Xây dựng quy trình nhân nhanh cây đinh lăng có hàm lượng Saponin cao bằng phương pháp in vitro

Đinh lăng (Polyscias spp.) là cây trồng chứa saponin thường sử dụng trong y học cổ truyền. Hợp chất saponin trong cây có tác dụng chống oxy hóa, chống stress và các triệu chứng trầm cảm. Do nguồn nguyên liệu còn khá hạn chế nên nhân giống cây Đinh lăng (có hàm lượng saponin cao) bằng phương pháp in vitro nhằm cung cấp nguồn cây giống phong phú và ổn định.

Tạp chı́ Khoa học Trường Đại học Cầ n Thơ Phần B: Nông nghiệp, Thủy sản Công nghệ Sinh học: 44 (2016): 104-112 XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN NHANH CÂY ĐINH LĂNG CÓ HÀM LƯỢNG SAPONIN CAO BẰNG PHƯƠNG PHÁP in vitro Phạm Thị Thì, Đồn Thị Quỳnh Hương, Dương Ngọc Kiều Thi, Phạm Văn Thắng Nguyễn Thoại Ân Trung tâm Nghiên cứu Phát triển Nông nghiệp Công nghệ cao Thông tin chung: Ngày nhận: 14/09/2015 Ngày chấp nhận: 25/07/2016 Title: Protocol establichment for in vitro propagation of high saponin containing Polyscias spp Từ khóa: Oleanolic acid, đinh lăng in vitro, HPLC, Polyscias fruticosa (L.), Saponin, tái sinh chồi, tăng sinh chồi Keywords: Oleanolic acid, HPLC, micropropagation, Polyscias fruticosa (L.), saponin, shoot prolifertion, shoot regenertions ABSTRACT Polyscias spp is a plant which contains the saponin compounds used in traditional medicine Saponin compounds used as anti-oxidant, anti-stress substances and treatment of depressive symptoms Because of limit of saponin materials, micropropagation of Polyscias spp (high saponin content) is necessary to supply stably a large amount of plantlets Results showed that Polyscias fruticosa L containing high contents of triterpen saponins and oleanolic acid (77.17 g/g) was used as the experimental material sources for micropropagation The best medium for shoot regeneration was MS + mg/l BAP + 10g/l agar + 30 g/l sucrose The most appropriate medium for shoot proliferation was MS + mg/l BAP + 0.5 mg/l IBA + 10 g/l agar + 30 g/l sucrose The appropriate medium for growth of shoots was MS + mg/l NAA + 10 g/l agar + 30 g/l sucrose Plantlets (4 ÷ cm in height, ÷ roots, ÷ cm in root length) were grown in nursery conditions After weeks, the growth of plantlets was good in the natural environment with survival rate of 90% and the presence of oleanolic acid in vitro Polyscias spp TÓM TẮT Đinh lăng (Polyscias spp.) trồng chứa saponin thường sử dụng y học cổ truyền Hợp chất saponin có tác dụng chống oxy hóa, chống stress triệu chứng trầm cảm Do nguồn nguyên liệu hạn chế nên nhân giống Đinh lăng (có hàm lượng saponin cao) phương pháp in vitro nhằm cung cấp nguồn giống phong phú ổn định Kết cho thấy, Đinh lăng nhỏ (P fruticosa (L.) có diện saponin triterpen hàm lượng oleanolic acid trung bình đạt 77,17 µg/g sử dụng làm nguồn nguyên liệu ban đầu Môi trường tái sinh chồi tốt MS + mg/l BAP + 10 g/l Agar + 30 g/l đường sucrose Môi trường