện di với các điều kiện đã chọn được ở trên. Yêu cầu trên điện di đồ pic của các đồng phân phải tách hoàn toàn so với pic của chất tạp. Trên điện di đồ của mẫu placebo, tại thời điểm ứng với pic của R-/S- atenolol không được có pic xuất hiện. Thời gian di chuyển và hình dáng pic trên
điện di đồ của mẫu thử và mẫu chuẩn phải như nhau.
Khoảng nồng độ tuyến tính
Để đảm bảo phép định lượng cho kết quả chính xác, cần xác định khoảng nồng độ mà ởđó có sự tương quan tuyến tính giữa đáp ứng phân tích (diện tích pic) với nồng độ chất phân tích.
Triển khai điện di dãy dung dịch chuẩn atenolol racemic có nồng độ từ 40 ppm đến 140 ppm. Mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ chất phân tích
được biểu diễn bằng phương trình hồi quy tuyến tính và hệ số tương quan hồi quy.
Đường hồi quy có dạng gần nhưđường thẳng và hệ số tương quan hồi quy xấp xỉ 1.
Độ chính xác
Độ chính xác của một phương pháp phân tích là mức độ thống nhất giữa các kết quả riêng biệt khi quy trình phân tích được tiến hành lặp đi lặp lại nhiều lần trên cùng một mẫu đồng nhất. Độ chính xác được biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối (RSD). Nghiên cứu cần tiến hành đánh giá độ lặp lại và độ chính xác trung gian.
- 26 -
− Độ lặp lại: Cùng điều kiện thí nghiệm trong khoảng thời gian ngắn (như
trong cùng một ngày)
− Độ chính xác trung gian: Cùng phòng thí nghiệm, thực hiện ở các ngày khác nhau và/ hoặc người phân tích khác nhau và/hoặc trên thiết bị khác nhau. Tiến hành điện di xác định nồng độ atenolol trong 6 mẫu thửđộc lập có nồng
độ khoảng 100 ppm. Đánh giá độ lặp lại của kết quả thu được thông qua độ lệch chuẩn tương đối RSD, yêu cầu RSD ≤ 2%.
Độđúng
Độđúng của phương pháp là mức độ gần sát của kết quả phân tích với giá trị
thực của mẫu đã biết.
Tiến hành: Thêm chuẩn vào các mẫu placebo ở các mức nồng độ 80%, 100%, 120% nồng độ định lượng. Tiến hành điện di dung dịch thêm chuẩn, dựa vào diện tích pic của các dung dịch này và đường chuẩn ta tính % tìm lại lượng chất chuẩn thêm vào. Độđúng của phương pháp tại mỗi nồng độ phải nằm trong khoảng từ 98 % đến 102 % [17].
2.3.4 Ứng dụng
* Định lượng các đồng phân đối quang của atenolol trong một số chế phẩm có chứa atenolol trên thị trường.
Tiến hành điện di các mẫu chuẩn atenolol racemic và mẫu thử. Dựa vào diện tích pic của mẫu thử và mẫu chuẩn, hàm lượng atenolol racemic của mẫu chuẩn để
xác định hàm lượng từng đồng phân atenolol trong mẫu thử.
Hàm lượng atenolol, C14H22N2O3, phải đạt được từ 90,0 đến 110,0% so với lượng ghi trên nhãn [1].
* Đánh giá độ hòa tan các đồng phân quang học của atenolol trong chế phẩm viên nén.
Tiến hành thử độ hòa tan các chế phẩm viên nén Tenormin 50 mg và Atenolol STADA 50 mg ở môi trường dung dịch HCl 0,1 N, sau đó định lượng các
đồng phân đối quang được hòa tan trong từng cốc thử bằng phương pháp đã xây dựng, từđó rút ra nhận xét sự giải phóng và hòa tan các đồng phân đối quang của atenolol trong các chế phẩm viên nén [1].
- 27 - 2.3.5 Phương pháp xử lý số liệu
Tính toán và xử lý thống kê số liệu trên phần mềm Microsoft Excel 2007.