2.6.1 Vài nét về chi Keo (Acacia)
2.6.1.1 Đặc điểm sinh học của các loài Keo
Chi Keo (Acacia) là một chi của một số loài cây thân bụi và thân gỗ có nguồn gốc tại đại lục cổ Gondwana, thuộc phân họ Trinh nữ (Mimosoideae) thuộc họ Đậu (Fabaceae), lần đầu tiên đƣợc nhà nghiên cứu Linnaeus miêu tả năm 1773 tại châu Phi. Hiện nay, ngƣời ta biết có khoảng 1300 loài cây Keo trên toàn thế giới, trong đó khoảng 950 loài có nguồn gốc ở Australia, và phần còn lại phổ biến trong các khu vực khô của vùng nhiệt đới và ôn đới ấm ở cả hai bán cầu nhƣ: châu Phi, miền nam châu Á, châu Mỹ. Tuy nhiên, chi Acacia không phải là chi đơn ngành mà đƣợc chia tách Acacia thành 5 chi mới (http://vi.wikipedia.org/wiki/Chi_Keo).
Loài sinh trƣởng xa nhất về phía bắc của chi này là Acacia greggii (Keo vuốt mèo), đạt tới 37°10' vĩ bắc ở miền nam Utah, Hoa Kỳ. Loài sinh trƣởng xa nhất về phía nam là Acacia dealbata (Keo bạc), Acacia longifolia (Keo bờ biển hay Keo
vàng Sydney), Acacia mearnsii (Keo đen) và Acacia melanoxylon (Keo gỗ đen), đạt tới 43°30' vĩ nam ở Tasmania, Australia, trong khi Acacia caven đạt tới vĩ độ tƣơng tự nhƣ thế về phía nam, tại khu vực đông bắc tỉnh Chubut, Argentina. Trong tiếng Anh, các loài ở Australia gọi chung là wattle (cây Keo Öc), còn các loài châu Phi và châu Mỹ gọi chung là acacia (cây Keo) (Bùi Việt Hải,1998).
Lá của các loài Keo nói chung là loại lá hình lông chim phức. Tuy nhiên, ở một số loài đặc biệt ở Australia và các đảo trên Thái Bình Dƣơng thì các lá chét bị triệt tiêu và các cuống lá có dạng phẳng và bẹt, hƣớng lên trên, có tác dụng giống nhƣ lá; chúng đƣợc gọi là cuống dạng lá. Hƣớng thẳng đứng của các cuống dạng lá bảo vệ cho các loài cây này không bị quá nóng do ánh sáng dữ dội của Mặt Trời, do chúng chắn ít ánh sáng hơn so với các lá cây nằm ngang. Một số loài (chẳng hạn
Acacia glaucoptera) thiếu cả lá lẫn cuống dạng lá, nhƣng có cành dạng lá, là một
phần của thân cây đã biến đổi thành dạng tƣơng tự nhƣ lá để có chức năng quang hợp.
Hình 2.4: Hình thái lá các loài Keo(Acacia)
Các hoa nhỏ có 5 cánh hoa rất nhỏ, gần nhƣ ẩn kín trong các nhị hoa dài và đƣợc phân bổ trong các cụm hoa dày dặc dạng hình cầu hay hình trụ; chúng có màu
vàng hay màu kem ở một số loài, một số loài khác thì màu hơi trắng hay thậm chí là tía (chẳng hạn Acacia purpureapetala) hoặc đỏ (trong loài đƣợc trồng gần đây Acacia leprosa).
Các loài thƣờng có gai, đặc biệt ở các loài sinh trƣởng trong khu vực khô cằn. Chúng thƣờng là các cành bị ngắn đi, cứng và sắc, hoặc đôi khi là lá kèm dạng lá biến hóa thành. Ví dụ nhƣ: Acacia armata là cây gai Kangaroo ở Australia, Acacia giraffa (http://vi.wikipedia.org/wiki/Chi_Keo).
