Xây dựng quy trình xác định methyl thủy ngân trong cá bằng phương pháp LC – ICP –MS

Nghiên cứu và xây dựng một quy trình tin cậy trong việc xác định hàm lượng Methyl thủy ngân trong cá. Khảo sát và tối ưu hóa các điều kiện phân tích nhằm tiết kiệm chi phí, hóa chất nhưng vẫn đảm bảo kết quả phân tích có độ chính xác và tin cậy cao. Áp dụng quy trình vào phân tích mẫu thực tế sau khi xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp.

Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Nghiên cứu Y học XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH METHYL THỦY NGÂN TRONG CÁ BẰNG PHƯƠNG PHÁP LC – ICP –MS Tống Lê Bảo Trâm*, Cù Hồng Yến*, Nguyễn Hữu Phát* TĨM TẮT Đặt vấn đề: Là chất gây nhiễm tồn cầu, thủy ngân xâm nhập vào chuỗi thức ăn hai dạng hóa học vơ hữu cơ: thủy ngân kim loại, mercuricsulfide (quặng cinnabar), Mercuric Clorua Methyl thủy ngân Methyl thủy ngân dạng thủy ngân chủ yếu cá Ở hầu hết loài cá trưởng thành, 90% - 100% hàm lượng thủy ngân Methyl thủy ngân (USEPA 2001) Để hỗ trợ cho việc giám sát chất lượng thủy sản, cần phải có phương pháp phân tích nguyên dạng thủy ngân hữu với độ nhạy, độ ổn định, độ tin cậy cao hiệu Trong báo, tập trung vào số điểm quan trọng quy trình phân tích thủy ngân nguyên dạng phương pháp sắc ký lỏng kết hợp với quang phổ nguồn plasma cảm ứng cao tần kết nối khối phổ Mục tiêu: Nghiên cứu xây dựng quy trình tin cậy việc xác định hàm lượng Methyl thủy ngân cá Khảo sát tối ưu hóa điều kiện phân tích nhằm tiết kiệm chi phí, hóa chất đảm bảo kết phân tích có độ xác tin cậy cao Áp dụng quy trình vào phân tích mẫu thực tế sau xác nhận giá trị sử dụng phương pháp Áp dụng kỹ thuật pha loãng đồng vị vào phương pháp xác định Methyl thủy ngân cá, nhằm đánh giá hiệu phương pháp đưa hướng phát triển kỹ thuật pha loãng đồng vị Phương pháp nghiên cứu: Tham khảo tổng hợp tài liệu nước liên quan đến đề tài nghiên cứu nhằm định hướng cho việc nghiên cứu quy trình; khảo sát quy trình tối ưu hóa thiết bị sử dụng LC–ICP– MS phân tích hàm lượng Methyl thủy ngân; thẩm định độ tin cậy độ xác quy trình Kết quả: Phát triển phương pháp xác định Methyl thủy ngân cá sử dụng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép nối với quang phổ nguồn plasma cảm ứng cao tần kết nối khối phổ (LC-ICP-MS) Methyl thủy ngân ly trích dung dịch L-Cysteine.HCl.H2O 1% (w/v) 30 phút, 50 oC bể siêu âm Dung dịch sau ly trích ly tâm lọc qua màng lọc 0,45 µm Sự phân tách sắc ký dạng thủy ngân thực cột pha đảo C18 với pha động gồm L-Cysteine 0,1% (w/v), L-Cysteine.HCl.H2O 0,1% (w/v) Methanol 5% (v/v) Kết việc thẩm định phương pháp bao gồm: khoảng tuyến tính Methyl thủy ngân từ 0,2 đến 10 µg/kg, giới hạn phát định lượng phương pháp µg/kg, 15 µg/kg Hiệu suất thu hồi phương pháp đạt từ 100,54 % đến 101,68 % Sử dụng mẫu chuẩn chứng nhận ERM-CE-464 để xác định độ phương pháp với độ chệch 1,4 % Độ không đảm bảo đo phương pháp 15 % Kỹ thuật pha loãng đồng vị (cụ thể sử dụng 201Hg-CH3+), dùng để định lượng Methyl thủy ngân mẫu chuẩn chứng nhận SRM 2976 ERM-CE-464 Kết khơng có sai biệt đáng kể hai phương pháp LC-ICP-MS ID-LC-ICP-MS (28,80 µg/kg 29,03 µg/kg mẫu SRM 2976; 5544 µg/kg 5582 µg/kg mẫu ERM-CE-464) Kết luận: Phương pháp xác định hàm lượng Methyl thủy ngân cá LC-ICP-MS