ẢNH HƯỞNG CỦA LOẠI ENZYME, NỒNG ĐỘENZYME, NHIỆT ĐỘ, pH ĐẾN QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN NẾP THAN ỨNG DỤNG CHO QUÁ TRÌNH LÊN MEN

Trang 1

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

NĂM 2007

Trang 2

Luận văn đính kèm theo đây, với tựa đề tài :”ẢNH HƯỞNG CỦA LOẠI ENZYME, NỒNG ĐỘ ENZYME, NHIỆT ĐỘ, pH ĐẾN QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN NẾP THAN ỨNG DỤNG CHO QUÁ TRÌNH LÊN MEN” do Nguyễn Thanh Vũ thực hiện và báo cáo,

đã được hội đồng chấm luận văn thông qua

Cần Thơ, ngày …tháng…năm 2007

Chủ tịch hội đồng

Lý Nguyễn Bình

Trang 4

Chuyên ngành công nghệ thực phẩm-Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng

TÓM TẮT

V ới mong muốn sử dụng nguồn enzyme amylase để thay thế nấm mốc ở giai đoạn đường hóa trong quá trình sản xuất rượu nếp than nhằm nhằm nâng cao hiệu

su ất và đảm bảo chất lượng sản phẩm

khu ẩn Bacillus, hỗn hợp vi khuẩn Bacillus và nấm mốc Aspergillus, nấm mốc

h ợp nhất cho quá trình thủy phân nếp than đạt hiệu quả

K ết quả thí nghiệm thu được như sau :

- N ồng độ tối ưu đối với enzyme amylase từ Bacillus, từ Aspergillus niger là

Aspergillus là 1,5ml/50g

ưu là 70 0 C và 75 0 C

niger là pH 5,5

nghi ệm ở các điều kiện tối thích của enzyme, nhận thấy khả năng thủy phân nếp than của

Trang 5

MỤC LỤC

Lời cảm tạ i

Tóm tắt ii

Mục lục iii

Danh sách hình vi

Danh sách bảng viii

CHƯƠNG 1: ĐẶT VẤN ĐỀ 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu 1

CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2

2.1 Giới thiệu chung về nếp than 2

2.2 Giới thiệu chung về enzyme amylase 3

2.3 Cấu trúc phân tử amylase 3

2.3.1 Thành ph ần cấu tạo 3

2.3.2 Trung tâm hoạt động của enzyme 4

2.3.3 Tính đặc hiệu của enzyme 4

2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của amylase 5

2.4.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến phản ứng của enzyme 5

2.4.2 Ảnh hưởng của pH đến phản ứng của enzyme 5

2.4.3 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến phản ứng của enzyme 5

2.4.4 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến phản ứng enzyme 7

2.4.5 Ảnh hưởng của các chất hoạt hóa đến hoạt động của amylase 8

2.4.6 Ảnh hưởng của chất kìm hãm 8

2.4.7 C ơ chất tác dụng 9

2.5 Đặc tính và cơ chế tác dụng 10

2.5.1 α-amylase (EC.3.2.1.1) 10

2.5.2 β-amylase (EC.3.2.1.2) 13

2.5.3 γ-amylase (glucoamylase hay α-1,4- glucan-glucohydrolase) (EC.3.2.1.3) 14

2.5.4 Oligo-1,6-glucosidase (dextrin-6-glucanhydrolase) (EC 3.2.1.10) 15

Trang 6

2.5.5 Pullulanase (EC3.2.1.41) 16

2.5.6 Transglucosidase 16

2.7 Ứng dụng của enzyme amylase trong công nghệ thực phẩm 16

2.7.1 Trong s ản xuất rượu 16

2.7.2 Trong s ản xuất bia 16

2.7.1 Trong công ngh ệ sản xuất bánh mì 17

2.7.1 Trong s ản xuất bánh kẹo 17

2.7.1 Trong s ản xuất siro và các sản phẩm chứa đường 17

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 18

3.1 Phương tiện thí nghiệm 18

3.1.1 Địa điểm 18

3.1.2 Th ời gian 18

3.1.3 Nguyên li ệu 18

3.1.4 Hoá ch ất 18

3.1.5 Trang thi ết bị 18

2.1 Phương pháp thí nghiệm 19

2.1.1 Thí nghi ệm 1: Khảo sát hoạt lực của chế phẩm enzyme amylase thương mại đến quá trình th ủy phân tinh bột 19

2.2.2 Thí nghi ệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của loại enzyme amylase, nồng độ enzyme, pH và nhi ệt độ đến quá trình thuỷ phân nếp than 20

