PHÂN BIỆT CÁC LOẠI THỊT HEO, BÕ, CỪU BẰNG PHƢƠNG PHÁP MULTIPLEX PCR

PHÂN BIỆT CÁC LOẠI THỊT HEO, BÕ, CỪU BẰNG PHƢƠNG PHÁP MULTIPLEX PCR

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN BIỆT CÁC LOẠI THỊT HEO, BÕ, CỪU BẰNG PHƢƠNG PHÁP MULTIPLEX PCR Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Khóa: 2003 – 2007 Sinh viên thực hiện: TRỊNH THỊ THANH HUYỀN Thành phố Hồ Chí Minh 09/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN BIỆT CÁC LOẠI THỊT HEO, BÕ, CỪU BẰNG PHƢƠNG PHÁP MULTIPLEX PCR Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: PGS. TS. NGUYỄN NGỌC TUÂN TRỊNH THỊ THANH HUYỀN KS. LƢƠNG QUÝ PHƢƠNG Thành phố Hồ Chí Minh 09/2007 iii LỜI CẢM ƠN Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến: Thầy PGS.TS. Nguyễn Ngọc Tuân, Giảng viên khoa Chăn nuôi thú y, trƣờng Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Cô PGS.TS Trần Thị Dân, Giảng viên khoa Chăn nuôi thú y, trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh. KS. Lƣơng Quý Phƣơng, Trung tâm Phân tích thí nghiệm hóa sinh trƣờng Đại Học Nông Lâm Đã tận tình hƣớng dẫn, ủng hộ và giúp đỡ tôi thực hiện và hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp. Xin chân thành cảm ơn: - Ban Giám Hiệu trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, Ban Chủ Nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt những kiến thức quý báu cho tôi trong suốt thời gian học tại trƣờng. - Ban giám đốc, thầy cô và các cán bộ công chức Trung tâm phân tích thí nghiệm hóa sinh trƣờng Đại Học Nông Lâm, đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực tập và hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp . - Thầy Đinh Xuân Phát đã nhiệt tình giúp đỡ, động viên tôi trong quá trình học tập cũng nhƣ thực hiện khóa luận. Tập thể các bạn sinh viên lớp Công nghệ sinh học 29 - Trƣờng Đại học Nông Lâm TP. HCM đã luôn bên tôi những lúc khó khăn, cùng tôi chia sẻ vui buồn trong quá trình học và quá trình thực hiện khóa luận. Và đặc biệt con xin thành kính ghi ơn Cha Mẹ đã sinh thành, dƣỡng dục con nên ngƣời, để con đƣợc nhƣ ngày hôm nay. Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 09 năm 2007. Sinh viên: Trịnh Thị Thanh Huyền. TÓM TẮT KHÓA LUẬN TRỊNH THỊ THANH HUYỀN, thực hiện khóa luận “Phân biệt ba loại thịt heo, bò cừu bằng phƣơng pháp multiplex PCR”. Hƣớng dẫn khoa học: PGS. TS. Nguyễn Ngọc Tuân KS. Lƣơng Quý Phƣơng Thời gian thực hiện từ tháng 2/2007 đến tháng 8/2007, tại Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hóa – Sinh, trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Để tạo tiền đề trong việc giải quyết vấn đề gian lận thƣơng mại đối với sản phẩm thịt tƣơi và thịt chế biến, bƣớc đầu chúng tôi tiến hành thiết lập quy trình phân biệt ba loại thịt heo, bò, cừu bằng phƣơng pháp multiplex PCR. Kết quả đạt đƣợc nhƣ sau: 1) Tách chiết DNA từ thịt tƣơi và thịt đã xử lý nhiệt ở nhiệt độ: 80 0 C/15’, 120 0 C/15’, 120 0 C/30’, 130 0 C/15’ với tỷ số OD trung bình là 2,0 (thịt tƣơi), 1,9 (thịt xử lý nhiệt)- tinh sạch, đạt tiêu chuẩn. 