Hình2.5:Hình thái một số loài Keo A) Keo tuyến sóng, sóng rắn
B) Keo tai tƣợng
C) Keo bình linh,Keo dậu D) Keo lá tròn, Mimosa Đà Lạt
Thần thoại Ai Cập đã gắn loài Keo (Acacia) với các đặc trƣng của cây của sự sống do nhiều loài trong chi Acacia chứa một số loại ancaloit có các tác động tới thần kinh, trong đó DMT và NMT là nổi bật và có ích nhất. Lá, thân và/hoặc rễ có thể ủ với một số thực vật chứa MAOI để thu đƣợc chất có tác dụng ảnh hƣởng đến tuổi thọ khi uống. Vỏ cây Acacia arabica đƣợc coi là phƣơng thuốc có ích trong điều trị việc xuất tinh sớm.(http://vi.wikipedia.org/w/index)
Trong công nghiệp, cây Keo đƣợc ứng dụng trong công nghệ thuộc da, làm chất cao su (catechu), làm chất làm se.Cung cấp các loại gỗ có giá trị để làm đồ gỗ nội thất và có độ bóng cao (Acacia melanoxylon-Keo gỗ đen, hay Acacia homalophylla..).Ngoài ra một số loại Keo đƣợc dùng để sản xuất nƣớc hoa nhƣ Acacia farnesiana bởi nó có mùi thơm rất mạnh.
Vỏ các loài Keo khác nhau rất giàu tanin và là một mặt hàng xuất khẩu quan trọng; các loài có giá trị lớn nhất trong ứng dụng này là Acacia pycnantha (Keo
vàng), Acacia decurrens (Keo vỏ dà), Acacia dealbata (Keo bạc) và Acacia mearnsii (Keo đen).
Gỗ Keo đƣợc sử dụng trong sản xuất hộp đựng pháp điển của ngƣời Do Thái- một biểu tƣợng tinh thần, và còn là một trong những biểu tƣợng có quyền lực nhất trong Hội Tam Điểm, thể hiện linh hồn của Thƣợng Đế và sự tinh khiết của tâm hồn.
Một số loài đƣợc sử dụng nhƣ là các loại cây cảnh; phổ biến nhất là Acacia
dealbata (Keo bạc) có các lá từ màu lục xám tới màu bạc và các hoa màu vàng
sáng; nó đôi khi còn bị gọi sai thành "trinh nữ" (mimosa) tại một số khu vực có trồng, bởi sự nhầm lẫn với cây trinh nữ thực thụ thuộc chi Mimosa
Trong văn hóa ẩm thực, hạt của một số loài Keo đƣợc dùng làm thực phẩm và các một loạt các sản phẩm khác trong ẩm thực. Ví dụ, hạt của Acacia niopo
đƣợc nƣớng và dùng nhƣ là thuốc hít tại Nam Mỹ. Tại Lào và Thái Lan, các loại rễ của Acacia pennata (gọi là cha-om) đƣợc sử dụng trong súp, cà ri, trứng ốp lết hay các món xào.
Tại Việt Nam, các loài cây Keo tai tƣợng (Acacia mangium) và Keo lá tràm (Acacia auriculiformis) đƣợc trồng để làm nguyên liệu sản xuất giấy, cải tạo vƣờn rừng.
Bảng 2.4:Các ancaloit trong các loài Keo (Alexander Shulgin. TiHKAL)
Loài Hoạt chất ancaloit Bộ phận chứa hoạt chất
của cây
A. baileyana 0,02%tryptamin và β-cacbolin Lá
A. maidenii DMT và NMT Cuống lá (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
A. albida DMT Lá
A. confusa DMT và NMT Lá, cuống lá và vỏ cây
A. cultriformis Tryptamin Lá và cuống lá
A. laeta DMT Lá A. mellifera DMT Lá A. nilotica DMT Lá A. phlebophylla DMT Lá A. podalyriaefolia tryptamin Lá A. senegal DMT Lá A. seyal DMT Lá A. sieberiana DMT Lá
A. simplicifolia DMT và NMT Lá, cuống lá, vỏ thân cây
A. vestita Tryptamin Lá và cuống lá
2.6.2 Vài nét về cây Keo lá tràm (Acacia auriculiformis A. Cunn ex Benth) Benth)
Tên Việt Nam hay tên địa phƣơng thƣờng gọi là Keo lá tràm hoặc Tràm bông vàng. Tên khoa học: Acacia auriculiformis A. Cunn ex Benth, thuộc họ phụ Mimosoideae, họ Leguminosae.
Theo báo cáo của Tổ chức nghiên cứu Lâm nghiệp của Liên hiệp quốc (IUFRO) tại hội thảo triển khai cho châu Á (Sri Lanka, 1984) thì cây Keo lá tràm là một trong số những loài rất chủ yếu cạnh các loài khác nhƣ Eucalyptus carnaldulensis,Leucaena leucocephala, Acacia mangium và Bamboos đƣợc giới thiệu để trồng rừng thâm canh ở các vùng đất thấp của khu vực nhiệt đới ẩm. Keo lá tràm đƣợc biết đến ở ngoài nơi phân bố tự nhiên của nó nhƣ là một loài có khả năng thích ứng nhất trong số những cây trồng rừng ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới ẩm.