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23

4.1 Xác định hoạt tính của enzyme thương mại 23

4.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ, pH, nồng độ enzyme đến khả năng thủy phân của enzyme 24

4.2.1 K ết quả ảnh hưởng của nhiệt độ, pH, nồng độ enzyme đến khả năng thủy phân của enzyme α-amylase có nguồn gốc từ vi khuẩn Bacillus 24

4.2.2 K ết quả ảnh hưởng của nhiệt độ, pH, nồng độ enzyme đến khả năng thủy phân của enzyme glucoamylase có ngu ồn gốc từ nấm mốc Aspergillus và vi khuẩn Bacillus 29

4.2.3 K ết quả ảnh hưởng của nhiệt độ, pH, nồng độ enzyme đến khả năng thủy phân của enzyme glucoamylase có ngu ồn gốc từ nấm mốc Aspergillus niger 35

Trang 7

4.3 So sánh khả năng thủy phân của loại enzyme để ứng dụng cho quá trình lên men

40

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 41

5.1 Kết luận 41

5.2 Đề nghị 41

TÀI LIỆU THAM KHẢO 42

PHỤ LỤC ix

Trang 8

DANH SÁCH HÌNH

Hình1 : Nguyên liệu nếp than 2

Hình 2: Cấu trúc của anthocyanin 2

Hình 3: Các loại enzyme endoamylase và exoamylase 4

Hình 4: Hoạt động phân cắt liên kết α-1,4 và α-1,6-glucosid của amylase 10

Hình 5: Cơ chế tác dụng của hệ enzyme amylase 10

Hình 6: Cơ chế tác dụng của β-amylase lên tinh bột 14

Hình 7: Nếp sau khi nghiền nhỏ 23

Hình 8: Mẫu xác định hoạt lực của 3 loại enzyme 23

Hình 9: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi độ brix theo thời gian thủy phân ở pH = 5, nồng độ 0,5ml/50g 24

Hình 10: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi độ brix theo thời gian thủy phân ở pH = 5,5 và nhiệt độ 650C 25 Hình 11: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi độ brix theo thời gian thủy phân ở nồng độ 2,5ml/50g và nhiệt độ 700C 26

Hình 12: Độ brix của dịch thủy phân khi sử dụng enzyme nồng độ 0,5ml/50g 27

Hình 15: Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến độ Brix đạt được sau quá trình thủy phân tinh bột ở nồng độ 2,5ml/50g trong không gian 28

Hình 16: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi độ brix theo thời gian thủy phân ở pH = 3,5; nồng độ 0,5ml/50g 29

Hình 17: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi độ brix theo thời gian thủy phân ở pH = 3,5 và nhiệt độ 600C 30 Hình 18: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi độ brix theo thời gian thủy phân ở nồng độ 1,5ml/50g và nhiệt độ 600C 31

Trang 9

Hình 23: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi độ brix theo thời gian thủy phân ở pH = 4,5, nồng

độ 0,5ml/50g 34

Hình 24: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi độ brix theo thời gian thủy phân ở pH = 4 và nhiệt độ 600C 35 Hình 25: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi độ brix theo thời gian thủy phân ở nồng độ 0,5ml/50g và nhiệt độ 600C 36

Hình 30: Đồ thị hàm lượng chất tan thu được trong dịch lọc và hàm lượng đường trong bã của enzyme từ nguồn khác nhau 40

Trang 10

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 1:Thành phần hóa học của gạo nếp than 3

Bảng 2: Khả năng chịu nhiệt của enzyme amylase 11

Bảng 3: Khả năng chịu nhiệt của α-amylase từ các nguồn khác nhau 11

Bảng 4: Hoạt độ của enzyme amylase 24

Bảng 5: Kết quả thống kê ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng thủy phân của enzyme α-amylase có nguồn gốc từ vi khuẩn bacillus 24

Bảng 6: Kết quả thống kê ảnh hưởng của nồng độ đến khả năng thủy phân của enzyme α-amylase có nguồn gốc từ vi khuẩn bacillus 25

Bảng 7: Kết quả thống kê ảnh hưởng của pH đến khả năng thủy phân của enzyme α-amylase có nguồn gốc từ vi khuẩn bacillus 26

Bảng 8: Kết quả thống kê ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng thủy phân của enzyme glucoamylase từ Aspergillus và Bacillus 29

Bảng 9: Kết quả thống kê ảnh hưởng của nồng độ đến khả năng thủy phân của enzyme glucoamylase từ Aspergillus và Bacillus 31

Bảng 10: Kết quả thống kê ảnh hưởng của pH đến khả năng thủy phân của enzyme glucoamylase từ Aspergillus và Bacillus 32