2) Sau khi tiến hành tối ƣu hóa phản ứng multiplex PCR bằng việc thử nghiệm nhiều quy trình (gồm quy trình của Matsunaga và ctv (1998) và các thử nghiệm điều chỉnh về thành phần hóa chất, nhiệt độ và thời gian của chu trình nhiệt, nồng độ mồi trong phản ứng), chúng tôi đã xác định đƣợc quy trình thích hợp, trong đó nồng độ MgCl 2 2mM, lƣợng FSIM: RP: RB: RS lần lƣợt là 0,4: 0,83: 0,24: 0,17 M, nhiệt độ và thời gian của chu kỳ nhiệt ở giai đoạn lặp lại là: biến tính (94 0 C/1phút), bắt cặp (54 0 C/45giây), kéo dài (72 0 C/1phút). 3) Sử dụng quy trình nultiplex PCR vừa tìm đƣợc đối với các hỗn hợp DNA của cả ba loài trong đó nồng độ DNA bò, cừu giảm dần và đã xác định đƣợc nồng độ của thịt cừu, bò mà quy trình này còn phát hiện đƣợc là 1ng/ l. 4) Chúng tôi tiếp tục thực hiện quy trình trên đối với các hỗn hợp thịt đã xử lý nhiệt ở các nhiệt độ khác nhau và rút ra kết luận là ở các nhiêt độ biến tính 80 0 C/15’, 120 0 C/15’, 120 0 C/30’, 130 0 C/15’ vẫn còn phân biệt đƣợc ba loài trên. 5) Thực hiện quy trình trên với bột thịt của 3 hãng CE, A, VY, kết quả bột thịt của các hãng này có nguồn gốc lần lƣợt là: heo, bò, bò. SUMMARY TRINH THI THANH HUYEN in subject “Identifying meat of three meat species: pig, bovine, sheep by multiplex PCR” Suspervisors : PhD. Nguyen Ngọc Tuan BCs. Luong Quy Phuong To primarily resolve economic faudulent at meat products, we establish protocol to identify meat of three species (pig, bovine, sheep) by multiplex PCR. The results: 1) Extraction DNA from raw meats and heated meats (at temperatures: 80 0 C/15 min, 120 0 C/15 min, 120 0 C/30 min, 130 0 C/15 min), average ratio of OD were 2,0 (raw meat) and 1,9 ( heated meat) were pure, standard quality. 2) After optimizing procedures including protocol of Matsunaga et al.(1998) and changing volume of reaction, element of chemical, temperature and time of thermal cycle, concentration of primer), we established the suitable multiplex PCR protocol. This protocol was MgCl 2 2 mM; concentration of primers FSIM: RP: RB: RS were 0,4: 0,83: 0,24: 0,17 M, temperature and thermal cycle (denature 94 0 C/1 min, anealing 54 0 C/45 sec, elongation 72 0 C/1 min). 3) Aplying the multiplex PCR protocol to analyse mix DNA from three meat with descending concentration on bovine DNA and sheep DNA, the limits of DNA sample detected were 1ng/ l for bovine and sheep. 4) Using the protocol for mix heated meats to reach the conlusion that at processing temperatures: 80 0 C/15 min, 120 0 C/15min, 120 0 C/30 min, 130 0 C/15min the meats of pig, bovine, sheep were still identified. Meat and bone meal from three companies (CE, A, VY) were examined by the established protocol, the products of those company were meat from pig, bovine and bovine, respectively. MỤC LỤC NỘI DUNG TRANG Bìa . i Trang tựa ii Lời cảm tạ iii Tóm tắt khóa luận iv Summary v Mục lục vi Danh sách các chữ viết tắt . x Danh sách các bảng . xi Danh sách các hình và biểu đồ xii Chƣơng 1 MỞ ĐẦU . 