tăng sinh chồi tốt MS + mg/l BAP + 0,5 mg/l IBA + 10 g/l Agar + 30 g/l đường sucrose Sự phát triển chồi thành hồn chỉnh thích hợp môi trường MS + mg/l NAA + 10 g/l Agar + 30 g/l đường sucrose Sau đủ tiêu chuẩn (chiều cao ÷ cm, số rễ ÷ rễ, chiều dài rễ đạt ÷ cm) trồng điều kiện vườn ươm, theo dõi sau tuần, có khả thích ứng tốt với điều kiện mơi trường tự nhiên, có tỷ lệ sống 90% có diện oleanolic acid Đinh lăng in vitro Trích dẫn: Phạm Thị Thì, Đồn Thị Quỳnh Hương, Dương Ngọc Kiều Thi, Phạm Văn Thắng Nguyễn Thoại Ân, 2016 Xây dựng quy trình nhân nhanh đinh lăng có hàm lượng saponin cao phương pháp in vitro Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ 44b: 104-112 104 Tạp chı́ Khoa học Trường Đại học Cầ n Thơ Phần B: Nông nghiệp, Thủy sản Công nghệ Sinh học: 44 (2016): 104-112 Cây Đinh lăng thuộc Apiales, Araliaceae, chi: Polyscias, lồi gồm có: ĐẶT VẤN ĐỀ Đinh lăng loại người trồng trọt sử du ̣ng từ lâu đời Ở Việt Nam nhiều nước giới, đinh lăng sử dụng làm gia vị số ăn Ngồi việc sử dụng thực phẩm, đinh lăng sử dụng vị thuốc y học cổ truyền Trong đinh lăng có hợp chất quan trọng polyacetylen saponin (Vo et al., 1998; Chaboud et al., 1995) Hợp chất saponin, đặc biệt triterpen có tác dụng tích cực chống oxy hóa, chống stress triệu chứng trầm cảm (Lutomski et al., 1992; Bensita et al., 1998) Hợp chất polyacetylen có vai trò chống ung thư, chống oxy hóa, kháng khuẩn kháng nấm (Lutomski et al., 1992) Trong đó, hai hợp chất polyacetylen panaxynol hepadeca 1,8 (e) - dien - 4,6 diyn - 3,10 diol đinh lăng có chủ yếu nhân sâm, điều cho thấy có khả sử dụng đinh lăng để thay cho nhân sâm Hiện nay, nhu cầu hợp chất dược phẩm tăng cao Trong đó, nguyên nhân khiến cho chế phẩm chứa Đinh lăng thị trường nguồn nguyên liệu hạn chế, nguồn cung cấp giống chủ yếu giâm cành, chất lượng giống lại không cao, trồng theo phương pháp tự nhiên - năm thu hoạch rễ hàm lượng saponin triterpen tự nhiên không đủ đáp ứng nhu cầu dược liệu Việc đáp ứng nhanh bền vững nguồn giống có chất lượng tốt yêu cầu cấp bách họ:  Đinh lăng nhỏ Polyscias fruticosa (L.) Harms  Đinh lăng tròn Polyscias balfouriana Baill  Đinh lăng đĩa Polyscias scutellarius (Burm f) Merr  Đinh lăng Polyscias serrata Balf  Đinh lăng trổ gọi Đinh lăng viền bạc Polycias guilfoylei (Cogn Marche) Baill  Đinh lăng to gọi Đinh lăng ráng Polyscias filicifolia (Merr) Baill Đinh lăng nhỏ có hai loại chính: Đinh lăng nếp (lá nhỏ, xoăn, thân nhẵn, củ to, rễ nhiều mềm, vỏ bì dày cho suất cao chất lượng tốt) Đinh lăng tẻ (lá xẻ thùy to, vỏ thân xù xì, màu xanh nhạt, củ nhỏ, rễ cứng, vỏ bì mỏng, suất thấp) Môi trường MS (Murashige and Skoog, 1962), Benzyl Amino Purine (BAP) (Sigma Aldrich), Indo Butyric Acid (IBA) (Sigma Aldrich), Naphthalen Acetic Acid (NAA) (Sigma Aldrich), agar (Việt Nam), đường (Việt Nam), cồn 70% (Việt Nam), HgCl2 0,1% (Sigma Aldrich) Tủ cấy nồi hấp vô trùng (Shinsaeng), đèn cồn, đĩa, dao