với độ đúng, độ xác cao; tiết kiệm chi phí hóa chất Do đó, phương pháp cung cấp kết đáng tin cậy việc đánh giá hàm lượng Methyl thủy ngân cá Từ khóa: methyl thủy ngân, cá Viện Y tế Cơng cộng TP Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: ThS Cù Hoàng Yến * Chuyên Đề Y Tế Công Cộng ĐT: 0384139754 Email: cuhoangyen@iph.org.vn 615 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2018 ABSTRACT APPLICATION OF LC-ICP-MS FOR THE ANALYSIS OF METHYLMERCURY IN FISH Tong Le Bao Tram, Cu Hoang Yen, Nguyen Huu Phat * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol 23 – No - 2019: 615 – 624 Background: As a global contaminant, mercury enters the food chain in both inorganic and organic chemical forms The most common natural forms of mercury found in the environment are metallic mercury, mercuric sulfide (cinnabar ore), Mercuric Chloride and Methylmercury Methylmercury is the predominant Mercury species in fish The USEPA states in an updated Mercury overview paper that in most adult fish, 90– 100% of Mercury content is Methylmercury (USEPA 2001) In order to support the monitoring of seafood quality, it is necessary to have a method to analyse mercury species with high sensitivity, stability, reliability and efficiency In the present paper, we focused on some crucial points of the analytical procedure of mercury speciation by liquid chromatography - inductively coupled plasma mass spectrometry Objectives: To research and build a reliable process in determining the content of Methyl mercury in fish Surveying and optimizing analytical conditions to save costs and chemicals but still ensuring analytical results with high accuracy and reliability To apply the procedure to the actual sample analysis after validating the method To apply isotope dilution technique for the method of determination of methyl mercury in fish, to evaluate the effectiveness of the method and giving a new method of isotope dilution technique Methods: To consult and to synthesize domestic and foreign documents related to research topics to guide the research process; to process the survey and the optimization of equipment using LC - ICP - MS in analyzing methyl mercury; to validate the reliability and accuracy of the process Results: A method of determination of methyl mercury in fish using liquid chromatography technique coupled with high frequency induction plasma source through spectral connection (LC-ICP-MS) was developed Quantitative extraction of methyl mercury species was achieved in a 1% (w/v) L-Cysteine solution by sonication for 30 minutes at 50 oC This solution was separated by using centrifugation and filtered through nylon filter membrane (pore size 0.45 µm) Chromatographic separation of mercury species was carried out on a C18 reverse phase column with 0.1% (w/v) L-Cysteine, 0.1% (w/v) L-Cysteine.HCl.H2O and 5% Methanol as the mobile phase Method validation included: defining methyl mercury linearity up to 10 µg/kg, the method limit of detection and the method limit of quantitation for fish were µg/kg and 15 µg/kg, respectively Recoveries ranged from 100.54 % to 101.68 % The trueness of method was determined by using a certified reference material ERMCE-464, with good recovery and bias The