Bảng 11: Kết quả thống kê ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng thủy phân của enzyme glucoamylase có nguồn gốc từ aspergillus niger 35

Bảng 12: Kết quả thống kê ảnh hưởng của nồng độ đến khả năng thủy phân của enzyme glucoamylase từ Aspergillus niger 36

Bảng 13: Kết quả thống kê ảnh hưởng của pH đến khả năng thủy phân của enzyme glucoamylase từ Aspergillus niger 37

Bảng 14: So sánh khả năng thủy phân của enzyme 39

Bảng 15: Hiệu suất thủy phân của các loại enzyme 40

Trang 11

CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Đặt vấn đề

Ngày nay với sự phát triển không ngừng của khoa học kỹ thuật, nhiều sản phẩm lên men truyền thống đã được nghiên cứu sâu về mặt khoa học và kỹ thuật sản xuất Ở các nước trong khu vực hiện nay đã nghiên cứu cải tiến thành công chất lượng rượu cổ truyền được

áp dụng sản xuất với qui mô công nghiệp, phân phối rộng rãi trên thế giới như rượu Sakê của Nhật, rượu Mao Đài của Trung Quốc

Ở Việt Nam thức uống lên men truyền thống cũng rất đa dạng, từ rượu Cần ở các dân tộc miền núi Tây Nguyên đến rượu đế, rượu nếp than của người Kinh Nhiều địa phương đã sản xuất các loại rượu nổi tiếng như rượu làng Vân ở miền Bắc, rượu Gò Đen, rượu Xuân Thạnh ở miền Nam được nhiều người ưa chuộng

Trong các loại rượu lên men truyền thống kể trên thì rượu nếp than là một loại rượu khá đặc biệt Sản phẩm là kết quả của quá trình lên men không chưng cất nguyên liệu nếp mà thành Tuy nhiên do nhân dân ta sản xuất theo phương pháp truyền thống (sử dụng bánh men thuốc bắc) nên chất lượng rượu không ổn định, năng suất rượu không cao vì trong thành phần bánh men thuốc bắc chứa nấm mốc, nấm men và vi khuẩn mà chúng ta không thể kiểm soát được số lượng của chúng trong bánh men chính vì vậy mà làm cho chất lượng và hiệu suất rượu không ổn định Mặt khác thời gian sản xuất cũng rất dài do phải mất thời gian khoảng 3 ngày để nấm mốc chuyển hóa tinh bột thành đường và khoảng 4 ngày để nấm men chuyển hóa đường thành rượu

Với việc ứng dụng phương pháp enzyme để thay thế nấm mốc ở giai đoạn đường hóa có thể rút ngắn được thời gian sản xuất cũng như đảm bảo được chất lượng rượu do ít bị nhiễm vi sinh vật lạ và ít tốn kém lượng chất khô, vì vậy sẽ giảm được chi phí cho quá trình sản xuất, đảm bảo chất lượng sản phẩm và giá trị dinh dưỡng của sản phẩm này

Từ những lí do trên việc ứng dụng phương pháp enzyme trong sản xuất rượu vang nếp than cần được quan tâm và nghiên cứu

Trang 12

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu chung về nếp than

Nguyên liệu thường được sử dụng để sản xuất rượu là các loại ngũ cốc vì chứa hàm lượng tinh bột rất cao Trong đó gạo, nếp là hai nguyên liệu quan trọng với hàm lượng tinh bột trên 70% được sử dụng rộng rãi trong sản xuất rượu

Gạo nếp than là một loại gạo đặc biệt được trồng ở

nhiều vùng Nam bộ, vì thế loại rượu này là đặc sản

của vùng Nam bộ Tên khoa học là Oryza Sativa

Tamaka Gạo nếp than gồm 4 loại:

-Nếp cẩm Đức Hòa

- Nếp đen Khánh Vinh

- Nếp than Long Đất

- Lúa lứt nếp cẩm

Các loại lúa này có năng suất không cao, thường chỉ đạt 2,8 – 3,3 tấn/ha

Hiện nay dân vùng Đồng bằng Nam bộ phân loại nếp than theo màu sắc hạt gạo Theo cách này nếp than được chia thành 2 loại:

- Nếp than đen huyền

- Nếp than hồng đỏ

Màu sắc của nếp than đó là màu anthocyanin, nó dễ dàng hòa tan trong nước và cho màu sắc đẹp tự nhiên Anthocyanin là những glucozit do gốc đường glucose, glactose kết hợp với gốc aglucon có màu (anthocyanidin)