kẹp cấy 2.2 Phương pháp 2.2.1 Khảo sát hàm lượng saponin giống ban đầu Mục tiêu nghiên cứu:  Phục vụ cho việc cung cấp nguồn giống Đinh lăng phong phú ổn định Mẫu chọn đồng giống có đánh số thứ tự lấy mẫu Sau lấy mẫu, đem rửa sạch, cắt nhỏ, phơi khô cho nước đem sấy khô nhiệt độ 40°C (mẫu khơng hoạt tính) trọng lượng không đổi Cho mẫu vào máy nghiền ray nhỏ đường kính 0,1 mm, trộn mẫu cho đồng Bột bảo quản hộp kín, tránh bị ẩm mốc để tiến hành nghiên cứu Thí nghiệm bố trí theo kiểu hồn tồn ngẫu nhiên (CRD), yếu tố, với nghiệm thức, chọn ngẫu nhiên 20 mẫu Sau thu mẫu, định tính xác định saponin phản ứng tạo bọt để xác định có mặt saponin Từ kết thu được, sau dùng phản ứng (Liebermann – Burchard) tạo màu để xác định nhóm saponin mẫu Và định lượng hàm lượng saponin phương pháp sắc kí lỏng cao áp (High Pressure Liquid Chromatography, HPLC) phòng thí nghiệm Trường Đại học Khoa học Tự  Ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô đối tượng Đinh lăng, dược liệu có giá trị kinh tế cao Xây dựng quy trình nhân nhanh Đinh lăng có hàm lượng saponin cao phương pháp in vitro cho hệ số nhân chồi cao, chất lượng tốt, tiền đề cho nghiên cứu sâu Đinh lăng số dược liệu khác  Có thể ứng dụng nhân nhanh Đinh lăng để sản xuất đại trà sử dụng Đinh lăng in vitro để làm nguồn cung cấp dược liệu ban đầu VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu Giống Đinh lăng, mẫu Đinh lăng đồng năm tuổi giống Đinh lăng khu vực Xã Phạm Văn Cội, huyện Củ Chi, Tp HCM 105 Tạp chı́ Khoa học Trường Đại học Cầ n Thơ Phần B: Nông nghiệp, Thủy sản Công nghệ Sinh học: 44 (2016): 104-112 nhiên- TP.HCM Xác định có mặt saponin in vitro Xác định saponin nhóm triterpen hay steroid Định lượng hàm lượng oleanolic acid saponin Tiến hành lấy số liệu sau tuần nuôi cấy: Chiều cao chồi (cm), số chồi, trọng lượng chồi (g) Hòa tan lượng cắn tương ứng với g dược liệu vào ml nước nóng Lọc vào ống nghiệm 1,6 cm x1,6 cm để nguội, thêm nước cho vừa đủ 10 ml, dùng ngón tay bịt miệng ống nghiệm lắc mạnh, dứt khoát theo chiều dọc ống nghiệm phút (= 30 lần lắc) Để yên ống nghiệm, quan sát lớp bọt đánh giá kết dựa vào Bảng Mẫu sau thực xong thí nghiệm 1, chọn mẫu đồng có kích thước cm sử dụng làm vật liệu ban đầu để bố trí thí nghiệm Cấy mẫu vào bình chứa mơi trường có bổ sung loại nồng độ auxin gồm NAA IBA sử dụng đơn từ 0,5; 1; 2; 3; mg/l Thí nghiệm bố trí theo kiểu CRD, với 12 nghiệm thức Cấy chồi/ bình tam giác, bình tam giác /NT lặp lại lần Chỉ tiêu theo dõi chiều cao (cm), số lá, chiều dài (cm), số rễ, chiều dài rễ (mm), trọng lượng rễ (g) sau tuần nuôi cấy  Khảo sát ảnh hưởng loại nồng độ auxin thích hợp lên tái sinh rễ Bảng 1: Độ bền lớp bọt Độ bền lớp bọt (phút) 15 30 60 Kí hiệu + ++ +++  Khảo sát tỷ lệ sống Đinh lăng in vitro giai đoạn vườn ươm Các có đủ tiêu chuẩn có chiều cao ÷ cm, có trở lên, có ÷ rễ chiều dài rễ đạt ÷ cm Sau đó, huấn luyện ngồi tự nhiên khoảng