Hình 2.6. Keo lá tràm
2.6.2.1 Các đặc điểm sinh học và sinh thái
Hình thái
Keo lá tràm là loại cây gỗ nhỏ đến trung bình, thƣờng chỉ cao 8-20m, ở địa phận thuận lợi có thể cao 25 đến 30m, đƣờng kính 80cm với đoạn thẳng dài,cành
nhỏ, dễ trồng bằng hạt, sống lâu, có khả năng cố định đạm và tự tỉa cành tốt (Hƣớng dẫn kỹ thuật trồng rừng Keo lá tràm-Sở nông nghiệp và phát triển nông thôn Thanh Hóa). Có thể sinh trƣởng trên nhiều loại đất, kể cả đất nghèo kiệt, thoát nƣớc kém. Cây mọc nhanh, tốc độ sinh trƣởng cao trong vài năm đầu. Song, trên một nơi nếu trồng nhiều chu kì liên tục có thể dẫn tới nghèo Kali và Mg trong đất. Gỗ giác màu vàng, gỗ lõi màu nâu sẫm, tỷ tỵong cơ bản (độ ẩm 12%) là từ 0.5 đến 0.65, hiệu suất bột giấy 49%, sợi dài 0.85mm, nhiệt trị 4700-4900kcal/kg, dùng làm trụ mỏ, nguyên liệu bột giấy (giấy gói), ván dăm, thân cành làm củi tốt do nhiệt lƣợng của than cao. Trong lâm sinh dùng làm cây trồng phù trợ cải tạo đất, che bóng. Ở miền Nam gỗ Keo lá tràm đƣợc gọi là gỗ cẩm lai giả, thích hợp cho chế tác đồ mộc (Bùi Việt Hải, 1998)
Lá của loài Keo lá tràm là loại lá chét hình lông chim phức, lá giả dài 10- 16cm, rộng 1.5-2.5 cm và có 3 gân chính. Khi hạt nảy mầm, hai lá đầu tiên đại diện cho bộ trinh nữ, các lá về sau thì giống lá tràm nên đƣợc gọi là Keo lá tràm.
Cây có nhiều cành nhánh và thân thƣờng cong. Vỏ cây màu xám hoặc nâu, khi nhỏ tuổi cây có vỏ nhẵn song khi càng nhiều tuổi vỏ cây càng thô.quả. Quả khô hình xoắn , khi chín tự nứt để phát tán hạt. Hạt nhỏ, màu nâu đen.
Phân bố
Cây Keo lá tràm phân bố tự nhiên ở ven biển Indonesia, vùng sa mạc nửa khô hạn Papua New Guinea, ở trung tâm và đông bắc Australia. Phạm vi phan bố nằm ở các vĩ độ 5-170 độ Nam, độ cao phân bố có thể lên đến 400m nhƣng thƣờng phổ biến ở độ cao dƣới 100m. Keo lá tràm thƣờng gặp ở vùng khí hậu nóng ẩm tới cận ẩm, nhiệt độ bình quân 22-240oC, lƣợng mƣa thay đổi từ 760mm-2000mm, nơi không có băng giá và sƣơng muối.
Tại những nơi đất bazan, lƣợng mƣa 2000mm, sau 11năm chiều cao của cây có thể đạt 13.7m và chu vi thân cây đạt từ 1.3m đến 70cm ( Kushalapa,1992).
Keo lá tràm có biên độ sinh thái rát rộng, có khả năng thích nghi với điều kiện sinh thái tƣơng đối khắc nghiệt (nóng và khô hạn), chịu đƣợc đất nghèo dinh dƣỡng, tầng đất mỏng.
Có khả năng sinh trƣởng trên nhiều loại đất khác nhau nhƣ: đất sét, đất podson, đất laterit và ngay cả trên những vùng đất khô hay đụn cát cố định, pH từ 3-9, lƣợng mƣa từ 200-1700mm. Keo lá tràm có thể đƣợc xếp vào cây ƣa sáng hoàn toàn.
Các đặc trưng lâm học
Keo lá tràm là một trong số những loài cây có khả năng thích nghi cao, sinh trƣởng nhanh, ổn định. Keo lá tràm có khả năng cố định đạm và thích ứng rộng với các điều kiện khác nhau. Nó không những có thể tồn tại và sinh trƣởng tốt ở những vùng có mùa khô kéo dài mà cả ở những vùng có lƣơng mƣa hàng năm lên đến 6000mm (Bùi Việt Hải).