Hình 2: Cấu trúc của anthocyanin

Anthocyanin tinh khiết ở dạng tinh thể hoặc vô định hình là hợp chất khá phân cực nên tan tốt trong dung môi phân cực Màu sắc của anthocyanin luôn thay đổi phụ thuộc vào

pH, các chất màu có mặt và nhiều yếu tố khác, tuy nhiên màu sắc của anthocyanin thay đổi mạnh nhất phụ thuộc vào pH môi trường Thông thường khi pH < 7 các anthocyanin

Hình1 : Nguyên liệu nếp than

Trang 13

có màu đỏ, khi pH > 7 thì có màu xanh Ở pH = 1 các anthocyanin thường ở dạng muối oxonium màu cam đến đỏ, ở pH = 4 - 5 chúng có thể chuyển về dạng bazơ cacbinol hay bazơ chalcon không màu, ở pH = 7 - 8 lại về dạng bazơ quinoidal anhydro màu xanh Tuy khác nhau về màu sắc bên ngoài, nhưng các loại nếp than có thành phần hóa học không khác nhiều

Bảng 1: Thành phần hóa học của gạo nếp than

Nước Protein Lipid Glucid Acid hữu cơ

Tro

14 8,2 1,5 74,9 0,6

0,8

Nguy ễn Đức Lượng,2003

2.2 Giới thiệu chung về enzyme amylase

Enzyme amylase thuộc nhóm enzyme thủy phân, xúc tác sự phân giải các liên kết glucoside nội phân tử trong các polysaccharide với sự tham gia của nước Amylase thủy phân tinh bột, glycogen và các dextrinh thành glucose, maltose và dextrin mạch ngắn Amylase tìm thấy trong tuyến nước bọt, trong dịch tiêu hóa của người và động vật, trong hạt nảy mầm, trong sản phẩm trao đổi chất của nấm mốc, nấm men và vi khuẩn Trong đó amylase được thu nhận từ malt với số lượng nhiều nhất

Dựa theo tính chất và cơ chế tác dụng lên tinh bột của amylase người ta phân biệt amylase

ra các loại: α-amylase, β-amylase, γ-amylase (glucoamylase), oligo-1,6-glucozidase (dextrinase),…

Enzyme amylase cũng như các enzyme khác đều có bản chất là protein được sinh vật tổng hợp nên và tham gia vào các phản ứng sinh học

2.3 Cấu trúc phân tử amylase

Enzyme amylase thuộc loại hydrolase chỉ là những phân tử protein thuần, nghĩa là sản phẩm của sự phân giải enzyme này hoàn toàn chỉ gồm toàn những acid amin Vì vậy, chúng thuộc loại enzyme đơn giản ( đơn cấu tử)

Hiện nay, người ta biết có sáu loại enzyme được xếp thành hai nhóm là endoamylase (enzyme nội bào) và exoamylase (enzyme ngoại bào)

- Endoamylase: gồm α–amylase và nhóm enzyme khử nhánh Nhóm enzyme khử nhánh được chia thành hai loại: khử trực tiếp là pullulanase (α-dextrin-6-

Trang 14

glucanohydrolase); khử gián tiếp là transglucosidase Các enzyme này thủy phân các liên kết bên trong chuỗi polysaccharide

- Exoamylase: gồm β-amylase và γ-amylase Đây là những enzyme thủy phân tinh bột từ đầu không khử của chuỗi polysacchride

Amylase

Exoamylase Endoamylase

β-amylase γ-amylase Enzyme khử nhánh α -amylase

Khử trực tiếp Khử gián tiếp α-dextrin-6-glucanohydrolase Oligo-1,6- glucosidas (pullulanase) (transglucosilase)

Và amylo-1,6-glucosidase

Hình 3: Các loại enzyme endoamylase và exoamylase

2.3.2 Trung tâm hoạt động của enzyme

Enzyme amylase nói riêng hay tất cả các enzyme nói chung đều là loại protein đặc biệt Ngoài cấu trúc giống như cấu trúc bình thường của một protein, enzyme còn có cấu trúc rất đặc biệt liên quan đến hoạt động của enzyme Không phải toàn bộ enzyme tham gia vào hoạt động xúc tác mà chỉ có những bộ phận rất đặc biệt mang tính đặc hiệu trong phân tử protein mới tham gia xúc tác phản ứng Bộ phận đặc biệt này được gọi là trung tâm hoạt động của enzyme

Đối với enzyme amylase trung tâm hoạt động của nó thường là những nhóm chức như: -

NH2, - COOH, - SH… Ngoài ra để thực hiện được chức năng của mình enzyme amylase còn phải trải qua vai trò trung gian của phân tử H2O