1 1.1 Đặt vấn đề 1 1.2 Mục đích 2 1.3 Yêu cầu 2 Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 3 2.1 Sơ lƣợc về thịt chế biến . 3 2.1.1 Giới thiệu về thịt . 3 2.1.2 Giới thiệu về thịt chế biến . 4 2.1.3 Tình hình sản xuất và tiêu thụ thịt chế biến 4 2.1.3.1 Tình hình gian lận trên thị trƣờng thịt tƣơi và thịt chế biến của thế giới 4 2.1.3.2 Tình hình xuất nhập khẩu động vật và sản phẩm chế biến từ động vật ở Việt Nam 5 2.2 Một vài đặc điểm về tế bào động vật . 6 2.3 Cơ sở để phân biệt các loại thịt chế biến bằng phƣơng pháp multiplex PCR . 7 2.4 Các phƣơng pháp phân biệt các loại thịt . 8 2.4.1 Phƣơng pháp quan sát dƣới kính hiển vi quang học . 8 2.4.2 Miễn dịch liên kết enzym (ELISA) 8 2.4.3 Protein array 9 2.4.4 Điện di 2 chiều 9 2.4.5. Giới thiệu chung về phƣơng pháp PCR (polymerase chain reaction) . 10 2.4.6 Nguyên tắc multiplex PCR . 16 2.5 Các công trình nghiên cứu về phát hiện loài trong thịt chế biến bằng phƣơng pháp multiplex PCR . 16 Chƣơng 3 NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 18 3.1 Nội dung thực hiện 18 3.2 Thời gian và địa điểm tiến hành 18 3.3 Vật liệu 19 3.3.1 Nguồn mẫu tách chiết DNA . 19 3.3.2 Đoạn mồi . 19 3.3.3 Hóa chất 19 3.3.3.1 Hóa chất dùng trong tách chiết DNA . 19 3.3.3.2 Hóa chất dùng trong điện di . 19 3.3.3.3 Hóa chất dùng trong phản ứng PCR . 20 3.3.3.4 Thiết bị và dụng cụ . 20 3.4 Phƣơng pháp tiến hành 20 3.4.1 Lấy và bảo quản mẫu 20 3.4.2 Phối hợp các loại thịt để tạo hỗn hợp thịt và xử lý nhiệt 20 3.4.3 Tách chiết DNA 21 3.4.4 Thực hiện phản ứng s-PCR . 22 3.4.5 Tối ƣu hóa phản ứng m-PCR 24 3.4.5.1 Thực hiện phản ứng m-PCR theo quy trình của Matsugana và ctv (1998) . 24 3.4.5.2 Thí nghiệm điều chỉnh thành phần phản ứng . 24 3.4.5.3 Thí nghiệm điều chỉnh chu trình nhiệt . 24 3.4.5.4 Thí nghiệm điều chỉnh nồng độ mồi trong 1 phản ứng 25 3.4.6 Thực hiện phản ứng m-PCR hai loài (heo, bò và heo, cừu) ở các nồng độ DNA khác nhau . 26 3.4.7 Thực hiện phản ứng m-PCR cho hỗn hợp DNA heo, bò, cừu 27 3.4.8 S-PCR đối với DNA của thịt xử lý nhiệt ở các nhiệt độ khác nhau: 80 0 C/15 phút, 120 0 C/15 phút, 120 0 C/30 phút, 130 0 C/15 phút 27 3.4.9 M-PCR để phát hiện thịt heo, bò, cừu trong các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt ở các nhiệt độ kha ́ c nhau 28 3.4.10 M-PCR đối cới bột thịt . 28 Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 4.1 Kết quả tách chiết 29 4.2 Kết quả s-PCR đối với thịt tƣơi thuần loài theo quy trình của Matsugana và ctv (1998) 31 4.3 Kết quả phản ứng m-PCR 3 loài theo quy trình của Matsugana và ctv (1998) . 32 4.4 Kết quả quá trình thiết lập và tối ƣu hóa phản ứng m- PCR . 33 4.4.1 Điều chỉnh thể tích phản ứng 33 4.4.2 Kết quả thí nghiệm điều chỉnh nồng độ Mg 2+ 33 4.4.3 Kết quả thí nghiệm điều chỉnh chu trình nhiệt . 34 4.4.4 Kết quả thí nghiệm điều chỉnh nồng độ mồi 36 4.4.5 Kết quả kiểm tra tính ổn định của quy trình . 38 4.5 Kết quả m-PCR đối với 2 loài . 