Xây dựng quy trình xác định đa hình gen CYP2C19

Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm xây dựng thành công quy trình phát hiện đa hình gen CYP2C19. Đối tượng và phương pháp: 10 mẫu máu tĩnh mạch của bệnh nhân (BN) sau đặt stent động mạch vành qua da tại Khoa Tim mạch, Bệnh viện Quân y 103.

Tạp chí y - dợc học quân số 8-2017 XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH ĐA HÌNH GEN CYP2C19 Triệu Tiến Sang*; Đào Văn Đôn*; Trần Văn Khoa* Trương Ngọc Nam*; Lê Thị Hải Yến*; Nguyễn Hồng Hiệp** TĨM TẮT Mục tiêu: xây dựng thành cơng quy trình phát đa hình gen CYP2C19 Đối tượng phương pháp: 10 mẫu máu tĩnh mạch bệnh nhân (BN) sau đặt stent động mạch vành qua da Khoa Tim mạch, Bệnh viện Quân y 103 Sử dụng phương pháp giải trình tự gen dựa nguyên lý Sanger Kết quả: phát đa hình gen CYP2C19 Kết luận: xây dựng thành cơng quy trình xác định đa hình gen CYP2C19 * Từ khóa: Gen CY2C19; Đặt stent động mạch vành; Giải trình tự gen Construction of Protocol for Screening CYP2C19 Polymophism Gene Summary Objectives: To construct successfully protocol screening CYP2C19 polymorphism gene Subjects and methods: 10 patients with venous blood transfusions were placed at Department of Cardiology, 103 Hospital using a sequencing method based on Sanger's principle Results: CYP2C19 polymorphism was detected Conclusion: CYP2C19 gene polymorphism has been successfully established * Keywords: Gene CYP2C19; Coronary stent; Sequencing ĐẶT VẤN ĐỀ Cytochrome - P450 - 2C19 (CYP2C19) enzym thuộc siêu họ cytochrom P450, tham gia vào q trình chuyển hóa chất ngoại lai, bao gồm thuốc kháng tiểu cầu clopidogrel, thuốc chống động kinh, mephenytoin, omeprazol, diazepam số loại thuốc an thần Khả chuyển hóa CYP2C19 phân loại sau: chuyển hóa siêu nhanh, chuyển hóa bình thường, chuyển hóa trung gian, chuyển hóa Điều dẫn đến có khác phản ứng chuyển hóa thuốc đáp ứng cá thể Clopidogrel tiền thuốc chưa có tác dụng, sau q trình chuyển hóa CYP2C19 gan, clopidogrel chuyển hóa thành chất có tác dụng chống kết tập tiểu cầu, ngăn ngừa cục máu đơng giảm hình thành huyết khối Việc xác định kiểu gen CYP2C19 có vai trò quan trọng tiên lượng đáp ứng thuốc, đặc biệt thuốc chịu chuyển hóa qua enzym clopidogrel * Học viện Quân y ** Bệnh viện Quân y 103 Người phản hồi (Corresponding): Triệu Tiến Sang (trieusangk83@yahoo.com.vn) Ngày nhận bài: 02/06/2017; Ngày phản biện đánh giá báo: 11/09/2017 Ngày báo đăng: 26/09/2017 45 T¹p chí y - dợc học quân số 8-2017 Mt số hướng dẫn điều trị can thiệp tim mạch đề cập đến việc cần làm xét nghiệm gen CYP2C19 trước định dùng clopidogrel Để làm điều đó, phòng thí nghiệm cần tối ưu hóa quy trình, ổn định điều kiện thí nghiệm trước áp dụng quy trình cách thường quy Với mong muốn đưa quy trình xác định kiểu gen CYP2C19, góp phần nâng cao hiệu điều trị, giảm biến chứng nâng cao chất lượng sống người bệnh, thực nghiên cứu nhằm: Xây dựng quy trình xác định đa hình gen CYP2C19 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu 10 mẫu máu tĩnh mạch BN sau đặt stent động mạch vành qua da Khoa Tim mạch, Bệnh viện Qn y 103 Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm Bộ môn Sinh học Di truyền Y học, Học viện Quân y Phương pháp nghiên cứu Áp dụng phương pháp giải trình tự dựa nguyên lý Sanger, tiến hành theo bước: - Xử lý mẫu - Tách chiết ADN tổng số - Kiểm tra chất lượng ADN tổng số - Khuếch đại đoạn gen chứa SNP: CYP2C19*2, CYP2C19*3 - Kiểm tra chất lượng sản phẩm PCR - Tinh sạch, giải trình tự - Phân tích, đánh giá kết * Xử lý mẫu: Cách lấy mẫu: lấy ml máu từ tĩnh mạch BN vào ống lấy mẫu EDTA sau đặt 46 sten động mạch vành qua da, đảm bảo không nhiễm khuẩn, ký hiệu mẫu bảo quản điều kiện -4OC * Tách chiết ADN tổng số: Nguyên lý: sử dụng E.Z.N.A blood ADN mini kit để tách ADN tổng số Nguyên lý kít dựa hấp thụ chọn lọc axít nucleic vào màng silica-gel điều kiện định với giai đoạn chính: phá vỡ tế bào để giải phóng ADN; ADN liên kết với màng silicagel; loại bỏ tạp chất màng silica-gel với Wash Buffer; thu ADN * Kiểm tra chất lượng ADN tổng số: Nguyên lý: phương pháp điện di dựa nguyên tắc hoạt động nhờ vào sức kéo điện trường tác động vào phân tử tích điện kích thước lỗ thể Sử dụng dung dịch đệm để dẫn điện tạo điện trường đề Bản gel giúp phân tách phân tử thuốc nhuộm khác để phát vị trí phân tử gel sau điện di Tốc độ di chuyển ADN điện trường phụ thuộc vào kích thước đoạn ADN, điện tích, mức độ xoắn dạng phân tử Như vậy, so sánh kích thước mẫu ADN với thang chuẩn đánh giá chất lượng ADN * Khuếch đại đoạn gen chứa SNP quan tâm: Nguyên lý: sử dụng kỹ thuật PCR để khuếch đại ADN Dùng enzym polymerase để tổng hợp ADN từ ADN khuôn ban đầu Thành phần phản ứng gồm: ADN khuôn, mồi, dung dịch đệm, loại deoxyrinucleotid triphosphate (dNTP), ADN polymerase Với giai đoạn chính: giai đoạn biến tính, giai đoạn gắn mồi giai đoạn kéo dài Tạp chí y - dợc học quân số 8-2017 * Kiểm tra chất lượng sản phẩm PCR: Sử dụng phương pháp điện di, nguyên lý cách tiến hành tương tự điện di kiểm tra chất lượng ADN sau tách chiết Điện di giá thể agarose pha đệm TAE 1X * Tinh giải trình tự ADN: Nguyên lý: phương pháp giải trình tự Sanger dựa vào hoạt động enzym ADN polymerase dideoxynucleotid (ddNTP) tham gia vào trình tổng hợp ADN Khi ADN polymerase xúc tác kéo dài mạch ADN gặp nucleotid khơng có nhóm 3’OH (dideoxynucleotid), phản ứng tổng hợp dừng lại tạo đoạn ADN chênh lệch nucleotid Điện di đoạn ADN giúp xác định trình tự ADN [3] * Phân tích kết quả: dựa phần mềm BioEdit KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Kết tách chiết ADN Bảng 1: Mẫu Nồng độ ADN (ng/µl) A260/A280 19,42 1,7 25,62 1,8 19,49 1,85 19,33 2,72 27,9 1,79 26,24 1,9 19,6 2,03 22,51 2,13 24,1 2,04 10 30,98 2,1 Nồng độ ADN trung bình 26.874 ng/µl Tỷ lệ A260/A280 trung bình 1.923 (trong khoảng 1,8 - 2), nhìn chung dịch chiết ADN đủ nồng độ cho nghiên cứu Kết điện di sản phẩm PCR Chúng thiết kế cặp mồi dùng để xác định đa hình gen CYP2C19*2 CYP2C19*3, tối ưu thời gian nhiệt độ phản ứng cặp mồi CYP*2-F: 5’-AATTACAACCAGAGCTTGGC-3’ CYP*2-R: 5’-TATCACTTTCCATAAAAGCAAG-3’ CYP*3-F: 5’- AAATTGTTTCCAACATTTAGCT-3’ CYP*3-R: 5’-ACTTCAGGGCTTGGTCAATA-3’ Chu trình nhiệt phản ứng: 96oC - phút, 25 chu kỳ [96oC - 10 giây, 50oC - giây, 60 C - phút], 4oC o 47 Tạp chí y - dợc học quân số 8-2017 Thành phần phản ứng: master mix (promega): 12,5 µl; primer F: 0,5 µl; primer R: 0,5 µl; nước deion: 6,5 µl; ADN µl Hình 1: Kết điện di sản phẩm PCR (a) Gen CYP2C19*2 Gen CYP2C19*3 (F-/F+: đối chứng âm/dương; M: Marker; 01 - 06: thứ tự mẫu) Các mẫu có chất lượng tốt cho băng điện di sáng, rõ, có băng tương ứng với băng 140 bp (*2), 240 bp (*3) Đối chứng âm không xuất băng ADN nào, chứng tỏ kết PCR đáng tin cậy Kết giải trình tự gen CYP2C19 * Kết