tuần, gấp rửa agar bám xung quanh rễ, trồng giá thể đất nhà lưới có mái che Trong tuần lễ đầu, phun sương nước cho nhiều lần (2 ÷ lần) ngày để giữ ẩm cho cây, tuần kết hợp phun vitamin B1 lần/tuần Ở tuần sử dụng phân bón NPK 30 - 10 - 10, tiến hành phun lần/tuần Theo dõi tỉ lệ sống phát triển vườn ươm sau 30 ngày nuôi cấy 2.2.2 Nhân nhanh in vitro  Khảo sát ảnh hưởng nồng độ BAP lên tái sinh chồi Đinh lăng Chọn mẫu đồng khu vực vườn ươm giống thí nghiệm rửa vòi nước máy 30 phút để loại bỏ cát bụi bám mẫu, dùng nước rửa chén pha loãng 1% chà phần thân bị hóa nâu rửa lại nước Sau đó, lắc mẫu nước rửa chén 1% 30 phút rửa với nước cất Đem mẫu vào tủ cấy lau cồn 700 rửa lại lần với nước cất vơ trùng Sau ngâm mẫu HgCl2 0,1% lắc mẫu phút Rửa mẫu nước cất vô trùng Rồi cấy mẫu vào bình chứa mơi trường có bổ sung BAP với nồng độ từ 1,2; 1,4; 1,6; 1,8; 2; 2,5 mg/l Thí nghiệm bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên (Complete Randomized Desigh, CRD), với nghiệm thức (NT) Cấy mẫu/bình tam giác, bình tam giác /NT lặp lại lần Các tiêu theo dõi số chồi tái sinh (chồi/cụm), chiều cao chồi (cm), trọng lượng chồi (g) sau tuần nuôi cấy  Xác định hàm lượng saponin Đinh lăng in vitro Sau thu mẫu, định tính xác định saponin phản ứng tạo bọt để xác định có mặt saponin Từ kết thu được, sau dùng phản ứng (Liebermann – Burchard) tạo màu để xác định nhóm saponin mẫu Và định lượng hàm lượng saponin phương pháp sắc kí lỏng cao áp Xác định có mặt saponin in vitro Xác định saponin nhóm triterpen hay steroid Định lượng hàm lượng oleanolic acid saponin 2.3 Điều kiện thí nghiệm  Khảo sát ảnh hưởng nồng độ IBA lên tăng trưởng chồi Mẫu chồi tái sinh sau thực xong thí nghiệm 1, chọn mẫu đồng có kích thước cm sử dụng làm vật liệu ban đầu để bố trí thí nghiệm Cấy mẫu vào bình chứa mơi trường có bổ sung nồng độ IBA nồng độ (0; 0,1; 0,5; 1; 2; 2,5 mg/l) Thí nghiệm bố trí theo kiểu CRD, với NT Cấy chồi/bình tam giác, bình tam giác/NT lặp lại lần Các thí nghiệm thực điều kiện sau: chiếu sáng 16 giờ/ngày, cường độ ánh sáng 2.000 lux, nhiệt độ phòng 26 ± 20C; độ ẩm trung bình: 75 - 80% 2.4 Xử lý số liệu Số liệu xử lý chương trình MSTATC 106 Tạp chı́ Khoa học Trường Đại học Cầ n Thơ Phần B: Nông nghiệp, Thủy sản Công nghệ Sinh học: 44 (2016): 104-112 phản ứng tạo bọt giống Đinh lăng nhỏ có bọt bền sau 60 phút, kết trùng khớp với nghiên cứu Bensita et al (1998) Tiếp theo giống Đinh lăng tròn Đinh lăng trổ có bọt bền 30 phút, giống Đinh lăng to Đinh lăng đĩa có bọt bền thấp 15 phút KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Khảo sát hàm lượng saponin giống Đinh lăng ban đầu Từ kết Bảng cho thấy, sau định tính dược chất giống Đinh lăng ban đầu Bảng 2: Kết định tính định lượng hàm lượng saponin giống Đinh lăng ban đầu Định tính Định lượng Phản ứng tạo bọt Phản ứng màu HPLC - UV (cm) (cm) (µg/g) Tên mẫu Đinh lăng to (Polyscias filicifolia (Merr) Baill) Đinh