Và mặc dù phân bố tự nhiên ở độ cao dƣới 400m nhƣng trồng đƣợc ở những độ cao lớn hơn. Ví dụ: ở Zimbabue (1.100-1.200 m) và Uganda (1.200-1.500 m).
Keo lá tràm là loài cây có khả năng sinh trƣởng nhanh, tăng trƣởng chiều cao trong những năm đầu có thể đạt 2-3m mỗi năm. Tại Việt Nam trên các thực địa thích hợp, chiều cao cây đạt ở 10-12 năm tuổi có thể lên đến 25-30m, đƣờng kính 15-20m (xếp sau A.mangium và A.crassicarpa).
2.6.2.2 Công dụng và tiềm năng gây trồng
Công dụng chính của Keo lá tràm là cung cấp gỗ chất lƣợng tốt cho nhiều mục đích khác nhau nhƣ dùng làm nguyên liệu sản xuất giấy, dùng để chế tác hàng thủ công mỹ nghệ, làm củi than đốt rất tốt. Gỗ có tỷ trọng cao, chứa 59% cellulose, 24% lignin, 19% pentosan và giá trị nhiệt lƣợng đạt 4.800-4.900 kcal/kg. Keo lá tràm có khả năng cải tạo đất trồng nên thƣờng đƣợc gây trồng rộng rãi.
Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện 3.1.1 Thời gian thực hiện 3.1.1 Thời gian thực hiện
Đề tài đƣợc thực hiện từ 03/2007 đến 08/2007 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.1.2 Địa điểm thực hiện
Mẫu lá các dòng Keo lá tràm đƣợc thu thập tại Trạm thực nghiệm lâm nghiệp Bàu Bàng(Tỉnh Bình Dƣơng ) của Viện khoa học lâm nghiệp Việt Nam.
Mẫu lá đƣợc phân tích tại Phân viện Nghiên cứu khoa học kĩ thuật lâm nghiệp Nam Bộ và Trung tâm Công nghệ sinh học TP.Hồ Chí Minh.
3.2 Vật liệu thí nghiệm
Thu thập các dòng Keo lá tràm khác nhau (xem phụ lục).
Cách lấy mẫu: Mẫu lá tƣơi đƣợc lấy tại rừng trên những cây có đánh dấu số dòng khác nhau, cho vào túi nylon, đánh dấu mẫu và đƣa về trữ trong tủ lạnh để tiến hành ly trích DNA.
Nguyên tắc thu thập mẫu: Thu thập lá non của các dòng Keo lá tràm có kí số khác nhau.
3.3 Phƣơng pháp thí nghiệm
Trên cơ sở của các thông tin thu thập trong và ngoài nƣớc, chỉ thị phân tử SSR(Microsatellite) đƣợc chọn để sử dụng trong nghiên cứu này do bởi :
Chỉ thị này xuất hiện rải rác trên genome của sinh vật và cho độ đa hình lớn. Chỉ thị đồng trội nên dễ phát hiện.
Đơn giản nhƣng cho hiệu quả phân tích cao
Ngoài ra, theo một số nghiên cứu kết quả do SSRs mang lại khi phân tích các loài Keo cho kết quả phân tích cao hơn và có tính chính xác cao hơn so với những chỉ thị phân tử khác. Ví dụ : hiệu quả cao hơn RAPD khoảng 7lần (Kraic và cộng tác viên, 1998) và cao hơn 3lần so với RFLP (Butcher và cộng tác viên, 2000).
3.4 Thiết bị và dụng cụ
Chày và cối (Đức).
Bình và khay đựng Nitơ lỏng. Cân điện tử (Ohaus - Mỹ). Bồn ủ nhiệt (Memmert-Anh). Tủ lạnh 4oC và -20oC.
Máy Vortex (IKA - Đức).
Máy hút và tủ cấy vô trùng (Việt Nam /Anh). Máy vi ly tâm lạnh (Hettich - Đức).
Nồi hấp Autoclave (ToMy - Nhật Bản). Lò Viba (Electrolux).
Tủ sấy (Jencons-Anh). Máy điện di (Biorad).
Máy chụp ảnh DNA (Biorad - Thụy Điển). Đầu típ các loại (Đức).
Pipet các loại (Nichiryo – Nhật Bản). Máy PCR (BioRad – Thụy Điển). Tủ lạnh các loại (Sanyo - Nhật Bản). Eppendorf các loại(Pháp).