39 4.6 Kết quả m-PCR đối với các hỗn hợp DNA có nồng độ giảm dần của DNA bò, cừu . 40 4.7 Kết quả s-PCR của thịt xử lý nhiệt 40 4.8 Kết quả m-PCR đối với các hỗn hợp thịt xử lý nhiệt 43 4.9 Kết quả m-PCR đối với bột thịt . 45 Chƣơng 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ . 47 5.1 Kết luận . 47 5.2 Đề nghị 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO . 48 PHỤ LỤC 51 DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 2. 1. Tỉ lệ của các mô trong các loại thịt (%tính theo khối lƣợng thịt xẻ) 3 Bảng 3. 1 Tỷ lệ các loại thịt trong các hỗn hợp thịt 21 Bảng 3. 2 Thành phần hóa chất PCR 23 Bảng 3. 3 Nồng độ mồi ngƣợc đối với mỗi loại thịt trong s-PCR 23 Bảng 3. 4 Chu trình nhiệt của phản ứng 23 Bảng 3. 5 Thành phần hóa chất PCR 24 Bảng 3. 6 Chu trình nhiệt của phản ứng trƣớc và sau khi điều chỉnh . 25 Bảng 3. 7 Điều chỉnh nồng độ mồi RS (giảm) 25 Bảng 3. 8 Điều chỉnh nồng độ mồi RP (tăng) . 26 Bảng 3. 9 Phối hợp DNA của heo và bò ở các nồng độ khác nhau 26 Bảng 3. 10 Phối hợp DNA của heo và cừu ở các nồng độ khác nhau 27 Bảng 3. 11 Thành phần các hỗn hợp DNA heo, bò, cừu 27 Bảng 3. 12 Hỗn hợp thịt ở các nhiệt độ xử lý khác nhau 28 Bảng 4. 1 Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA của thịt bò, heo, cừu 29 Bảng 4. 2 Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA tách chiết từ thịt tƣơi và thịt xử lý nhiệt . 30 [...]... hành xây dựng quy trình phân biệt ba loại thịt heo, bò, cừu trong hỗn hợp thịt chế biến bằng phƣơng pháp multiplex PCR 1.2 Mục đích Bƣớc đầu xây dựng quy trình multiplex PCR phát hiện và phân biệt thịt heo, bò, cừu Ứng dụng quy trình để phát hiện và phân biệt các hỗn hợp thịt đã xử lý nhiệt và bột thịt 1.3 Yêu cầu Nắm vững qui trình tách chiết DNA Tối ƣu hóa quy trình multiplex PCR và ứng dụng quy trình... sử dụng phƣơng pháp multiplex PCR để khuếch đại vùng gen trên mtDNA Tác giả thực hiện phản ứng PCR với nhiều nồng độ DNA khác nhau Sau đó dựa sự có hay không các sản phẩm PCR qua điện di để xác định nồng độ tối thiểu của DNA để phản ứng PCR còn phát hiện đƣợc 2.4 Các phƣơng pháp phân biệt các loại thịt 2.4.1 Phƣơng pháp quan sát dƣới kính hiển vi quang học Để phân biệt các loài trong bột xƣơng thịt ngƣời... sức khỏe cho ngƣời tiêu dùng Có nhiều cách để xác định nguồn gốc thịt: dùng kính hiển vi quang học, ELISA, điện di 2 chiều, protein array, multiplex PCR Bốn phƣơng pháp đầu hoặc chậm hoặc không thể ứng dụng cho các sản phẩm thịt đã xử lý ở nhiệt độ cao Còn phƣơng pháp multiplex PCR là một phƣơng pháp nhanh, đặc hiệu, đơn giản, thích hợp để phân biệt các loại thịt đã xử lý nhiệt Vì vậy để tạo tiền... phát hiện loài trong thịt chế biến bằng phƣơng pháp multiplex PCR Hơn một thập kỉ qua, sau khi ra đời phƣơng pháp PCR nói chung và multiplex PCR nói riêng đã đƣợc sử dụng rộng rãi để phát hiện hay phân biệt DNA các sinh vật khác nhau từ nhiều nguồn mẫu Vì vậy phƣơng pháp multiplex PCR cũng đã đƣợc nhiều nhà nghiên cứu sử dụng trong