lăng nhỏ (Polyscias fruticosa (L.) Harms) Đinh lăng tròn (Polyscias balfouriana Baill) Đinh lăng trổ (Polycias guilfoylei (Cogn Marche) Baill) Đinh lăng đĩa (Polyscias scutellarius (Burm f) Merr) + Xanh 14,43d +++ Đỏ 77,17a ++ Đỏ 67,33b ++ Đỏ 64,0c + Xanh 80,40a CV (%) = 1,98; Ftính = 1480.70** Ghi chú: +: bọt bền 15 phút; ++: bọt bền 30 phút; +++: bọt bền 60 phút; xanh cây: saponin steroid; đỏ: saponin triterpen thành phố Hồ Chí Minh để thu hái tươi bán thành phẩm lúc có rễ nhỏ 3.2 Nhân nhanh in vitro Sau xác định diện hợp chất saponin có giống Đinh lăng, kết định tính phản ứng màu cho thấy, giống Đinh lăng to Đinh lăng đĩa có màu xanh nên sơ kết luận dược liệu có saponin steroid Ba giống Đinh lăng lại gồm: Đinh lăng nhỏ, Đinh lăng tròn, Đinh lăng trổ có màu đỏ nên sơ kết luận có saponin triterpen Kết trùng khớp với nghiên cứu Bensita et al (1998), qua kiểm tra định lượng từ dược chất mẫu rễ Đinh lăng nhỏ kết luận có diện saponin triterpen  Khảo sát ảnh hưởng nồng độ BAP lên tái sinh chồi Đinh lăng  Theo kết Bảng 3, mơi trường MS có bổ sung nồng độ BAP tăng dần từ 1,2 mg/l; 1,4 mg/l; 1,6 mg/l 1,8 mg/l số chồi, chiều cao chồi trọng lượng chồi tăng theo nồng độ BAP  Môi trường MS có bổ sung mg/l có ảnh hưởng tái sinh chồi Đinh lăng rõ rệt cho khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê, từ đốt thân ban đầu sau tuần nuôi cấy chồi bắt đầu cảm ứng tăng lên 2,8 chồi, trọng lượng chồi đạt 6,10 g, chồi có màu sắc xanh tốt Trong môi trường này, chồi cao đồng so với nghiệm thức lại Ngồi ra, theo ghi nhận cho thấy thời gian (khơng có bảng kết quả) tái sinh chồi nghiệm thức nhanh Kết trùng khớp với nghiên cứu Trần Thị Liên ctv (2005), Đinh lăng mơi trường khống MS + mg/l BAP + 20 g/l đường sinh trưởng mạnh Kết định lượng phương pháp sắc kí lỏng cao áp cho thấy, giống Đinh lăng đĩa có hàm lượng oleanolic acid cao đạt 80,40 µg/g khơng có khác biệt thống kê so với giống Đinh lăng nhỏ đạt 77,17 µg/g, có khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức lại Giống Đinh lăng to có hàm lượng oleanolic acid thấp đạt 14,43 µg/g Như vậy, qua kết thu chọn giống Đinh lăng nhỏ làm nguồn vật liệu ban đầu để khảo sát thí nghiệm Vì giống Đinh lăng nhỏ trồng phổ biến khu vực Củ Chi 107 Tạp chı́ Khoa học Trường Đại học Cầ n Thơ Phần B: Nông nghiệp, Thủy sản Công nghệ Sinh học: 44 (2016): 104-112 Bảng 3: Ảnh hưởng nồng độ BAP lên tái sinh chồi Đinh lăng Nghiệm thức BAP (mg/l) Số chồi Chiều cao chồi (cm) B1 1,2 1,13d 3,35bc cd B2 1,4 1,33 4,63ab 5,33a B3 1,6 1,60c 5,80a B4 1,8 2,20b a 5,95a B5 2,80 d 3,60bc B6 2,5 1,20 e 2,73c B7 0,67 Ftính 54,42** 13,56** CV (%) 10,82 13,37 Trọng lượng chồi (g) 2,73d 3,98c 4,84b 5,05b 6,10a 3,99c 0,83e 2,28* 15,36 Ghi chú: **: khác biệt có ý nghĩa thống kê mức 0,01; *: khác biệt có ý nghĩa thống kê mức 0,05 Trong cột số có chữ theo sau giống khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê  Khảo sát ảnh