measurement uncertainty of the method was 15% A species-specific isotope dilution analysis approach, using 201CH3Hg+ was employed for the quantification of methyl mercury Two Certified Reference Materials (SRM 2976, ERM-CE-464) were analysed to assess the analytical performance No significant differences were found between LC-ICP-MS and ID-LC-ICP-MS for CH3Hg+ Conclusions: Method of determining the content of methyl mercury in fish by LC-ICP-MS was high accurate and precise; saving costs and chemicals Therefore, this method provides reliable results in assessing the content of methyl mercury in fish Keywords: methyl mercury, fish ĐẶT VẤN ĐỀ Cá thức ăn quan trọng chế độ ăn uống khỏe mạnh Tuy nhiên, số loại cá chứa hàm lượng thuỷ ngân tổng số Thủy ngân có tính tích lũy độc tồn dạng 616 vết Nó tồn dạng hóa học: nguyên tố, muối thủy ngân Methyl thủy ngân, Methyl thủy ngân có tính độc cao (7) Lượng Methyl thủy ngân tích luỹ thể sinh vật cỡ µg/kg, nên việc xác định khó khăn Các Chuyên Đề Y Tế Cơng Cộng Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 phương pháp xác định nguyên dạng ngày cho kết tách dạng thủy ngân tốt, nhiên việc lựa chọn phương pháp phù hợp tình phức tạp khó khăn vấn đề thiết bị hay ảnh hưởng mẫu phân tích Ngun tắc chung q trình phân tích ngun dạng kết nối hệ thống có nhiệm vụ phân tách sắc ký lỏng (LC), sắc ký khí (GC), tiêm dòng chảy, hóa hydride dùng bẫy lạnh, … với hệ thống phân tích tín hiệu đóng vai trò đầu dò (AAS, ICP, MS, MS/MS, ICP/MS) GC LC sử dụng việc phân tích dạng thủy ngân Mặc dù sắc ký khí cho khả phân giải cao xác định nhanh nhiều dạng tồn hóa học (thủy ngân vơ dạng alkyl-, aryl- thủy ngân), phương pháp đòi hỏi bước xử lý mẫu phức tạp, gây tốn thời gian, nhiễm bẩn mẫu, mẫu chuyển hóa dạng tồn lẫn Sắc ký lỏng kỹ thuật ưa chuộng việc tách dạng tồn thủy ngân khơng cần phải tạo dẫn xuất cho dạng thủy ngân thành hợp chất dễ bay trước đưa vào cột sắc ký lỏng (4) Khối phổ ghép cặp cảm ứng cao tần plasma (ICP-MS) đời trở thành phương pháp phát chọn lọc nguyên tố quan trọng sau trình phân tách Bởi ICP-MS dễ dàng kết nối với sắc ký lỏng (LC), nên LC-ICP-MS trở thành công cụ mạnh việc phân tích dạng nguyên tố, đặc biệt ứng dụng mẫu sinh học Bên cạnh phương pháp pha loãng đồng vị phương pháp mới, xác định trực tiếp, xác việc định lượng hàm lượng nguyên tố Nguyên cứu sử dụng chất chuẩn đồng vị giàu 201Hg-Me hãng sản xuất ISC-Science làm đồng vị thêm vào đồng vị 202Hg chọn để xác định hàm lượng MeHg có mẫu nhằm đánh giá hiệu phương pháp đưa hướng phát triển kỹ thuật pha loãng đồng vị Chuyên Đề Y Tế Công Cộng Nghiên cứu Y học Thủy sản nói chung cá nói riêng ngành hàng xuất Việt Nam Để hỗ trợ cho việc giám sát chất lượng thủy sản, cần phải có phương pháp phân tích ngun dạng thủy ngân hữu với độ nhạy, độ ổn định, độ tin cậy cao hiệu Do vậy, đề tài “Xây dựng quy trình xác định Methyl thủy ngân cá phương pháp LC-ICPMS” thực Mục tiêu nghiên cứu Nghiên cứu xây dựng quy trình tin cậy việc xác định hàm lượng Methyl thủy ngân cá Khảo sát tối ưu hóa điều kiện phân tích nhằm tiết kiệm chi phí, hóa chất đảm bảo kết phân tích có độ xác tin cậy cao Áp dụng quy trình vào phân tích mẫu thực tế sau xác nhận giá trị sử dụng phương pháp Áp dụng kỹ thuật pha loãng đồng vị vào phương