Xây dựng quy trình xác định diethylstilbestrol, testosterone, 17β-estradiol trong thịt bằng LC-MS/MS

Bài viết trình bày việc xây dựng quy trình xác định hàm lượng Diethylstilbestrol (DES), Testosterone (TES) và 17β-Estradiol (ES) trong thịt bằng LC-MS/MS.

Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 Nghiên cứu Y học XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH DIETHYLSTILBESTROL, TESTOSTERONE, 17β-ESTRADIOL TRONG THỊT BẰNG LC-MS/MS Trần Đại Nghĩa*, Trần Ngọc Minh Tuấn* TĨM TẮT Đặt vấn đề: Trong lĩnh vực chăn ni nay, hormone tăng trưởng sử dụng cách tùy tiện Việc sử dụng thịt có tồn dư loại hóa chất gây ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng Có nhiều phương pháp sử dụng để phân tích dư lượng hormone phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ hai lần (LC-MS/MS) có nhiều ưu điểm như: ứng dụng nhiều mẫu khác nhau, tốn thời gian, khơng cần tạo dẫn xuất, có độ chọn lọc độ nhạy cao Mục tiêu: Xây dựng quy trình xác định hàm lượng Diethylstilbestrol (DES), Testosterone (TES) 17βEstradiol (ES) thịt LC-MS/MS Phương pháp nghiên cứu: Các hormone tăng trưởng thịt chiết Acetonitrile, làm dịch chiết kỹ thuật QuEChERS Các hormone phân tách máy sắc ký lỏng (HPLC) cột C18 với pha động acetonitrile acid formic 0,1% nước chế độ gradient định lượng đầu dò khối phổ hai lần (MS/MS) với kỹ thuật ion hóa hóa học áp suất khí (APCI), chế độ ion dương Nội chuẩn đồng vị Testosterone_d3 17β – estradiol_d3 sử dụng để kiểm sốt q trình Phương pháp ứng dụng để khảo sát 15 mẫu thịt bò 15 mẫu thịt heo bán siêu thị Tp Hồ Chí Minh từ tháng 07 – 10/2015 Kết quả: Phương pháp xây dựng có giới hạn phát (MLOD) giới hạn định lượng (MLOQ) 0,1 – 0,3 ng/g (TES, ES) – ng/g (DES) Độ lặp lại phương pháp nồng độ 0,5 – – ng/g (TES, ES), – 10 – 20 ng/g (DES) với RSD < 15% hiệu suất thu hồi nồng độ tương ứng dao dộng khoảng 82 – 109% Kết phân tích mẫu thực thị trường khơng có mẫu thịt có chứa hormone tăng trưởng Kết luận: Đã xây dựng quy trình xác định DES, TES, ES thịt LC-MS/MS có độ chọn lọc, độ nhạy cao, độ lặp lại hiệu suất thu hồi tốt Từ khóa: Diethylstilbestrol (DES), Testosterone (TES), 17β – Estradiol (ES), thịt, LC-MS/MS ABSTRACT METHOD DEVELOPMENT FOR DETERMINATION OF DIETHYLSTILBESTROL, TESTOSTERONE, 17β – ESTRADIOL IN MEAT BY LC-MS/MS Tran Dai Nghia, Tran Ngoc Minh Tuan * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Supplement of Vol 20 - No - 2016: 387 - 393 Background: The residue of growth hormones in animal production can damage human health Among the methods used for growth hormones determination, the LC-MS/MS method offers several advantages such as better selectivity, higher sensitivity, no derivatization, less time-consuming, and applicability over various food matrices Objectives: To develop a process to determine Diethylstilbestrol (DES), Testosterone (TES) and 17βEstradiol (ES) in meat by LC-MS/MS Methods: The meat samples were extracted by