hưởng nồng độ IBA lên tăng trưởng chồi Đinh lăng chồ i Và số chồi tăng dần nghiê ̣m thức I2 có bổ sung 0,1 mg/l IBA cho số chồi đạt 1,8 chồi Số chồi giảm tăng nồng độ IBA lên cao Ở nghiệm thức có bổ sung 2,5 mg/l IBA cho số chồi thấp, trạng thái chồi kém, có màu vàng, đoạn thân có màu nâu Nguyên nhân hàm lượng chất điều hoà sinh trưởng cao gây ức chế khả phát triển chồi Đinh lăng in vitro Qua kết thí nghiệm ghi nhận ni cấy mơi trường MS có bở sung 0,5 mg/l IBA cho sớ chồ i cao nhấ t đa ̣t 2,27 chồ i có màu xanh non, sinh trưởng khỏe có hình thành rễ tốt Nghiê ̣m thức I1 (đớ i chứng) không bổ sung chấ t điề u hòa sinh trưởng IBA có số chồ i thấ p nhấ t đa ̣t Bảng 4: Ảnh hưởng nồng độ IBA lên tăng trưởng chồi Đinh lăng Nghiệm thức I1 (Đ/C) I2 I3 I4 I5 I6 F tính CV (%) IBA (mg/l) 0,1 0,5 1,0 2,5 Số chồi 1,00b 1,80ab 2,27a 1,50ab 1,47ab 1,27b 3,59 * 25,94 Chiều cao chồi (cm) 1,17d 3,10ab 3,23a 2,80ab 2,17bc 1,60cd 12,26 ** 17,76 Trọng lượng chồi (g) 1,78b 4,37ab 6,27a 4,07ab 2,14b 1,84b 6,74 ** 35,26 Ghi chú: **: khác biệt có ý nghĩa thống kê mức 0,01;*: khác biệt có ý nghĩa thống kê mức 0,05 Trong cột số có chữ theo sau giống khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê Về chiều cao chồi, nghiệm thức I3 có bổ sung 0,5 mg/l IBA cao đạt 3,23 cm Nghiệm thức I1 đối chứng có chiều cao chồi thấp đạt 1,17 cm Ở nghiệm thức có bổ sung 0,1 mg/l IBA lên chiều cao chồi đạt 3,10 cm, tăng nồng độ IBA cao q khơng thích hợp cho phát triển nên chiều cao nghiệm thức I4, nghiệm thức I5 nghiệm thức I6 với nồng độ IBA bổ sung vào mg/l; mg/l 2,5 mg/l phát triển thấp tương ứng chiều cao đạt 2,80 cm; 2,17 cm 1,27 cm Về trọng lượng chồi, Ở nghiệm thức I3 bổ sung 0,5 mg/l IBA trọng lượng chồi cho kết cao đạt 6,27 g Nồng độ chất điều hòa sinh trưởng IBA tăng trọng lượng chồi giảm so với nghiệm thức I3 108 Tạp chı́ Khoa học Trường Đại học Cầ n Thơ Phần B: Nông nghiệp, Thủy sản Công nghệ Sinh học: 44 (2016): 104-112 Hình 1: Sự tăng trưởng chồi Đinh lăng nồng độ IBA khác (A): mg/l IBA; (B): 0,1 mg/l IBA; (C): 0,5 mg/l IBA; (D): mg/l IBA; (E): mg/l IBA; (F): 2,5 mg/l IBA  Khảo sát ảnh hưởng loại nồng độ auxin thích hợp lên tái sinh rễ cao cây, số lá, số rễ, chiều dài rễ, trọng lượng rễ tốt cho khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê so với nghiệm thức nuôi cấy lại Kết Bảng cho thấy nghiệm thức có bổ sung mg/l NAA thu tiêu chiều Bảng 5: Ảnh hưởng loại nồng độ auxin thích hợp lên tái sinh rễ Nghiệm thức 10 11 12 NAA (mg/l) 0,5 F tính CV (%) IBA (mg/l) 0,5 Chiều cao (cm) 7,22ab 8,39a 6,42bc 5,17cdef 4,72def 4,19f 8,07a 6,07bcd 5,97bcde 5,43cdef 4,63ef 4,50f 15,77** 10,35 Chiều dài Chiều dài Số rễ (cm) rễ (cm) abcd bc b 4,97 4,47 19,56 1,67cd a b a 6,28 4,56 45,22 2,86a ab cde a 5,44 3,72 50,56 2,53ab abc de b 5,33 3,61 21,44 2,14bc bcd def bcd 4,11 3,22 12,89 1,69cd cd ef cde 3,89 3,08 6,67 1,41d d a e 3,78 5,83 0,20 0,25e d b e 3,83 4,63 