pháp xác định Methyl thủy ngân cá, nhằm đánh giá hiệu phương pháp đưa hướng phát triển kỹ thuật pha loãng đồng vị ĐỐITƯỢNG- PHƯƠNG PHÁPNGHIÊNCỨU Mẫu thử Mẫu khảo sát quy trình: mẫu thịt cá loại bỏ da đánh giá độ đồng theo ISO GUIDE 35, với hàm lượng thủy ngân tổng (458±10) µg/kg.Mẫu chuẩn đối chứng: mẫu mơ sò “SRM 2976” Viện Tiêu chuẩn Công nghệ Quốc gia Hoa kỳ NIST, hàm lượng MeHg (28,09±0,31) µg/kg mẫu cá ngừ ký hiệu “ERM–CE464” Viện đo lường vật liệu chuẩn IRMM, hàm lượng MeHg (5,50±0,17) mg/kg Hóa chất Nước cất siêu sạch, loại ion, điện trở ≥ 18 MΩ.L-Cysteine.HCl.H2O, độ tinh khiết ≥99%, khối lượng phân tử 175,64 g/mol L-Cysteine, độ tinh khiết ≥99%, khối lượng phân tử 121,16 g/mol Acid Nitric HNO3 đậm đặc 65% (w/w) Acid Chlohydric HCl đậm đặc 37% (w/w) 617 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2018 Hydrogen Peroxide H2O2 30% Dung dịch ly trích L-Cysteine.HCl.H2O 0,3%; 0,5%; 0,7%; 1%; 1,3% (w/v) Dung dịch L-Cysteine.HCl.H2O 10% (w/v) dùng pha chuẩn Pha động: L-Cysteine:LCysteine.HCl.H2O với nồng độ 0,05%:0,05%; 0,1%:0,1%; 0,2%:0,2%; 0,5%:0,5% Chất chuẩn Chuẩn CH3HgCl tinh thể, độ tinh khiết ≥95%, khối lượng phân tử 251,08 g/mol Chuẩn HgCl2 tinh thể, độ tinh khiết ≥99,5%, khối lượng phân tử 271,50 g/mol Chuẩn đồng vị giàu 201HgMeHg, hãng sản xuất ISC-Science, nồng độ (5,44 ± 0,05) µg/g Dung dịch chuẩn gốc CH3HgCl nước khử ion, chứa ≤20% methanol (v/v), nồng độ Hg 1000 mg/L, dung dịch lý hàm lượng Hg vơ >3% tính hàm lượng CH3HgCl lý thuyết, thao tác tủ hút Dung dịch chuẩn gốc Hg vô cơ–HgCl2 HCl 0,1% (v/v), nồng độ Hg 2000 mg/L Dung dịch hỗn hợp chuẩn trung gian, Hg CH3HgCl 1000 µg/L Hg HgCl2 1000 µg/L L-Cysteine.HCl.H2O 0,02% (w/v) Đường chuẩn làm việc (0–10 µg/L) pha L-Cysteine.HCl.H2O 1% (w/v) Các dung dịch chuẩn pha hàng ngày đựng chai thủy tinh tối màu Dụng cụ Bình định mức 10 mL, 20 mL, 50 mL; micropippete 0,1–1mL, 20–200 µL; ống ly tâm 50 mL; đầu lọc (filter) 0,45 µm 30 mm; xy lanh mL; lọ chứa mẫu nâu mL Thiết bị Hệ thống máy plasma cao tần ghép nối khối phổ (ICP/MS): có khả quét khối (m/z): 5– 240 amu, độ phân giải 0,9 amu 10% chiều cao peak; kết nối hệ thống sắc ký lỏng (LC): cột phân tích C18, µm, 150 x 4,6 mm, cột bảo vệ C18, µm, bơm kênh, tiêm mẫu tự động, vòng tiêm mẫu (loop) 100 µL; cân phân tích có độ xác mg; máy xay mẫu 10000 vòng/phút; máy ly tâm 6000 vòng/phút; máy vortex (tốc độ tối đa 2500 vòng/phút); bể điều nhiệt 60±4oC; bể siêu âm có gia nhiệt; hệ thống lò phá mẫu vi 618 sóng; máy lọc nước siêu sạch; tủ hút khí độc Tối ưu chương trình vận hành thiết bị ICP–MS Sử dụng dung dịch hiệu chỉnh (set up solution) chứa hỗn hợp µg/L Be, Ce, In, Mg, U dung dịch HNO3 1% với dòng pha động ghép vào chung với dòng hút dung dịch hiệu chỉnh suốt trình hiệu chỉnh nhằm tối ưu độ nhạy, độ phân giải chuẩn hóa số khối, tối ưu tốc độ dòng khí Ar phun sương Sử dụng dung dịch chuẩn MeHg µg/L làm dung dịch để khảo sát Chọn cơng suất cho tín hiệu cường độ Hg tối ưu để tối ưu cơng suất phát sóng cao tần Tối ưu điều kiện vận hành sắc ký lỏng Tối ưu nồng độ pha động L-cysteine & Lcysteine.HCl.H2O (0,05%; 0,10%; 0,20%; 0,50%), thành phần pha động (L-cysteine+L-cysteine.HCl.H2O; L-cysteine+L-cysteine.HCl.H2O+Methanol- 1%, 2%, 3%, 4%, 5% (v/v)) thông qua yếu tố đánh giá