acetonitrile, cleaned up using QuEChERS, and enriched * Viện Y tế Công cộng TP Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: ThS.Trần Đại Nghĩa ĐT: 0919 446 305 Chuyên Đề Y Tế Công Cộng Email: laboass@iph.org.vn 387 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 with Nitrogen gas The hormones separation was performed by C18 column using mobile phases: Acetonitrile (A) and Formic acid 0.1% in water (B) with gradient program The quantitation was achieved by atmospheric pressure chemical ionization tandem mass spectrometry (APCI – MS/MS) in positive mode Testosterone_d3 and 17β – estradiol_d3 were used as internal standard to control the process The method was employed to study 15 pork samples and 15 beef samples that were collected from supermarkets in Ho Chi Minh City from July to October 2015 Results: The limits of quantitation (MLOQ) were 0.3 ng/g for TES, ES and ng/g for DES The limits of determination (MLOD) were 0.1 ng/g for TES, ES and ng/g for DES The precisions of method were respected with RSD < 15% at levels of concentration: 0.5 – – ng/g (TES, ES), – 10 – 20 ng/g (DES) The recoveries at the corresponding concentrations were in the range of 82 – 109% The results of 30 samples were negative Conclusion: A simple, fast, accurate, precise and sensitive method has been established to determine DES, TES, ES in meat by LC-MS/MS Keywords: Diethylstilbestrol (DES), Testosterone (TES), 17β – Estradiol (ES), pork, beef, LC-MS/MS ĐẶT VẤN ĐỀ Hormone chất hóa học nhóm tế bào tuyến nội tiết, tiêm từ vào máu máu đưa đến tế bào mô khác thể gây tác dụng sinh lý đó(18) Hormone thường sử dụng chăn nuôi với mục đích kích thích tăng trưởng, sinh sản tích lũy nhiều nạc, mỡ nhằm đem lại lợi nhuận cao cho nhà sản xuất(11,18) Do đó, người tiêu dùng ăn thịt sản phẩm chế biến từ thịt có tồn dư hormone dẫn đến nguy cân nội tiết tố, rối loạn chuyển hóa gây ung thư(9,11,18) Ở Mỹ, Cục quản lý Thực phẩm Dược phẩm - Food and Drug Administration (FDA) cấm sử dụng Diethylstilbestrol (DES) chăn nuôi (1973) tất sản phẩm từ chăn nuôi (1979)(2,17) Năm 2003, Hội đồng Châu Âu European Commission (EC) cấm nhập sử dụng thịt sản phẩm chế biến từ thịt có tồn dư hormone(17) Tuy nhiên, FDA Ủy Ban Phụ Gia Thực Phẩm - Joint Expert Committee on Food Additives (JECFA) cho phép sử dụng hormone: 17β-Estradiol (ES), Progesterone, Testosterone (TES), Zeranol, Trenbolone acetate, Melengestrol acetate sản phẩm chăn nuôi(17) Tại Việt Nam, mức tối đa hormone thịt tươi quy định theo TCVN 7046: 2009(21) (bảng 1) 388 Bảng 1: Dư lượng số hormone theo TCVN 7046: 2009 (21) Hormone 17β-Estradiol Testosterone Diethylstilbestrol Mức tối đa (mg/kg) 0,0005 0,015 0,0 Hiện nay, phân tích dư lượng hormone thực nhiều thiết bị khác như: xét nghiệm miễn dịch liên kết enzyme Enzyme Linked Immunosorbent Assay (5,6) (ELISA) , xét nghiệm miễn dịch đánh dấu phóng xạ - Radioimmunoassay (RIA)(3,4), sắc ký mỏng - Thin layer