2,61 0,26e bcd bcd de 4,50 3,89 2,84 0,28e bcd ef cde 4,17 3,00 5,83 0,42e d f bc 3,66 2,72 14,2 0,65e d f cde 3,56 2,61 7,17 0,26e 5,35** 22,99** 40,89** 44,42** 14,44 9,09 28,24 20,99 Số Trọng lượng rễ (g) 2,01b 5,12a 4,70a 1,69bc 1,47bc 0,90bc 1,24bc 0,61bc 0,57bc 0,48c 0,42c 0,37c 18,20** 40,41 Ghi chú: **: khác biệt có ý nghĩa thống kê mức 0,01 Trong cột số có chữ theo sau giống khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê 109 Tạp chı́ Khoa học Trường Đại học Cầ n Thơ Phần B: Nông nghiệp, Thủy sản Công nghệ Sinh học: 44 (2016): 104-112 Kết đề tài trùng khớp với Santos et al (2007), mơi trường khống MS có bổ sung mg/l NAA cho số rễ chiều dài rễ tốt nhất; thí nghiệm khơng sử dụng than hoạt tính kết đề tài giống so với kết nghiên cứu Trần Thị Liên ctv (2005), mơi trường khống MS + mg/l NAA + 20 g/l đường + 0,5 g than hoạt tính tạo rễ tốt Ở nghiệm thức sử dụng chất điều hòa sinh trưởng thực vật IBA kết khơng trùng khớp so với kết nghiên cứu Trần Thị Liên ctv (2005) mơi trường MS có bổ sung mg/l IBA kết hợp 0,5 g than hoạt tính mơi trường thích hợp cho q trình tạo rễ in vitro, giải thích điều kiện địa lý vùng lấy mẫu, thời gian lấy mẫu thí nghiệm tác giả có bổ sung thêm than hoạt tính Hình 2: Cây Đinh lăng in vitro nồng độ auxin khác (A): NAA 0,5 mg/l; (B): NAA mg/l; (C): IBA 0,5 mg/l; (D): IBA mg/l  Khảo sát tỷ lệ sống Đinh lăng in vitro giai đoạn vườn ươm điều cho thấy in vitro có chứa hợp chất saponin Kết phù hợp với nghiên cứu tác giả Nguyễn Trần Châu Đỗ Mai Anh ctv (2007), nguồn nguyên liệu mẫu thu hái từ Đinh lăng nhỏ năm tuổi nuôi trồng phương pháp tự nhiên nguồn mẫu từ phương pháp nuôi cấy mô thực vật bảo tồn đặc tính ban đầu tự nhiên Các Đinh lăng in vitro có rễ phát triển đầy đủ, rễ khỏe, cao từ – cm đem trồng điều kiện vườn ươm Kết ghi nhận sau tuần trồng cho thấy, có 90% Đinh lăng phát triển bình thường Cây sinh trưởng tốt, hình dạng sinh trưởng bình thường, khơng có biến dị hình thái 3.3 Xác định hàm lượng saponin Đinh lăng in vitro Kết định tính phản ứng màu cho thấy, Đinh lăng nhỏ in vitro có màu đỏ nên sơ kết luận dược chất có saponin triterpen Và định lượng phương pháp sắc kí lỏng cao áp hàm lượng oleanolic acid trung bình đạt 14,7 µg/g giai đoạn tháng tuổi Kết Bảng nhận thấy, phương pháp định tính phản ứng tạo bọt mẫu Đinh lăng nhỏ in vitro có bọt bền 15 phút với chiều cao cm, 110 Tạp chı́ Khoa học Trường Đại học Cầ n Thơ Phần B: Nông nghiệp, Thủy sản Công nghệ Sinh học: 44 (2016): 104-112 Bảng 6: Khảo sát hàm lượng saponin giống Đinh lăng nhỏ in vitro Định tính Phản ứng tạo bọt Phản ứng màu (cm) (cm) Tên mẫu Đinh lăng nhỏ (Polyscias fruticosa (L.) Harms) + Định lượng HPLC - UV (µg/g) Đỏ 14,7 Ghi chú: +: bọt bền 15 phút; xanh cây: saponin steroid; đỏ: saponin triterpen phương pháp nhân giống in vitro rút kết luận sau: KẾT LUẬN Qua nghiên cứu xây dựng quy trình nhân nhanh Đinh lăng có hàm lượng saponin