thời gian lưu MeHg độ phân giải Hg vô MeHg Tối ưu quy trình xử lý mẫu Thơng qua tối ưu nồng độ dung mơi ly trích, L-cysteine.HCl.H2O (0,5%, 1%, 2%, 3%, %), Thời gian ly trích (10, 20, 30, 40, 50 phút) Nhiệt độ ly trích (30oC, 40oC, 50oC, 60oC, 70oC) Đánh giá hàm lượng MeHg ly trích từ mẫu cá khảo sát quy trình Xác định thông số phương pháp Tiến hành dựng đường chuẩn khoảng 0÷10g/L để khảo sát độ tuyến tính: dựng đường chuẩn Hg2+, MeHg dịch ly trích từ mẫu cá khơng chứa thủy ngân (mẫu trắng) nhằm loại trừ ảnh hưởng mẫu đến tín hiệu đo, đường chuẩn xây dựng phải có hệ số hồi quy tuyến tính thoả yêu cầu 0,99 ≤ R2 ≤ Để xác định độ đặc hiệu/chọn lọc phương pháp, chúng tơi phân tích lặp lại 06 lần dung môi chiết mẫu 06 lần mẫu ERM CE464, độ chọn lọc phương pháp đáp ứng yêu cầu sắc ký đồ dung môi chiết không tồn Chuyên Đề Y Tế Công Cộng Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 peak i-Hg MeHg, sắc ký đồ mẫu chuẩn có peak Giá trị giới hạn phát (MLOD) giới hạn định lượng (MLOQ) khảo sát dựa thực thí nghiệm tính tốn theo hệ số R mẫu SRM 2976 Giá trị MLOD, MLOQ xác định: SD   (C i  C )2 n 1 MLOD = × SD, MLOQ = × MLOD R= Với Ci nồng độ MeHg phân tích mẫu SRM 2976 Nếu < R 3000 40120 >15000 136010 >50000 99973 >40000 Chuyên Đề Y Tế Công Cộng Độ xác khối Kết Yêu cầu 7,025 7,016±0,05 23,985 24,025±0,05 114,875 114,904±0,05 238,025 238,050±0,05 Độ phân giải Kết Yêu cầu 0,691 0,7±0,03 0,673 0,7±0,03 0,728 0,7±0,03 0,708 0,7±0,03 619 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2018 Hình 1: Ảnh hưởng nồng độ pha động đến thời gian lưu diện tích peak i-Hg Hình 3: Ảnh hưởng nồng độ Methanol đến thời gian lưu diện tích peak i-Hg Hình 2: Ảnh hưởng nồng độ pha động đến thời gian lưu diện tích peak MeHg Hình 4: Ảnh hưởng nồng độ Methanol đến thời gian lưu diện tích peak MeHg Điều kiện tối ưu vận hành thiết bị Bảng Điều kiện vận hành thiết bị tối ưu Điều kiện ICP/MS Điều kiện LC Cơng suất RF 1100 W Tốc độ dòng pha động mL/phút Tốc độ dòng khí Ar tạo Plasma 17 L/phút Thể tích tiêm 50 µL Tốc độ dòng khí Ar phụ trợ 1,2 L/phút Thành phần pha động L-Cysteine 0,1% (w/v) + L-Cysteine.HCl.H2O 0,1% (w/v) + CH3OH 5%(v/v) Tốc độ khí Ar phun sương 0,86 L/phút Thời gian lấy tín hiệu 800 ms Khối lượng /điện tích Chế độ chạy 202 Standard Tối ưu quy trình xử lý mẫu Nồng độ dung mơi trích ly Nồng độ L-Cysteine.HCl.H2O 1% nồng độ tối ưu (Hình 5) Thời gian ly trích Thời gian ly trích tối ưu 30 phút (Hình 6) Nhiệt độ ly trích 50oC điều kiện nhiệt độ tối ưu để ly trích MeHg khỏi mẫu cá (Hình 7) 620 Hình Ảnh hưởng nồng độ L-Cysteine.HCl.H2O đến khả ly trích dạng MeHg mẫu cá Chuyên Đề Y Tế Cơng Cộng Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Nghiên cứu Y học Quy trình ly trích MeHg từ mẫu cá Cân 0,5 g mẫu cá vào ống thủy tinh Pyrex, thêm 10 mL L-Cysteine.HCl.H2O 1%,lắc mạnh Đánh siêu âm 30 phút 50oC Để nguội nhiệt độ phòng, định mức 50 mL Ly tâm phút, tốc độ 4500 vòng/phút Lọc qua màng (0,45 µm) đo sau lọc Hình Ảnh hưởng thời gian ly trích đến hàm lượng MeHg mẫu khảo sát quy trình Xác định thông số phương pháp Độ đặc hiệu/chọn lọc: Sau chạy mẫu trắng, chuẩn, mẫu CRM ERM464cho sắc ký đồ Hình Mẫu trắng khơng xuất peak vị trí peak chuẩn i-Hg MeHg, mẫu CRM chuẩn µg/L có xuất peak (i-Hg MeHg) công bố nhà