chromatography (TLC)(14), sắc ký khí ghép khối phổ - Gas chromatography – mass spectrometry (GC - MS)(7,12), sắc ký lỏng ghép khối phổ hai lần - Liquid chromatography – tandem mass spectrometry (LC MS/MS)(8,10,11,13,15,16,19,20) Trong đó, phương pháp LC - MS/MS có nhiều ưu điểm: áp dụng nhiều mẫu khác nhau, tốn thời gian, khơng cần tạo dẫn xuất, độ nhạy cao Về xử lý mẫu, số dung môi sử dụng để chiết hormone methanol, acetonitrile, ethyl acetate, acetone… Để làm dịch chiết, sử dụng số loại cột chiết pha rắn cột C18(12,19), cột Hydrophilic Lipophilic Balanced (HLB)(8,10) (13) QuEChERS Trong đó, phương pháp chiết hormone dùng QuEChERS có ưu điểm nhanh hiệu suất thu hồi cao(13) Chuyên Đề Y Tế Công Cộng Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 Trong nghiên cứu này, phương pháp sử dụng kỹ thuật QuEChERS kết hợp kiểm soát nội chuẩn đồng vị TES_d3 ES_d3(13) để tách chiết đồng thời DES, TES, ES mẫu thịt heo thịt bò định lượng hệ thống LC-MS/MS(16) chọn để xây dựng xác định giá trị sử dụng Sau đó, phương pháp ứng dụng để khảo sát mẫu thịt heo thịt bò siêu thị Tp Hồ Chí Minh Nghiên cứu Y học Chuẩn bị mẫu ĐỐITƯỢNG-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU 10 g mẫu thịt (heo, bò) đồng cân ống tube 50 mL 10 mL Acetonitrile 100 µL nội chuẩn (TES_d3 100 µg/L, ES_d3 100 µg/L) thêm vào Tube mẫu vortex phút Sau đó, Mix II QuEChERS thêm vào ống tube, vortex phút ly tâm 10 phút tốc độ 4500 vòng/phút Chuyển mL dịch sau ly tâm vào ống tube 15 mL khác chứa Mix VI QuEChERS Vortex ống tube phút ly tâm 10 phút tốc độ 4500 vòng/phút mL dịch sau ly tâm chuyển vào ống tube 15 mL khác thổi khơ khí nitơ tới 0,5 mL để làm giàu nồng độ Dịch sau thổi khô lọc qua filter 0,45 µm vào vial phân tích hệ thống LC – MS/MS Đối tượng nghiên cứu Điều kiện thiết bị Quy trình xác định DES, TES, ES máy sắc ký lỏng ghép khối phổ hai lần (LC-MS/MS) mẫu thịt heo thịt bò Hệ thống sắc ký lỏng ghép khối phổ LCMS/MS bao gồm khối phổ ba tứ cực AB Sciex 5500 ghép nối với hệ sắc ký lỏng Shimadzu UFLCXR bao gồm bơm Shimadzu 20ADXR, tiêm mẫu Shimadzu SIL-20ACXR, điều khiển Shimadzu CBM-20A Toàn hệ thống sắc ký khối phổ điều khiển phần mềm Analyst 1.5.1 hãng AB Sciex Các chất phân tích phân tách cột HiQ sil C18HS-3, 4,6 x 150 mm, kích thước hạt µm với phận bảo vệ cột Acetonitrile (pha động A) 0,1% acid formic nước (pha động B) dùng để rửa giải với chương trình gradient theo bảng Tốc độ dòng 0,7 mL/phút Thể tích tiêm mẫu 20 µL Mục tiêu nghiên cứu Xây dựng quy trình xác định hàm lượng Diethylstilbestrol (DES), Testosterone (TES) 17β-Estradiol (ES) thịt LC-MS/MS Ứng dụng khảo sát quy trình mẫu thịt heo thịt bò Tp Hồ Chí Minh Hóa chất – Chất chuẩn Chuẩn Diethylstilbestrol, Testosterone, 17β – Estradiol cung cấp Dr Ehrenstorfer GmbH (Augsburg, Germany), nội chuẩn Testosterone_d3 cung cấp Cambridge Isotope Laboratories Inc (CIL) courtesy of CK Gas Products (Hampshire, UK) 17β – estradiol_d3 cung cấp Toronto Research Chemicals Inc (TRC) (Toronto, Canada) Mix II (6 g Magnesium sulfate 1.5 g Sodium acetate) Mix VI (0.15 g Diamino, 0.9 g magnesium sulfate 0.15 g C18) Chromabond® QuEChERS cung cấp Macherey Nagel GmbH (Duren, Germany) Acetonitrile cung cấp J.T Baker (New Jersey, USA) acid formic cung cấp Merck (Darmstadt, Germany) Nước cất lọc máy cất nước Barnstead Easypure® Thermo Scientific (San Jose, USA) Mẫu thịt 15 mẫu thịt heo 15 mẫu thịt bò mua từ siêu thị Tp Hồ Chí Minh từ tháng 07 đến tháng 10 năm 2015 Chuyên Đề Y Tế Cơng Cộng Bảng 2: Chương trình gradient nồng độ Thời gian (phút) 0,01 5,00 10,00 10,1 15 Pha động A (%) 20 70 70 20 20 Pha động B (%) 80 30 30 80 80 Hệ thống khối phổ vận hành với kỹ thuật ion hóa hóa học áp suất khí – atmospheric pressure chemical ionization (APCI), chế độ ion dương Thế ion hóa – Ion spay voltage (IS) cài đặt 5500 V Điều 389 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 kiện khí Curtain Gas (CUR), Nebulizer gas (GS1), Collisionally activated dissociation (CAD) 20, 40, 10 psi Cường độ dòng điện kim - Needle current (NC) thiết lập mA Nhiệt độ nguồn ion hóa (TEM) 500oC Các chất phân tích nội chuẩn đồng vị định lượng chế độ Multiple reaction monitoring (MRM) với thơng số: phân nhóm - declustering potential (DP), đầu vào entrance potential (EP), lượng va chạm collision energy (CE), va chạm đầu collision cell exit potential (CXP) theo bảng Tính tốn xác định giá trị sử dụng phương pháp Nồng độ chất phân tích tính tốn theo phương pháp sử dụng nội chuẩn TES_d3 sử dụng để định lượng cho TES, ES_d3 sử dụng để định lượng cho ES, DES Việc tính toán thực phần mềm Analyst 1.5.1 hãng AB Sciex Phương pháp xác định giá trị sử dụng thông qua thông số: độ chọn lọc, khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, độ xác độ đúng(1) Độ chọn lọc phương pháp LC-MS/MS xác định dựa cặp ion đặc trưng chất khả phân tách cột sắc ký Độ tuyến tính đánh giá thông qua hệ số tương quan R2 > 0,995 phương trình hồi quy đường chuẩn thể mối tương quan tỷ lệ diện tích peak sắc ký chuẩn/nội chuẩn nồng độ chất phân tích/ nội chuẩn Giới hạn phát mẫu tiêm – Injection limit of detection (ILOD) tính tốn dựa vào việc xác định tỷ lệ tín hiệu/nhiễu – signal to noise (S/N) ≥ 10 mẫu trắng khơng có chất phân tích thêm chuẩn nồng độ Giới hạn định lượng mẫu tiêm – Injection limit of quantitation (ILOQ) tính tốn tương tự với tỷ lệ S/N ≥ 10 Kết đạt chia với độ làm giàu mẫu 10 để xác định giới hạn phát giới hạn định lượng phương pháp – method limit of detection and quantitation (MLOD & MLOQ) Độ xác độ 390 phương pháp đánh giá thông qua độ lặp lại với độ tái lặp nội (RSD%) hiệu suất thu hồi H (%) mẫu chất phân tích thêm chuẩn nồng độ: 0,5 ng/g, ng/g ng/g (TES, ES); ng/g, 10 ng/g 20 ng/g (DES) (10 mẫu nồng độ) Độ lặp lại thực ngày độ tái lặp nội thực tương tự với nhân viên khác Hệ số RSD (%) phải < 15% H (%) phải nằm khoảng 75 – 125% Bảng 3: Thông số MRM chất phân tích Chất phân tích ES 1* ES ES_d3 TES 1* TES TES_d3 DES 1* DES Q1 (m/z) 255,2 255,2 258,2 289,2 289,2 292,2 269,2 269,2 Q3 (m/z) 159,0 133,1 159,0 97,0 109,1 100,0 135,1 107,0 DP (V) 100 100 100 100 100 100 50 50 EP (V) 10 10 10 10 10 10 10 10 CE (eV) 20 20 20 30 37 27 20 20 CXP (V) 10 12 10 11 18 14 10 10 *: Cặp ion định lượng KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Các thông số phương pháp phân tích Độ chọn lọc Sắc ký đồ tổng mẫu trắng mẫu trắng thêm chuẩn mô tả theo hình sắc ký đồ ion mẫu thêm chuẩn mơ tả theo hình Thời gian lưu ES (255,2 159,0; 133,1), TES (289,2  97,0; 109,1), DES (269,2  135,1; 107,0) 9,29; 9,93 10,20 phút Nội chuẩn ES_d3 (258,2  159,0) TES_d3 (292,2  100,0) có thời gian lưu trùng với ES TES Tỷ lệ cặp ion định lượng cặp ion xác nhận ES, TES, DES 32,21; 29,34 49,92% Kết cho thấy phương pháp có độ chọn lọc tốt Khoảng tuyến tính Khoảng tuyến tính ES, TES – 50 ng/mL DES 10 – 500 ng/mL Các phương trình hồi quy đường chuẩn chất có hệ số tương quan R2 > 0,995 Kết chi tiết trình bày theo bảng Chuyên Đề Y Tế Cơng Cộng Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 Giới hạn phát giới hạn định lượng phương pháp Qua việc phân tích mẫu trắng thêm chuẩn nồng độ thấp xác định tỷ lệ S/N, ILOD ILOQ xác định 1,0; 1,0; 10,0 ng/g 3,0; 3,0; 30,0 ng/g Vì thế, MLOD Nghiên cứu Y học MLOQ ES, TES, DES xác định 0,1; 0,1; 1,0 ng/g 0,3; 0,3; 3,0 ng/g khảo sát lại để khẳng định giá trị giới hạn phát giới hạn định lương phương pháp Với kết thu được, phương pháp có đủ độ nhạy để đáp ứng yêu cầu TCVN 7046:2009 Bảng 4: Khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng phương pháp phân tích Chất phân tích Khoảng tuyến tính ES TES DES – 50 ng/mL – 50 ng/mL 10 – 500 ng/mL Phương trình hồi quy R y = 0,087 x + 0,0138 y = 0,119 x + 0,2340 y = 0,115 x + 0,1130 0,9998 0,9997 0,9996 MLOD (ng/g) Thịt heo Thịt bò 0,1 0,1 1,0 MLOQ (ng/g) Thịt heo Thịt bò 0,3 0,3 3,0 Mẫu trắng Mẫu thêm chuẩn Hình 1: Sắc ký đồ mẫu trắng mẫu thêm chuẩn Chuyên Đề Y Tế Công Cộng 391 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 Hình 2: Sắc ký đồ cặp ion mẫu thêm chuẩn Độ xác độ phương pháp phân tích Kết phân tích mẫu thịt heo thịt bò cho thấy phương pháp có độ xác độ tốt với độ lệch chuẩn tương đối RSD < 15% hiệu suất thu hồi nằm khoảng 82 – 109% Độ lặp lại RSD (%) hiệu suất thu hồi H (%) 10 mẫu phân tích thực nhân viên thứ từ 2,48 đến 12,82% 89,42 đến 107,95% Độ lặp lại RSD (%) hiệu suất thu hồi H (%) 10 mẫu phân tích thực nhân viên thứ hai từ 3,49 đến 9,16% 82,34 đến 108,95% Kiểm định t-test cho độ lặp lại (ttính = 1,98 < tlý thuyết = 2,10) hiệu suất thu hồi (ttính = -0,33 < tlý thuyết = 2,10) cho thấy khơng có khác biệt tay nghề hai nhân viên Kết chi tiết trình bày theo bảng 392 Bảng 5: Độ xác, độ phương pháp phân tích Nồng độ Nhân viên (ng/g) RSD1 H (%) (%) 0,5 7,65 89,42 Thịt 1,0 10,88 101,41 heo 2,0 8,68 100,35 0,5 6,31 93,72 Thịt bò 1,0 6,98 105,47 2,0 4,76 104,15 0,5 6,74 100,16 Thịt 1,0 3,64 