việc phân biệt loài động vật trong thịt chế biến Năm 1997, Wayne và ctv... 3.4 Phƣơng pháp tiến hành 3.4.1 Lấy và bảo quản mẫu Mua 500 g mỗi loại thịt bỏ vào túi nilon sạch kích thƣớc 5 x 10 cm, dán nhãn cho mỗi loại thịt, trữ trong thùng đá, đem về phòng thí nghiệm, trữ ở –700C 3.4.2 Phối hợp các loại thịt để tạo hỗn hợp thịt và xử lý nhiệt Mỗi loại thịt, lấy khoảng 150 g đem nghiền nhuyễn bằng máy nghiền mẫu Sau đó đem cân và trộn các loại thịt với tỉ lệ thịt heo, bò, cừu. .. bằng phƣơng pháp PCR Phƣơng pháp này tỏ ra hữu dụng đối với cả thịt tƣơi và hỗn hợp thịt chế biến bao gồm thịt phơi khô và thịt nấu chín từ bò, cừu, gà Năm 2004, Myers và ctv cũng đã dựa vào đoạn mtDNA để thiết lập phản ứng multiplex PCR nhằm phát hiện thịt các loài bò, heo, cừu, dê, ngựa trong thức ăn chó Giới hạn DNA để phát hiện là 1 g/kg Kết quả cho thấy chỉ có 27 mẫu trong tổng số 31 mẫu là chứa thịt. .. (các mẫu thức ăn chó đƣợc ghi trên nhãn là chỉ gồm thịt bò và heo) 17 Chƣơng 3 NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Nội dung thực hiện (1) Tách chiết DNA từ thịt tƣơi và thịt xử lý nhiệt ở: 800C/15’, 1200C/15’, 1200C/30’, 1300C/15’ (2) Thực hiện phản ứng single PCR (s -PCR) đối với DNA từ ba loại thịt tƣơi (heo, bò, cừu) để làm cơ sở cho phản ứng multiplex PCR (m -PCR) (3) Tối ƣu hóa quy trình m -PCR. .. axit amin, các sản phẩm trung gian của sự trao đổi chất, muối khoáng…Mỗi tế bào thƣờng có một nhân, thƣờng có hình tròn hay hình bầu dục Nhân thƣờng nằm ở giữa tế bào, nhƣng cũng có thể nằm lệch sát màng tế bào nhƣ ở tế bào cơ vân (Nguyễn Đình Trung, Nguyễn Minh Tâm, 2005) 2.3 Cơ sở để phân biệt các loại thịt chế biến bằng phƣơng pháp multiplex PCR Phƣơng pháp PCR thực chất là một phƣơng pháp tạo dòng... xuất và tiêu thụ sản phẩm thịt tƣơi, thịt chế biến vẫn diễn ra cùng với các dịch bệnh nguy hiểm liên tiếp hoành hành thì việc đảm bảo tính trung thực và an toàn của các sản phẩm này là rất cấp thiết Điều này đặt ra cho các nhà quản lý và các nhà nghiên cứu phải tìm ra phƣơng pháp phát hiện, phân biệt nhanh chóng, chính xác các loại thịt trong sản 1 phẩm thịt tƣơi cũng nhƣ thịt chế biến để ngăn chặn... quy trình m -PCR để xác định loại thịt trong hỗn hợp thịt tƣơi xay nhuyễn (4)Thực hiện phản ứng s -PCR đối với DNA từ thịt xử lý ở nhiệt độ: 800C/15’, 1200C/15’, 1200C/30’, 1300C/15’ (5) Thực hiện phản ứng m -PCR để xác định ba loại thịt heo, bò, cừu Thực hiện phản ứng m -PCR đối với hỗn hợp DNA heo, bò, cừu có nồng độ của DNA bò, cừu giảm dần để xác định ở nồng độ nào phản ứng m -PCR vẫn còn phát hiện đƣợc . ................................................................. 6 2.3 Cơ sở để phân biệt các loại thịt chế biến bằng phƣơng pháp multiplex PCR ... 7 2.4 Các phƣơng pháp phân biệt các loại thịt ............................................................ Tâm, 2005). 2.3 Cơ sở để phân biệt các loại thịt chế biến bằng phƣơng pháp multiplex PCR Phƣơng pháp PCR thực chất là một phƣơng pháp tạo dòng trong ống