sản xuất (Bảng 3) Phương pháp pha loãng đồng vị Hình7 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hàm lượng MeHg mẫu khảo sát quy trình Kết đánh giá từ phép t-test phương pháp pha loãng đồng vị phương pháp xây dựng trình bày Bảng Hình Sắc ký đồ mẫu trắng, mẫu ERM-CE464, chuẩn i-Hg MeHg µg/L Bảng Các thơng số trình xác nhận giá trị sử dụng phương pháp Thông số Kết Thông số Kết Đường chuẩn – Khoảng tuyến tính 0,2–10 µg/L, R =0,9999 Hiệu suất thu hồi 100,5–101,7% MLOD/ MLOQ (µg/kg) 5/15 Độ chệch (tính theo mẫu ERM464) 1,4% Độ lặp lại/ Độ tái lặp nội phòng thí nghiệm (%) 4,9 %/7,2 % Độ không đảm bảo đo 15 % Bảng So sánh kết phân tích hàm lượng MeHg mẫu chuẩn chứng nhận LC-ICP-MS ID-LCICP-MS Mẫu Giá trị chứng nhận LC-ICP-MS (µg/kg) ID-LC-ICP-MS (µg/kg) t - test t LT t TN p SRM 2976 28,09 ± 0,31 28,8 29,0 2,77 0,49 0,64 ERM-CE-464 500 ± 170 5544 5582 2,77 0,43 0,69 Phân tích mẫu thực Kết phân tích 20 mẫu cá thị trường cho thấy, hàm lượng MeHg có mẫu dao động từ 22,31 µg/kg đến 476,75 µg/kg, tùy Chuyên Đề Y Tế Cơng Cộng loại cá (cá kiếm: 376,8-476,8 µg/kg; cá ngừ mắt to: 221,8-252,9 µg/kg; cá ngừ vây vàng: 304,8-357,0 µg/kg; cá lao không vảy: 88,8-201,9 µg/kg; cá ngừ chấm: 37,6-97,8 µg/kg; cá ngừ chú: 621 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2018 19,3-102,3 µg/kg; cá ngừ bò: 22,3-29,8 µg/kg) BÀN LUẬN Tối ưu chương trình vận hành thiết bị ICP–MS Công suất máy phát cao tần RF tối ưu là1100W cho cường độ tín hiệu thủy ngân cao Khi công suất máy phát cao tần tăng tín hiệu Hg tăng đến ngưỡng mà cơng suất tiếp tục tăng tín hiệu giảm Việc thay đổi công suất làm cho nhiệt độ vùng plasma thay đổi, ảnh hưởng đến độ nhạy thủy ngân Bên cạnh đó, thủy ngân dễ bay nhiệt độ thường Khi nhiệt độ tăng cao, thời gian thủy ngân tồn vùng plasma ngắn hơn, khó đến sampler cone làm giảm độ nhạy Tốc độ dòng khí mang Argon 0,86 L/phút cho tín hiệu thu tối ưu với CeO (156)/Ce (140) 2288,18/97286,81=0,0234 thỏa điều kiện ≤0,25–3% tín hiệu (cps) In 115=1438834,56, thỏa điều kiện nhà sản xuất Độ nhạy, độ phân giải chuẩn hóa số khối thơng qua q trình hiệu chỉnh đạt yêu cầu nhà sản xuất Tối ưu điều kiện vận hành sắc ký lỏng Nồng độ pha động Khi thay đổi nồng độ pha động khoảng từ 0,05% đến 0,5%, thời gian lưu diện tích peak dạng thủy ngân i-Hg MeHg không thay đổi nhiều Hơn nữa, hệ số phân giải Rs tất trường hợp lớn 2, chứng tỏ peak tách tốt, không ảnh hưởng nhiều nồng độ pha động Như kết luận nồng độ pha động không ảnh hưởng đến khả tách cách chất phân tích Do chọn nồng độ pha động L-Cysteine 0,1% LCysteine.HCl.H2O 0,1% nồng độ tối ưu, dùng cho khảo sát Thành phần pha động Hàm lượng methanol tăng làm giảm đáng kể thời gian lưu MeHg có ảnh hưởng đến dạng Hg2+ phân cực Do có 622 thể kết luận rằng, tương tác cation, tương tác pha động phần polymer cột hợp chất thủy ngân khơng phân cực diễn Hình dạng peak dạng i-Hg MeHg cải thiện thêm Methanol đặc biệt, độ nhạy ICP-MS tăng lên tăng hàm lượng methanol Tuy nhiên, tăng 5% lượng methanol, plasma khơng trì Nguyên nhân lượng carbon đưa vào plasma nhiều Khi đó, carbon plasma hấp thu lượng, làm giảm khả ion hóa plasma, làm suy giảm độ nhạy Áp suất hữu cao gây khó khăn cho việc trì plasma Điều kiện tối ưu vận hành thiết bị Sau tối ưu điều kiện vận hành thiết