3.5 Ly trích DNA 3.5.1 Hóa chất
Các hóa chất sử dụng trong thí nghiệm đƣợc liệt kê trong Bảng 3.1
Bảng 3.1: Các hóa chất sử dụng trong quá trình ly trích DNA
HÓA CHẤT CÔNG DỤNG CÁCH PHA
CTAB(C19H42NBr) (M=364,5 g/mol)
Phá vỡ màng tế bào, màng nhân
Hòa tan trong nƣớc cất 2 lần ở 65o
C
Ethanol 80% Rửa DNA Pha với tỷ lệ 7 thể tích (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
ethanol 100% và 3 thể tích nƣớc cất 2 lần đã hấp tiệt trùng
Nitơ lỏng Giúp nghiền mẫu nhanh Dung dịch gốc Chloroform Biến tính protein và các
sắc tố có trong mẫu. Tách lớp sau khi ly tâm
Dung dịch gốc
TE 10X Ổn định DNA
Hòa tan DNA
Pha 100ml: 10ml Tris-HCl 1M + 2ml EDTA 0,5M + 88ml nƣớc cất 2 lần. Hấp 121oC/20 phút trƣớc khi dùng.
Mercapto Ethanol Bảo vệ DNA Dung dịch gốc
EB(Extraction Buffer) Dung dịch ly trích Pha 100ml:
900µl CTAB (lắc nhẹ trong bồn ủ 65oC cho tan, hạn chế tạo bọt).
Bổ sung 6 µl Mercaptro Ethanol.
Bọc giấy bạc, trữ ở 4oC, tránh ánh sáng trực tiếp. Isopropanol Tủa DNA ở nhiệt độ
thấp, không cần muối Sodium Acetate
3.5.2 Quy trình ly trích DNA
DNA trong mẫu lá Keo đƣợc ly trích theo quy trình mô tả bởi Butcher và cộng sự (sơ đồ 3.1).
Sơ đồ 3.1: Quá trình ly trích mẫu DNA 0.2g lá Keo non
Bổ sung 500 μl Chloroform đảo đều
o Nghiền mẫu trong Nitơ lỏng(-196o ) o Bổ sung 900 μl CTAB(65o) o Ủ trong 45-60 phút (65o) o Bổ sung 6 μl mercaptoethanol
Ly tâm 13000vòng trong 8 phút.Thu dịch nổi
Bổ sung 500 μl Phenol+ Chloroform (v/v=1:1).Đảo đều
Ly tâm 13000vòng trong 8 phút.Thu dịch nổi
Bổ sung 200 μl CTAB tủa, đảo đều trong 5 phút +500 μl Phenol+ Chloroform(v/v=1:1).Đảo đều
Tủa DNA trong 600 μl Isopropanol lạnh, ly tâm lạnh ở 4oC(13000 vòng trong 15 phút).Thu tủa.
Rửa bằng 500 μl ethalnol (80%), ly tâm lạnh ở 4o
(13000 vòng trong 15 phút), thu tủa, phơi khô ở nhiệt độ phòng
3.5.3 Kiểm tra sản phẩm DNA ly trích
Mẫu DNA ly trích đƣợc điện di trên gel Agarose1.5%, trong dung dịch đệm 1X TBE ở hiệu điện thế 60 V, cƣờng độ dòng điện 400 mA trong 60phút.
Sau khi chạy điện di xong, ngâm gel trong hỗn hợp Ethidium Bromide 0,5 g/ml và TAE 0,5X trong 15phút. Gel sau khi nhuộm đƣợc rửa nhẹ với TAE 0,5X và đƣa vào máy chụp ảnh DNA. Dƣới tia UV, Ethidium Bromide đã liên kết với sợi đôi DNA sẽ phát quang và tạo thành các band trên gel.
3.6 Thực hiện kỹ thuật SSR
Hóa chất dùng trong phản ứng PCR: PCR buffer (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
MgCl2 . dNTP’s.
Taq DNA polymerase.
Primer.
DNA mẫu (ly trích từ lá Keo).
H2O cất chạy PCR.
3.6.1 Qui trình phản ứng PCR
Phản ứng PCR với cặp primer đã lựa chọn
Thành phần Thể tích sử dụng Nồng độ đầu Nồng độ cuối
HN buffer 2,5 μl 10X 1X
MgCl2 0,75μl 50mM 1.5mM
dNTPs 0,2μl 25mM 0,2mM
Primer forward 0.5μl 10 μmol/ μl 0,2 μmol/ μl Primer reverse 0.5μl 10 μmol/ μl 0,2 μmol/ μl
DNA mẫu 0.5μl
H2O cất 19,85μl Tổng thể tích: 25µ
Bảng 3.2: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR