Thu thập các dòng Keo lá tràm khác nhau (xem phụ lục).
Cách lấy mẫu: Mẫu lá tƣơi đƣợc lấy tại rừng trên những cây có đánh dấu số dòng khác nhau, cho vào túi nylon, đánh dấu mẫu và đƣa về trữ trong tủ lạnh để tiến hành ly trích DNA.
Nguyên tắc thu thập mẫu: Thu thập lá non của các dòng Keo lá tràm có kí số khác nhau.
3.3 Phƣơng pháp thí nghiệm
Trên cơ sở của các thông tin thu thập trong và ngoài nƣớc, chỉ thị phân tử SSR(Microsatellite) đƣợc chọn để sử dụng trong nghiên cứu này do bởi :
Chỉ thị này xuất hiện rải rác trên genome của sinh vật và cho độ đa hình lớn. Chỉ thị đồng trội nên dễ phát hiện.
Đơn giản nhƣng cho hiệu quả phân tích cao
Ngoài ra, theo một số nghiên cứu kết quả do SSRs mang lại khi phân tích các loài Keo cho kết quả phân tích cao hơn và có tính chính xác cao hơn so với những chỉ thị phân tử khác. Ví dụ : hiệu quả cao hơn RAPD khoảng 7lần (Kraic và cộng tác viên, 1998) và cao hơn 3lần so với RFLP (Butcher và cộng tác viên, 2000).
3.4 Thiết bị và dụng cụ
Chày và cối (Đức).
Bình và khay đựng Nitơ lỏng. Cân điện tử (Ohaus - Mỹ). Bồn ủ nhiệt (Memmert-Anh). Tủ lạnh 4oC và -20oC.
Máy Vortex (IKA - Đức).
Máy hút và tủ cấy vô trùng (Việt Nam /Anh). Máy vi ly tâm lạnh (Hettich - Đức).
Nồi hấp Autoclave (ToMy - Nhật Bản). Lò Viba (Electrolux).
Tủ sấy (Jencons-Anh). Máy điện di (Biorad).
Máy chụp ảnh DNA (Biorad - Thụy Điển). Đầu típ các loại (Đức).
Pipet các loại (Nichiryo – Nhật Bản). Máy PCR (BioRad – Thụy Điển). Tủ lạnh các loại (Sanyo - Nhật Bản). Eppendorf các loại(Pháp).
3.5 Ly trích DNA 3.5.1 Hóa chất
Các hóa chất sử dụng trong thí nghiệm đƣợc liệt kê trong Bảng 3.1
Bảng 3.1: Các hóa chất sử dụng trong quá trình ly trích DNA
HÓA CHẤT CÔNG DỤNG CÁCH PHA
CTAB(C19H42NBr) (M=364,5 g/mol)
Phá vỡ màng tế bào, màng nhân
Hòa tan trong nƣớc cất 2 lần ở 65o
C
Ethanol 80% Rửa DNA Pha với tỷ lệ 7 thể tích
ethanol 100% và 3 thể tích nƣớc cất 2 lần đã hấp tiệt trùng
Nitơ lỏng Giúp nghiền mẫu nhanh Dung dịch gốc Chloroform Biến tính protein và các
sắc tố có trong mẫu. Tách lớp sau khi ly tâm
Dung dịch gốc
TE 10X Ổn định DNA
Hòa tan DNA
Pha 100ml: 10ml Tris-HCl 1M + 2ml EDTA 0,5M + 88ml nƣớc cất 2 lần. Hấp 121oC/20 phút trƣớc khi dùng.
Mercapto Ethanol Bảo vệ DNA Dung dịch gốc
EB(Extraction Buffer) Dung dịch ly trích Pha 100ml:
900µl CTAB (lắc nhẹ trong bồn ủ 65oC cho tan, hạn chế tạo bọt).
Bổ sung 6 µl Mercaptro Ethanol.
Bọc giấy bạc, trữ ở 4oC, tránh ánh sáng trực tiếp. Isopropanol Tủa DNA ở nhiệt độ
thấp, không cần muối Sodium Acetate
3.5.2 Quy trình ly trích DNA
DNA trong mẫu lá Keo đƣợc ly trích theo quy trình mô tả bởi Butcher và cộng sự (sơ đồ 3.1).
Sơ đồ 3.1: Quá trình ly trích mẫu DNA 0.2g lá Keo non
Bổ sung 500 μl Chloroform đảo đều
o Nghiền mẫu trong Nitơ lỏng(-196o ) o Bổ sung 900 μl CTAB(65o) o Ủ trong 45-60 phút (65o) o Bổ sung 6 μl mercaptoethanol
Ly tâm 13000vòng trong 8 phút.Thu dịch nổi
Bổ sung 500 μl Phenol+ Chloroform (v/v=1:1).Đảo đều
Ly tâm 13000vòng trong 8 phút.Thu dịch nổi
Bổ sung 200 μl CTAB tủa, đảo đều trong 5 phút +500 μl Phenol+ Chloroform(v/v=1:1).Đảo đều
Tủa DNA trong 600 μl Isopropanol lạnh, ly tâm lạnh ở 4oC(13000 vòng trong 15 phút).Thu tủa.
Rửa bằng 500 μl ethalnol (80%), ly tâm lạnh ở 4o
(13000 vòng trong 15 phút), thu tủa, phơi khô ở nhiệt độ phòng