bị LC-ICP-MS, tiến hành chạy chuẩn hỗn hợp gồm Hg2+ µg/L CH3Hg+ µg/L, thu sắc ký đồ theo Hình (các mũi Hg2+ µg/L CH3Hg+ µg/L tách tốt) Tối ưu quy trình xử lý mẫu Nồng độ dung mơi trích ly Ở nồng độ 0,5% dung mơi ly trích, lượng MeHg mẫu khảo sát quy trình thấp so với giá trị nồng độ lại (389,05 µg/kg), điều chứng tỏ lượng L-Cysteine.HCl.H2O chưa đủ để ly trích hết dạng MeHg khỏi mẫu cá Khi tăng hàm lượng dung mơi ly trích lên 1%, 2%, 3%, 4%, kết phân tích lượng MeHg mẫu 475,92 µg/kg, 478,85 µg/kg, 474,51 µg/kg, 477,18 µg/kg Như hàm lượng dung mơi ly trích từ 1% đến 4% cho hiệu suất ly trích khơng sai khác đáng kể MeHg có mẫu khảo sát quy trình ly trích hết khỏi mẫu Chọn nồng độ LCysteine.HCl.H2O 1% nồng độ tối ưu vừa tiết kiệm hóa chất, vừa đảm bảo hiệu suất ly trích tốt Thời gian ly trích Thời gian ly trích 30 phút bể siêu âm giúp ly trích hồn tồn dạng thủy ngân khỏi mẫu cá Khi tăng thời gian ly trích, hàm lượng MeHg khơng thay đổi Do đó, chọn Chuyên Đề Y Tế Công Cộng Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 thời gian ly trích tối ưu 30 phút cho khảo sát Nhiệt độ ly trích Ở nhiệt độ 30oC, hàm lượng MeHg ly trích thấp Lượng MeHg tăng nhiệt độ tăng từ 40oC, 50oC 60oC Nhưng tăng đến 70oC, hàm lượng thủy ngân lại giảm Như vậy, chọn 50oC điều kiện nhiệt độ tối ưu để ly trích MeHg khỏi mẫu cá Xác định thông số phương pháp Kết từ Bảng cho thấy thơng số đạt tiêu chí theo hai tài liệu Appendix F, trang AOAC 2016 CAC/GL 54-2004(1,2,5) Phương pháp pha loãng đồng vị Kết đánh giá từ phép t-test cho thấy, giá trị t thực nghiệm nhỏ giá trị t lý thuyết Giá trị p >0,05 nên chênh lệch giá trị trung bình phương pháp (phương pháp xây dựng pha lỗng đồng vị) khơng có ý nghĩa xảy ngẫu nhiên, nói cách khác kết phân tích MeHg phương pháp không sai khác đáng kể mặt thống kê Phân tích thủy ngân nguyên dạng bị ảnh hưởng nhiều mẫu phương pháp phân tích Các q trình ly trích tách tạo dẫn xuất gây phản ứng methyl hóa de-methyl hóa dạng thủy ngân, làm chúng khơng tồn dạng ban đầu, gây khó khăn cho việc xác định xác hàm lượng thủy ngân nguyên dạng Do thời gian có hạn nên đề tài chưa nghiên cứu đến chuyển hóa dạng thủy ngân quy trình phân tích mẫu cá Phân tích mẫu thực Tất kết giới hạn cho phép Quy chuẩn Việt Nam(3), đó, cá kiếm loại cá có hàm lượng MeHg cao hết Cá kiếm lồi cá lớn, có thời gian sống lâu, chúng có thời gian tích lũy MeHg nhiều hơn, hàm lượng MeHg có chúng cao so với loài cá cỡ nhỏ khác Kết đề tài có tương đồng với số nghiên cứu giới Chuyên Đề Y Tế Công Cộng Nghiên cứu Y học Alfredo Montero-Alvareza(1) Susan C Hight(9) Alfredo Montero-Alvareza cộng xác định hàm lượng MeHg 12 loại cá thị trường khu vực Cuba rằng, hàm lượng MeHg có cá kiếm cao lồi cá khác, khoảng từ 180 µg/kg đến 604 µg/kg Tương tự, Susan C Hight cộng xác định hàm lượng MeHg có mẫu cá kiếm Đài Loan khoảng 193 µg/kg đến 474 µg/kg Giá trị tương đồng với kết đề tài KẾT LUẬN Đề tài đưa phương pháp xác định hàm lượng MeHg cá LC- ICPMS với độ đúng, độ xác cao, cung cấp kết đáng tin cậy việc đánh giá hàm lượng MeHg cá với giới hạn phát (LOD) ng/g, giới hạn định lượng (LOQ) 15 ng/g, hiệu suất thu hồi đạt từ 100,5–101,7%, độ lặp lại 4,9%, độ tái lập nội phòng thí nghiệm 7,2% độ không đảm bảo đo 15 % mẫu cá Áp dụng kỹ thuật pha