bằng điện di mao quản. • Lựa chọn dung dịch điện ly nền. • Lựa chọn bước sóng phát hiện. • Lựa chọn cột mao quản. • Lựa chọn hiệu điện thế. • Lựa chọn nồng độ tác nhân chọn lọc đối quang. 2.2.2.Thẩm định phương pháp phân tích.
• Xác định hàm lượng đồng phân (R), (S)-atenolol trong chuẩn atenolol racemic.
• Độ phù hợp hệ thống.
• Khoảng nồng độ tuyến tính.
- 22 -
• Độ lặp lại.
• Độđúng.
2.2.3. Ứng dụng:
* Định lượng các đồng phân đối quang của atenolol trong một số chế phẩm có chứa atenolol trên thị trường.
* Đánh giá độ hòa tan các đồng phân quang học của atenolol trong chế phẩm viên nén.
2.3.PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1.Chuẩn bị các dung dịch chuẩn, dung dịch mẫu và các dung dịch làm việc.
• Dung dịch đệm Tris 50mM: cân khoảng 1,51 g Tris vào cốc có mỏ, hòa tan bằng nước, chuyển vào bình định mức 250 ml, bổ sung nước tới vạch, lắc đều.
• Dung dịch điện di Tris 50 mM chứa CM-β-CD 8mM, pH 4,0: pha dung dịch
đệm Tris 50 mM, điều chỉnh bằng acid phosphoric đặc tới pH 4,0. Cân chính xác khoảng 0,0616 g CM-β-CD cho vào bình định mức 5 ml, bổ sung dung dịch đệm Tris 50 mM, pH 4,0 tới vạch, lắc đều.
• Dung dịch NaOH 1 N: cân khoảng 4 g NaOH cho vào cốc có mỏ, hòa tan trong 100 ml nước, lắc đều.
• Dung dịch NaOH 0,1 N: Lấy 10 ml dung dịch NaOH 1 M, pha loãng và vừa đủ
thành 100 ml, lắc đều.
• Dung dịch chuẩn gốc atenolol 1000 ppm: cân chính xác khoảng 25 mg chuẩn atenolol racemic vào bình định mức 25 ml, thêm khoảng 20 ml dung dịch đệm Tris 50 mM, siêu âm 15 phút, sau đó bổ sung dung dịch đệm vừa đủ. Bảo quản ở
4o C, tránh ánh sáng. Các dung dịch phân tích được chuẩn bị bằng cách pha loãng dung dịch chuẩn gốc bằng dung dịch đệm Tris 50 mM đến nồng độ yêu cầu trước khi phân tích.
• Dung dịch thử:
- Định lượng (chế phẩm viên nén atenolol 50 mg): cân chính xác 20 viên tính khối lượng trung bình viên, nghiền mịn. Cân lượng bột viên tương ứng với khoảng 25 mg atenolol cho vào bình định mức 25 ml, thêm khoảng 20 ml đệm
- 23 -
Tris, siêu âm 15 phút, sau đó bổ sung dung dịch đệm vừa đủ, lọc thu lấy dịch lọc. Lấy 0,5 ml dịch lọc cho vào bình định mức 5 ml, bổ sung dung dịch đệm Tris 50 mM đến vạch, lắc đều.
- Thử độ hòa tan: Lọc dung dịch sau khi thử độ hòa tan qua màng lọc 0,2 µm trước khi phân tích.
• Dung dịch placebo: cân khoảng 0,1 g bột mẫu placebo cho vào bình định mức 25 ml, thêm khoảng 20 ml dung dịch đệm Tris, siêu âm 15 phút, sau đó bổ sung dung dịch đệm vừa đủ, lắc đều sau đó lọc thu lấy dịch lọc. Lấy 0,5 ml dịch lọc cho vào bình định mức 5 ml, bổ sung dung dịch đệm Tris 50 mM đến vạch, lắc
đều.
Tất cả các dung dịch đều được lọc qua màng lọc 0,2 µm trước khi tiêm.
2.3.2. Khảo sát và lựa chọn điều kiện điện di
Tác giả Đinh Thị Thanh và cộng sự [10] đã khảo sát các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình điện di gồm: lựa chọn dung dịch điện ly nền, loại tác nhân chọn lọc đối quang, pH dung dịch đệm, hiệu điện thế và nồng độ atenolol trong mẫu phân tích. Dựa vào kết quả của đề tài này, chúng tôi đưa ra điều kiện điện di áp dụng cho nghiên cứu như sau:
• Phương pháp được tiến hành trên hệ thống điện di mao quản với detector mảng diod. Nhiệt độ mao quản 200C. Tiêm mẫu 50 mbar x 3s. Nồng độ
atenolol racemic trong mẫu phân tích khoảng 100ppm (kl/tt) (tương ứng với khoảng 50ppm mỗi đơn đồng phân).
• Xử lý mao quản mới: Trước khi sử dụng lần đầu tiên, cột mao quản mới
được rửa sạch với methanol trong 15 phút, tiếp theo là dung dịch acid hydrocloric 0,1 M trong 15 phút, và dung dịch NaOH 1M trong 30 phút.
• Hàng ngày, vào thời điểm đầu ngày các mao quản được rửa sạch bằng dung dịch NaOH 0,1 M 15 phút, nước 5 phút, và với dung dịch điện ly nền (BGE) 15 phút.
• Giữa mỗi lần chạy, chương trình luyện cột (preconditioning) được thực hiện với nước trong 1 phút, dung dịch NaOH 0,1 M trong 2 phút, nước 2 phút, và BGE 2 phút.
- 24 -
• Thời điểm cuối ngày, mao quản được rửa với dung dịch NaOH 0,1 M trong 20 phút, nước 20 phút, sau đó thổi khí 3 phút.
a) Lựa chọn dung dịch điện ly nền
Tiến hành điện di dung dịch chuẩn atenolol racemic 100 ppm (kl/tt) sử dụng dung dịch điện ly nền lần lượt là dung dịch đệm phosphat 50 mM, pH 4,0, chứa CM-β-CD 8 mM và dung dịch đệm Tris 50 mM, pH 4,0, chứa CM-β-CD 8 mM.
Dựa vào tín hiệu trên điện di đồ thu được, lựa chọn dung dịch điện ly nền thích hợp.
b) Lựa chọn bước sóng phát hiện
Tiến hành quét phổ dung dịch chuẩn atenolol racemic 100 ppm (kl/tt) trong Tris 50 mM với bước sóng từ 190 đến 225 nm. Dựa vào phổ hấp thụ tìm bước sóng tại đó độ hấp thụ của atenolol là cực đại.
c) Lựa chọn cột mao quản
Chúng tôi tiến hành điện di dung dịch chuẩn atenolol racemic 100 ppm (kl/tt) với điều kiện điện di trên, sử dụng các cột mao quản khác nhau.
d) Lựa chọn hiệu điện thế áp vào hai đầu mao quản
Sau khi lựa chọn được cột mao quản chúng tôi tiến hành khảo sát lại hiệu
điện thế áp vào hai đầu mao quản. Thay đổi hiệu điện thế áp vào hai đầu mao quản từ 15 đến 30 kV (XE= 5 kV) và tiến hành phân tích mẫu, lựa chọn hiệu điện thế phù hợp.
e) Lựa chọn nồng độ tác nhân chọn lọc đối quang
Tiến hành điện di dung dịch chuẩn atenolol racemic 100 ppm với điều kiện
điện di đã lựa chọn ở trên và thay đổi nồng độ tác nhân chọn lọc đối quang CM-β- CD từ 6 mM đến 10 mM. Dựa vào tín hiệu trên điện di đồ thu được, lựa chọn nồng
độ CM-β-CD thích hợp.
2.3.3 Thẩm định phương pháp phân tích
Sau khi khảo sát, lựa chọn được điều kiện điện di tiến hành thẩm định để đảm bảo phương pháp xây dựng được là phù hợp. Các tiêu chí cần thẩm định bao gồm: độ phù hợp của hệ thống, độ đặc hiệu, khoảng nồng độ tuyến tính, độ lặp lại và độđúng của phương pháp.
- 25 -
Độ phù hợp hệ thống
Đánh giá độ phù hợp hệ thống là phép thử nhằm đánh giá độ ổn định của toàn hệ thống phân tích bao gồm bởi các yếu tố như: máy móc, thiết bị, cách tiến hành phân tích, mẫu thử…
Các thông sốđược sử dụng đểđánh giá độ phù hợp của hệ thống bao gồm độ
phân giải Rs giữa các pic của đồng phân S và R-atenolol và độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của các đáp ứng phân tích khi tiêm mẫu lặp lại. Yêu cầu các giá trị thời gian di chuyển, diện tích pic của mỗi đồng phân có RSD ≤ 2 %, Rs > 2.
Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần cùng một dung dịch chuẩn atenolol racemic 100 ppm trong cùng điều kiện điện di.
Độđặc hiệu
Chuẩn bị mẫu placebo, mẫu thử và mẫu chuẩn atenolol racemic 100 ppm, mẫu S- atenolol 50 ppm và tiến hành điện di với các điều kiện đã chọn được ở trên. Yêu cầu trên điện di đồ pic của các đồng phân phải tách hoàn toàn so với pic của chất tạp. Trên điện di đồ của mẫu placebo, tại thời điểm ứng với pic của R-/S- atenolol không được có pic xuất hiện. Thời gian di chuyển và hình dáng pic trên
điện di đồ của mẫu thử và mẫu chuẩn phải như nhau.
Khoảng nồng độ tuyến tính
Để đảm bảo phép định lượng cho kết quả chính xác, cần xác định khoảng nồng độ mà ởđó có sự tương quan tuyến tính giữa đáp ứng phân tích (diện tích pic) với nồng độ chất phân tích.
Triển khai điện di dãy dung dịch chuẩn atenolol racemic có nồng độ từ 40 ppm đến 140 ppm. Mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ chất phân tích
được biểu diễn bằng phương trình hồi quy tuyến tính và hệ số tương quan hồi quy.
Đường hồi quy có dạng gần nhưđường thẳng và hệ số tương quan hồi quy xấp xỉ 1.
Độ chính xác
Độ chính xác của một phương pháp phân tích là mức độ thống nhất giữa các kết quả riêng biệt khi quy trình phân tích được tiến hành lặp đi lặp lại nhiều lần trên cùng một mẫu đồng nhất. Độ chính xác được biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối (RSD). Nghiên cứu cần tiến hành đánh giá độ lặp lại và độ chính xác trung gian.
- 26 -
− Độ lặp lại: Cùng điều kiện thí nghiệm trong khoảng thời gian ngắn (như
trong cùng một ngày)
− Độ chính xác trung gian: Cùng phòng thí nghiệm, thực hiện ở các ngày khác nhau và/ hoặc người phân tích khác nhau và/hoặc trên thiết bị khác nhau. Tiến hành điện di xác định nồng độ atenolol trong 6 mẫu thửđộc lập có nồng
độ khoảng 100 ppm. Đánh giá độ lặp lại của kết quả thu được thông qua độ lệch chuẩn tương đối RSD, yêu cầu RSD ≤ 2%.
Độđúng
Độđúng của phương pháp là mức độ gần sát của kết quả phân tích với giá trị
thực của mẫu đã biết.
Tiến hành: Thêm chuẩn vào các mẫu placebo ở các mức nồng độ 80%, 100%, 120% nồng độ định lượng. Tiến hành điện di dung dịch thêm chuẩn, dựa vào diện tích pic của các dung dịch này và đường chuẩn ta tính % tìm lại lượng chất chuẩn thêm vào. Độđúng của phương pháp tại mỗi nồng độ phải nằm trong khoảng từ 98 % đến 102 % [17].
2.3.4 Ứng dụng
* Định lượng các đồng phân đối quang của atenolol trong một số chế phẩm có chứa atenolol trên thị trường.
Tiến hành điện di các mẫu chuẩn atenolol racemic và mẫu thử. Dựa vào diện tích pic của mẫu thử và mẫu chuẩn, hàm lượng atenolol racemic của mẫu chuẩn để
xác định hàm lượng từng đồng phân atenolol trong mẫu thử.
Hàm lượng atenolol, C14H22N2O3, phải đạt được từ 90,0 đến 110,0% so với lượng ghi trên nhãn [1].
* Đánh giá độ hòa tan các đồng phân quang học của atenolol trong chế phẩm viên nén.
Tiến hành thử độ hòa tan các chế phẩm viên nén Tenormin 50 mg và Atenolol STADA 50 mg ở môi trường dung dịch HCl 0,1 N, sau đó định lượng các
đồng phân đối quang được hòa tan trong từng cốc thử bằng phương pháp đã xây dựng, từđó rút ra nhận xét sự giải phóng và hòa tan các đồng phân đối quang của atenolol trong các chế phẩm viên nén [1].
- 27 - 2.3.5 Phương pháp xử lý số liệu
Tính toán và xử lý thống kê số liệu trên phần mềm Microsoft Excel 2007. Một số công thức tính toán các giá trị thống kê như sau:
* Giá trị trung bình ∑ = = n i i x n x 1 1 * Độ lệch chuẩn SD − ∑ = n i i x 1 ( x (với n là số phép thử; x là giá trị thực nghiệm thứ i) * Độ lệch chuẩn tương đối: RSD (%) = 100% * Công thức tính kết quả:
Hàm lượng atenolol trong viên (mg/viên):
HL S m CS m1 %Rh m 1000 mg/viên
Tỉ lệ thu hồi (%):
% Th CC'(
)' 100%
Trong đó:
Sth: diện tích pic của atenolol trong mẫu thử (mAU.s). Sc: diện tích pic của atenolol trong mẫu chuẩn (mAU.s). mc: khối lượng mẫu chuẩn (g).
mth: khối lượng mẫu thử (g).
Cc: hàm lượng atenolol racemic khan trong chất chuẩn (100,17%). %Rh: hàm ẩm của chất chuẩn (0,11%).
m : khối lượng trung bình viên (g). CTH: Nồng độ thu hồi (ppm).
- 28 -
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. KHẢO SÁT VÀ LỰA CHỌN ĐIỀU KIỆN ĐIỆN DI 3.1.1 Lựa chọn dung dịch điện ly nền.
Nhằm giảm dâng cao đường nền, chúng tôi tiến hành điện di sử dụng dung dịch điện ly nền là dung dịch đệm phosphat 50 mM, pH 4,0 so với dung dịch đệm Tris 50 mM, pH 4,0 đã được lựa chọn ở nghiên cứu trước [10].
Tiến hành điện di theo điều kiện: cột mao quản chiều dài tổng cộng 48,5 cm, chiều dài hiệu dụng 40,0 cm, đường kính trong 50 µm; nhiệt độ mao quản 200 C, tiêm mẫu 50 mbar x3s, điện thế 25 kV, dung dịch chuẩn atenolol racemic 100 ppm (kl/tt) sử dụng dung dịch điện di lần lượt là dung dịch đệm phosphat 50 mM, pH 4,0, chứa CM-β-CD 8 mM và dung dịch đệm Tris 50 mM, pH 4,0, chứa CM-β-CD 8 mM.
Kết quảđiện di đồ thu được như sau.
a)
b)
Hình 3.1 Điện di đồ khi sử dụng các dung dịch điện ly nền khác nhau. a) Đệm phosphat 50 mM b) Đệm Tris 50 mM min 1 2 3 4 5 6 7 8 mAU 0 10 20 30 40 50 60
DAD1 D, Sig=194,2 Ref=off (ATENOLOL\130518000356.D)
Are a: 2 17.7 16 6 .5 9 3 Are a: 2 21.2 54 7 .0 5 7 min 1 2 3 4 5 6 7 8 9 mAU 0 10 20 30 40 50 60 70
DAD1 D, Sig=194,2 Ref=off (ATENOLOL\130518000363.D)
Are a: 2 61.8 81 7 .6 0 5 8 .1 2 9
- 29 - Nhận xét:
Từ kết quả ở hình 3.1, nhận thấy khi dùng dung dịch đệm phosphat 50 mM thì đường nền nhiễu, pic bị chẻ ngọn. Trong khi sử dụng dung dịch đệm Tris thì
đường nền ổn định và các pic gọn, tách nhau hoàn toàn. Do đó chúng tôi lựa chọn dung dịch đệm Tris 50 mM là dung dịch điện ly nền cho nghiên cứu tiếp theo.