104,52 heo 2,0 2,48 107,05 0,5 4,86 103,30 Thịt bò 1,0 3,63 102,28 2,0 6,01 107,95 5,0 6,71 100,20 Thịt 10,0 8,87 92,04 heo 20,0 5,38 98,00 5,0 6,57 103,84 Thịt bò 10,0 12,82 100,05 20,0 6,87 102,25 Chất Nền phân tích mẫu ES TES DES Nhân viên RSD2 H (%) (%) 3,49 82,34 8,05 90,13 4,06 93,50 4,25 99,18 8,89 98,36 4,83 108,70 4,82 99,00 4,25 103,48 4,17 105,95 4,58 104,44 4,42 102,93 4,80 106,40 5,87 108,20 9,16 108,95 3,77 99,45 7,46 106,98 9,14 106,48 7,23 101,05 Chuyên Đề Y Tế Cơng Cộng Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 Ứng dụng phương pháp phân tích Phương pháp ứng dụng để khảo sát 15 mẫu thịt heo 15 mẫu thịt bò siêu thị Tp Hồ Chí Minh từ tháng 07 đến tháng 10 năm 2015 với kết khơng có mẫu dương tính với chất hormone tăng trưởng 10 KẾT LUẬN Nghiên cứu xây dựng quy trình xác định đồng thời hàm lượng hormone diethylstilbestrol, testosterone, 17β – estradiol mẫu thịt heo thịt bò sử dụng kỹ thuật tách chiết QuEChERS định lượng thiết bị LC-MS/MS Phương pháp xây dựng đơn giản, nhanh, với độ nhạy độ đặc hiệu cao Phương pháp xác định giá trị sử dụng có giới hạn phát hiện, độ lặp lại hiệu suất thu hồi tốt Phương pháp ứng dụng để khảo sát mẫu thịt heo thịt bò Tp Hồ Chí Minh TÀI LIỆU THAM KHẢO 2002/657/EC (2002) Commission decision implementing council directive 96/23/EC concerning the performance of analytical methods and the interpretation of results Official journal of European Communities, p.8 - 362002/657/EC, 2002 Raun AP, Preston RL (2002) History of diethylstilbestrol use in cattle American Society of Animal Science, pp 1–7 Anna MA and Niels ES (1999) Exposure to exogenous estrogens in food: possible impact on human development and health European Journal of Endocrinology 140, pp 477–485 Arts CJM, Baak MJV, Berg HVD, Schilt R, Berende PLM, Hartog JMPD (1990) Concentrations of the endogenous steroid hormone oestradiol-17 beta, testosterone and progesterone in veal calves in connection with the control for illegal administration Arch Lebensm 41 (3): pp 58–62 Barbara W (2002) Hormone residues control in slaughtered animals in Poland in 2000 – 2001 Bull Vet Inst Pulawy 46, pp 331–335 Bülent N, Hilal Ç, Ali A, Hamparsun H (2005) The Presence of Some Anabolic Residues in Meat and Meat Products Sold in Istanbul, Turk J Vet AnimSci 29, pp 691–699 Daeseleire E, Vandeputte R, Van Peteghem C (1998) Validation of multi-residue methods for the detection of anabolic steroids by GC-MS in muscle tissues and urine samples from cattle, Analyst 123 (12): pp 2595–2598 Chuyên Đề Y Tế Công Cộng 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Nghiên cứu Y học Wiellogorska E, Elliott CT, Danaher, Chevallier O, Connolly L (2015) Validation of an ultra high performance liquid chromatography – tandem mass spectrometry method for detection and quantitation of 19 endocrine disruptors in milk Food Control 48, pp 48–55 Ellin D (2000) Human Safety of Hormone Implants Used to Promote