loãng đồng vị để xác định hàm lượng MeHg có mẫu SRM 2976 ERM-CE-464 Kết phân tích khơng có sai lệch đáng kể so với giá trị chứng nhận Đề tài áp dụng kỹ thuật pha loãng đồng vị để xác định hàm lượng MeHg có mẫu chuẩn chứng nhận, chưa tính đến nguồn gây sai số chưa áp dụng kỹ thuật lên mẫu thật Để ứng dụng kỹ thuật pha lỗng đồng vị đạt kết xác nhất, cần nghiên cứu thêm yếu tố gây sai số sau: nhiễm bẩn trình lấy mẫu, hàm lượng ẩm có mẫu, dẫn đến sai khác tỉ lệ dạng đồng vị lý thuyết mẫu thực tế; nhiễu nền, nhiễu số khối gây thay đổi cường độ tín hiệu đồng vị; ứng dụng kỹ thuật pha lỗng đồng vị mẫu cá ngồi thị trường; mở rộng phạm vi áp dụng với mẫu thủy hải sản khác 623 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2018 TÀI LIỆU THAM KHẢO Alfredo MA, María FC, Alfredo SM (2013) Mercury speciation in Cuban commercial edible fish by HPLC-ICP-MS using the double spike isotope dilution analysis strategy International Journal of Environmental Analytical Chemistry, 94:36-47 AOAC Official Methods of Analysis (2016) Guidelines for Standard Method Performance Requirements Appendix F: p.9, AOAC International, Rockville, USA Bộ Y Tế (2011) Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia giới hạn ô nhiễm kim loại nặng thực phẩm QCVN 8-2:2011/BYT, Hà Nội Bruno LB, Jairo R, Samuel S, Vanessa OS, Fernando B (2011) Mercury speciation in seafood samples by LC–ICP-MS with a rapid ultrasound-assisted extraction procedure: Application to the determination of mercury in Brazilian seafood samples Food Chemistry, 126:2000 - 2004 Codex Alimentarius Commission (2011) Guidelines on measurement uncertainty - CAC/GL54-2004 The Food and Agriculture Organization of the United Nations Koplík R, Klimešová I, Mališová K, Mestek O (2014) 624 Determination of mercury species in foodstuffs using LC-ICPMS: the applicability and limitations of the method Czech J Food Sci, 32:249–259 Nguyễn Thuần Anh (2011) Hàm lượng thủy ngân loài hải sản tiêu dùng phổ biến Nha Trang Tạp chí Khoa học Phát triển, pp.937 - 941 Ong K, Lim L, Ghanthimathi S, Ibrahim N, Nasir Z (2013) Determination of Methylmercury in Fish Samples with HPLCICP-MS From Sources to Solution, doi: 10.1007/978-981-4560-702_68 Springer Science & Business Media Singapore Susan CH, John C (2006) Determination of methyl mercury and estimation of total mercury in seafood using high performance liquid chromatography (LC) and inductively coupled plasmamass spectrometry (ICP-MS): Method development and validation Analytica Chimica Acta, 576:160 – 172 Ngày nhận báo: 15/08/2019 Ngày phản biện nhận xét báo: 31/08/2019 Ngày báo đăng: 15/10/2019 Chuyên Đề Y Tế Công Cộng ... lượng thủy sản, cần phải có phương pháp phân tích ngun dạng thủy ngân hữu với độ nhạy, độ ổn định, độ tin cậy cao hiệu Do vậy, đề tài Xây dựng quy trình xác định Methyl thủy ngân cá phương pháp LC- ICPMS”... hóa học: nguyên tố, muối thủy ngân Methyl thủy ngân, Methyl thủy ngân có tính độc cao (7) Lượng Methyl thủy ngân tích luỹ thể sinh vật cỡ µg/kg, nên việc xác định khó khăn Các Chuyên Đề Y Tế Công... có độ xác tin cậy cao Áp dụng quy trình vào phân tích mẫu thực tế sau xác nhận giá trị sử dụng phương pháp Áp dụng kỹ thuật pha loãng đồng vị vào phương pháp xác định Methyl thủy ngân cá, nhằm