giải trình tự gen CYP2C19*2: Hình 2: Kết giải trình tự gen CYP2C19*2 mẫu số Khơng xuất tín hiệu A, có tín hiệu G, gen đồng hợp với kiểu gen *1/*1 quy định chuyển hóa bình thường Hình 3: Kết giải trình tự gen CYP2C19*2 mẫu số Đồng thời xuất tín hiệu A G, gen dị hợp với kiểu gen *1/*2 quy định chuyển hóa trung bình 48 T¹p chÝ y - dợc học quân số 8-2017 Hỡnh 4: Kt qu giải trình tự gen CYP2C19*2 mẫu số Khơng xuất tín hiệu G, có tín hiệu A, gen đồng hợp với kiểu gen *2/*2 quy định chuyển hóa * Kết giải trình tự gen CYP2C19*3: Hình 5: Kết giải trình tự gen CYP2C19*3 mẫu số Khơng xuất tín hiệu A, có tín hiệu G, gen đồng hợp với kiểu gen *1/*1 quy định chuyển hóa bình thường Hình 6: Kết giải trình tự gen CYP2C19*3 mẫu số Đồng thời xuất tín hiệu A G, gen dị hợp với kiểu gen *1/*3 quy định chuyển hóa trung bỡnh 49 Tạp chí y - dợc học quân sù sè 8-2017 Kết bước đầu phân tích đa hình gen CYP2C19*2, *3 Bảng 4: Kết phân tích đa hình kiểu gen CYP2C19*3 Kiểu hình Chuyển hóa bình thường Chuyển hóa trung bình Kiểu gen Tổng Tỷ lệ *1/*1 4/10 4/10 2/10 *1/*2 *1/*3 *2/*2 Chuyển hóa *2/*3 *3/*3 Dựa vào kết phân tích đa hình gen CYP2C19*2,*3, bước đầu rút ra: tỷ lệ BN mang kiểu gen chuyển hóa bình thường với BN mang kiểu gen chuyển hóa trung bình (tỷ lệ BN có kiểu gen chuyển hóa bình thường *1/*1 4/10, tỷ lệ BN có kiểu gen chuyển hóa trung bình *1/*2 *1/*3 4/10) Trong đó, tỷ lệ kiểu gen *1/*1 *1/*2, *1/*3 xấp xỉ 1:1 KẾT LUẬN Đã xây dựng thành công quy trình xét nghiệm gen CYP2C19*2, *3 10 mẫu máu tĩnh mạch BN đặt stent mạch vành qua da KIẾN NGHỊ Do thời gian thực đề tài tương đối ngắn, đề tài phân tích kiểu gen 50 cỡ mẫu khiêm tốn nên chưa đưa tần số phân bố kiểu gen CYP2C19 quần thể BN đặt stent mạch vành Chúng kiến nghị tiếp tục mở rộng cỡ mẫu nghiên cứu để cung cấp tần số kiểu gen CYP2C19 mang tính đại diện cho quần thể BN đặt stent mạch vành TÀI LIỆU THAM KHẢO Collet J.P, Hulot J.S, Pena A et al Cytochrome P450 2C19 polymorphism in young patients treated with clopidogrel after myocardial infarction: a cohort study Lancet 2009, 373 (9660), pp.309-317 Lee S.S, Lee S.J et al Comparisons of CYP2C19 genetic polymorphisms between Korean and Vietnamese populations Therapeutic Drug Monitoring 2007, 29 (4), pp.455-459 Sanger F, Coulson A.R A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase J Mol Biol 1975, 94 (4), pp.441-448 Yu Chen, Xiaohong Huang et al Both PON1 QQ192R and CYP2C19*2 influence platelet reponse to clopidogrel and ischemic events in Chinese patients undergoing percuteaneous coronary intervention Int J Clin Exp Med 2015, (6), pp.9266-9274 Simon T, Verstuyft C, Mary-Krause M et al Genetic determinants of response to clopidogrel and cardiovascular events N Engl J Med 2009, 360 (4), pp.363-375  ... quy trình xác định kiểu gen CYP2C19, góp phần nâng cao hiệu điều trị, giảm biến chứng nâng cao chất lượng sống người bệnh, thực nghiên cứu nhằm: Xây dựng quy trình xác định đa hình gen CYP2C19. .. Kết giải trình tự gen CYP2C19 * Kết giải trình tự gen CYP2C19* 2: Hình 2: Kết giải trình tự gen CYP2C19* 2 mẫu số Không xuất tín hiệu A, có tín hiệu G, gen đồng hợp với kiểu gen *1/*1 quy định chuyển... giải trình tự gen CYP2C19* 2 mẫu số Khơng xuất tín hiệu G, có tín hiệu A, gen đồng hợp với kiểu gen *2/*2 quy định chuyển hóa * Kết giải trình tự gen CYP2C19* 3: Hình 5: Kết giải trình tự gen CYP2C19* 3