cao Mẫu Đinh lăng thực sinh Phản ứng tạo bọt, phản ứng tạo màu định lượng phương pháp HPLC Đinh lăng nhỏ có hàm lượng saponin cao tuần Đốt thân chứa mầm ngủ, dài cm Vô mẫu Đinh lăng HgCl 1/%o + phút MS + mg/l BAP + 30 g/l đường + 10 g/l agar tuần Tái sinh chồi MS + mg/l BAP + 0,5 mg/l IBA + 30 g/l đường + 10 g/l agar tuần Tăng sinh chồi tuần MS + mg/l NAA + 30 g/l đường + 10 g/l agar Ra rễ tạo hoàn chỉnh tuần Cây Đinh lăng cao - cm, - rễ, - cành Giai đoạn vườn ươm hàm lượng saponin Đinh lăng in vitro 111 Tạp chı́ Khoa học Trường Đại học Cầ n Thơ Phần B: Nông nghiệp, Thủy sản Công nghệ Sinh học: 44 (2016): 104-112 Nguyễn Trần Châu Đỗ Mai Anh Nguyễn Phương Dung, 2007 Nghiên cứu số tác dụng dược lý thực nghiệm sản phẩm nuôi cấy mô từ Đinh lăng Polyscias fruticosa L Harms họ Araliaceae Tạp chí Nghiên cứu Y học – Khoa Y học Cổ truyền – Đại học Y dược Tp.HCM, tập 11, số 2, trang 126-131 Santos, R.C., Gimenez M.D.G., Rodriguez M.T.S and Vazquez, R.P., 2007 Antihistaminic and antieicosanoid effects of oleanolic and ursolic acid fraction from Helichrysum picardii Pharmazie 62, page 459-462 Trần Thị Liên, Nguyễn Văn Thuận Đoàn Thị Thanh Nhàn, 2005 Nghiên cứu nhân nhanh Đinh lăng Polyscias fruticosa L Harms Tạp chí nơng nghiệp phát triển nông thôn, kỳ 2, tháng Vo., D.H., Yamamura, S., Ohtani, K., Kasai, R., Yamasaki, K., Nham, N.T , Chau, H.M., 1998 Oleane saponins from Polyscias fruticosa L Harms Phytochemistry 47, page 451-457 TÀI LIỆU THAM KHẢO Bensita, M., Bernard, N.P., Venkataswamy R., and Divakar, C.M., 1998 Deparment of pharmacognosy, college of pharmacy, sri Ramakrishna institute of paramedical sdience Coimbatore Vol No18 (2), pages 165-172 Bensita, M.B., Nilani, P., and Sandhya, S.M., 1999 Studies on the adaptogenic and antibacterial properties of Polyscias fruticosa L Harms Ancient Science of life, January & April, page 231-246 Chaboud, A., Rougny, A., Proliac, A., Raynaud, J., Cabalion, P., 1995 A new triterpenoid saponin from Polyscias fruticosa, Fr Pharmazie, 50 (5), page 371-379 Lutomski, J., Luan, T C., Hoa, T.T., 1992 Polyacetylenes in the Araliaceae family, Part IV The antibacterial and antifungial activities of two main polyacetylenes from Panax vietnamensis Ha et Grushv and Polyscias fruticosa (L.) Harms Herba Pol.38, page 137-140 112 ... cứu xây dựng quy trình nhân nhanh Đinh lăng có hàm lượng saponin cao Mẫu Đinh lăng thực sinh Phản ứng tạo bọt, phản ứng tạo màu định lượng phương pháp HPLC Đinh lăng nhỏ có hàm lượng saponin cao. .. giống Đinh lăng to Đinh lăng đĩa có màu xanh nên sơ kết luận dược liệu có saponin steroid Ba giống Đinh lăng lại gồm: Đinh lăng nhỏ, Đinh lăng tròn, Đinh lăng trổ có màu đỏ nên sơ kết luận có saponin. .. Xây dựng quy trình nhân nhanh Đinh lăng có hàm lượng saponin cao phương pháp in vitro cho hệ số nhân chồi cao, chất lượng tốt, tiền đề cho nghiên cứu sâu Đinh lăng số dược liệu khác  Có thể ứng