Growth in Cattle Food Research Institude University of Wisconsin, USA, pp 1–24 George K, Georgios T (2013) Rapid multi – method for the determination of growth promoters in bovine milk by liquid chromatography – tandem mass spectrometry Journal of Chromatography B 930, pp 422–29 Jack JL, Wendy CA, Christine RC, Sherri BT, Mark RM (2013) Analysis of Stilbene residues in aquacultured finfish using LC/MS/MS J.Agric.Food Chem, 61, pp 2364–2370 Jin-qing J, Lei Z, Guang-ling L (2011) Analysis of 19nortestosterone residue in animal tissues by ion-trap gas chromatography-tandem mass spectrometry J Zhejiang Univ Sci.B 12 (6): pp 460–467 Masayo Y, Mia S, and Michael SY (2012) QuEChERS sample preparation for LC/MS/MS determination of steroid hormones in meat and milk Waters application note, pp - Medina MB, Schwartz DP (1992) Thin-layer chromatographic detection of zeranol and Estradiol - 17β in fortified plasma and tissue extracts with fast Corinth V Journal of Chromatography, 581 (1): pp 119–128 Meenakshi D, Nidhi D (2014) Development and validation of LC-MS/MS method for simultaneous quantitation of testosterone, trenbolone, salbutamol and taleranol in chicken muscle Indian Journal of Chemistry Vol 53B, pp 1211–1217 Paul Z and Christine M (2002) Identification of steroids in water by ion trap LC/MS/MS, Agilent Agilent Technologies application notes 5988 – 6926EN, pp 1–12 Reneé J (2015) The U.S.-EU Beef Hormone Dispute, Congressional research service report, pp 1–34 Sang HJ, Daejin K, Myung WL, Chang SK and Ha JS (2010) Risk Assessment of Growth Hormone and Antimicrobial Residues in Meat, Toxicol Res.,Vol 26 (4), No 4, pp 301–313 Siji J (2010) LC/MS/MS quantitation of β – Estradiol 17 – acetate using an Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS working in ESI negative in mode Agilent Technologies application notes 5990 – 5877EN, pp 1–8 Szabolcs S, Vien N, Laszlo P (2013) Separation of dansylated 17β – estradiol, 17α – estradiol, and estrone on a single HPLC column for simultaneous quantitation by LC-MS/MS Anal Bioanal Chem 405, pp 3399–3406 TCVN 7046: 2009 (2009) Thịt tươi – yêu cầu kỹ thuật (lần 2) Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia, Bộ khoa học công nghệ, tr 1–10 Ngày nhận báo: 15/6/2016 Ngày phản biện nhận xét báo: 21/7/2016 Ngày báo đăng: 05/10/2016 393 ... thời DES, TES, ES mẫu thịt heo thịt bò định lượng hệ thống LC-MS/MS( 16) chọn để xây dựng xác định giá trị sử dụng Sau đó, phương pháp ứng dụng để khảo sát mẫu thịt heo thịt bò siêu thị Tp Hồ... chương trình gradient theo bảng Tốc độ dòng 0,7 mL/phút Thể tích tiêm mẫu 20 µL Mục tiêu nghiên cứu Xây dựng quy trình xác định hàm lượng Diethylstilbestrol (DES), Testosterone (TES) 17β-Estradiol. .. Testosterone (TES) 17β-Estradiol (ES) thịt LC-MS/MS Ứng dụng khảo sát quy trình mẫu thịt heo thịt bò Tp Hồ Chí Minh Hóa chất – Chất chuẩn Chuẩn Diethylstilbestrol, Testosterone, 17β – Estradiol cung