3.1.2 Lựa chọn bước sóng phát hiện
Tiến hành quét phổ dung dịch chuẩn atenolol racemic 100 ppm (kl/tt) trong Tris 50 mM với bước sóng từ 190 đến 225 nm. Dựa vào phổ hấp thụ tìm bước sóng tại đó độ hấp thụ của atenolol là cực đại.
Kết quả:
Tại bước sóng 194 nm, độ hấp thụ của atenolol trong dung dịch Tris 50 mM là cực đại. Do đó, lựa chọn bước sóng phát hiện cho nghiên cứu định lượng atenolol tiếp theo là 194 nm.
3.1.3 Lựa chọn cột mao quản
Theo tác giả Đinh Thị Thanh và cộng sự [10], khi sử dụng cột mao quản có chiều dài tổng cộng 60,0 cm, chiều dài hiệu dụng 50,0 cm, đường kính trong 75 µm thì thời gian phân tích mẫu khá dài (thời gian luyện cột- rửa cột giữa 2 lần phân tích liên tiếp là 16 phút, thời gian phân tích mẫu khoảng 30 phút). Do đó, chúng tôi khảo sát lựa chọn một số cột mao quản khác nhằm giảm thời gian phân tích mẫu và nhiễu
đường nền so với nghiên cứu trước.
Tiến hành điện di dung dịch atenolol racemic chuẩn 100 ppm (kl/tt) với điều kiện điện di: nhiệt độ mao quản 200 C, tiêm mẫu 50 mbar x3s, điện thế 25 kV, dung dịch điện di Tris 50 mM, pH 4,0, chứa CM-β-CD 8 mM, sử dụng các cột mao quản silica nung chảy, có vỏ bao polyimid với các thông số cột như sau:
Mao quản Chiều dài tổng cộng (cm) Chiều dài hiệu dụng (cm) Đường kính trong (µm) 1 64,5 56,0 50 2 48,5 40,0 50
So sánh tín hiệu thu được để lựa chọn cột phù hợp cho nghiên cứu tiếp theo. Dữ liệu điện di đồ thu được như sau.
- 30 -
a)
b)
Hình 3.2 Điện di đồ của dung dịch atenolol racemic 100 ppm khi sử dụng với các mao quản khác nhau.
a) Mao quản 1; b) Mao quản 2 Nhận xét:
Từ kết quả ở hình 3.3, nhận thấy khi dùng mao quản 1 có chiều dài hiệu dụng 56,0 cm thì đường nền nhiễu và thời gian di chuyển của các đồng phân của atenolol khá dài (trên 35 phút), trong khi sử dụng mao quản 2 có chiều dài hiệu dụng 40,0 cm thì điện di đồ thu được có đường nền ổn định và thời gian di chuyển của các đồng phân được rút ngắn lại (hơn 9 phút) và độ phân giải vẫn đạt yêu cầu. Như vậy, chúng tôi lựa chọn cột mao quản số 2 có chiều dài tổng cộng 48,5 cm, chiều dài hiệu dụng 40,0 cm, đường kính trong 50 µm cho nghiên cứu tiếp theo.
3.1.4 Lựa chọn hiệu điện thế áp vào hai đầu mao quản
Thay đổi hiệu điện thế áp vào hai đầu mao quản từ 15 đến 30 kV (XE= 5 kV) và tiến hành điện di dung dịch chuẩn atenolol racemic 100 ppm (kl/tt) với các điều kiện điện di: cột mao quản chiều dài tổng cộng 48,5 cm, chiều dài hiệu dụng 40,0