Tính đặc hiệu là khả năng xúc tác của enzyme đối với cơ chất nhất định Mỗi enzyme đều có tác dụng chọn lọc đối với một cơ chất hoặc một loại cơ chất nhất định và đối với một phản ứng hóa học nhất định Tính chất xúc tác đặc hiệu đó gọi là tính đặc hiệu của enzyme Tính đặc hiệu là một trong những tính chất cơ bản nhất của enzyme Do cấu trúc hóa lý đặc biệt của enzyme và đặc biệt là trung tâm hoạt động mà enzyme có tính chất đặc hiệu rất cao so với các xúc tác thông thường khác Đặc hiệu kiểu phản ứng: mỗi enzyme chỉ có thể xúc tác cho một kiểu phản ứng chuyển hóa nhất định trong các kiểu phản ứng: oxy hóa khử, phản ứng chuyển vị, phản ứng thủy phân,…

Trang 15

2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của amylase

Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến phản ứng của enzyme Tốc độ phản ứng của enzyme tăng khi nhiệt độ tăng Tốc độ phản ứng của enzyme không phải lúc nào cũng tỉ lệ thuận với nhiệt độ phản ứng Tốc độ phản ứng chỉ tăng đến một giới hạn nhiệt độ nhất định Vượt quá nhiệt độ đó, tốc độ phản ứng enzyme sẽ giảm và làm enzyme vô hoạt Nhiệt độ tương ứng với tốc độ phản ứng enzyme cao nhất được gọi là nhiệt độ tối ưu Phần lớn enzyme hoạt động mạnh nhất ở nhiệt độ 400C – 500C Nhiệt độ này tối ưu của enzyme khác nhau sẽ khác nhau

Nếu đưa nhiệt độ cao hơn mức nhiệt độ tối ưu, hoạt tính của enzyme sẽ bị giảm Khi đó enzyme không còn khả năng phục hồi hoạt tính Nhiệt độ tối ưu của một enzyme phụ thuộc rất nhiều vào sự có mặt của cơ chất, kim loại, pH và các chất bảo vệ Người ta thường sử dụng yếu tố nhiệt độ để điều khiển hoạt động của enzyme và tốc độ phản ứng trong chế biến và bảo quản thực phẩm

pH môi trường thường ảnh hưởng đến mức độ ion hoá cơ chất, enzyme và đặc biệt ảnh hưởng đến độ bền của enzyme Chính vì thế pH có ảnh hưởng rất mạnh đến phản ứng của enzyme

Nhiều enzyme hoạt động rất mạnh ở pH trung tính Tuy nhiên cũng có nhiều enzyme hoạt động ở pH acid yếu Một số khác lại hoạt động mạnh ở pH kiềm và cả pH acid pH tối ưu cũng phụ thuộc vào nhiệt độ, khi tăng nhiệt độ phản ứng thì pH tối ưu sẽ chuyển dịch về phía lớn hơn

Người ta thường sử dụng ảnh hưởng của pH để điều hòa phản ứng trong bảo quản, chế biến thực phẩm

Enzyme tham gia quá trình xúc tác tạo phức hợp enzyme – cơ chất (ES) Trong trường hợp đơn giản nhất, phản ứng chỉ có một cơ chất (S), enzyme (E) xúc tác cho sự chuyển hóa cơ chất tạo thành một sản phẩm (P), phản ứng xảy ra như sau

Trang 16

Mối quan hệ giữa vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác và nồng độ cơ chất được biểu diễn theo phương trình Michaelis – Menten như sau:

Qua đồ thị chung của đường biểu diễn cho thấy khi tăng nồng độ cơ chất, vận tốc phản ứng tăng Khi tăng nồng độ cơ chất đến giới hạn xác định nào đó, vận tốc phản ứng đạt giá trị cực đại Vmax, sau đó vận tốc phản ứng sẽ không tăng nữa nếu ta tiếp tục tăng nồng

độ cơ chất

Từ phương trình (*), ta có thể xét 3 trường hợp xảy ra:

- Nếu [S] << Km v = Vmax [S]/Km Như vậy khi [S] thấp, v phụ thuộc tuyến tính vào [S], phương trình phản ứng theo bậc 1

- Nếu [S] >> Km v = Vmax : vận tốc phản ứng đạt cực đại, không phụ thuộc vào [S] Phản ứng bậc 0

Trang 17

Km 1 1 1 = * + (**)

V V [S] VmaxPhương trình (**) có dạng y = ax + b, đường biểu diễn là đường thẳng, cắt trục tung ở giá trị 1/Vmax, cắt trục hoành ở giá trị -1/Km

Vận tốc của của phản ứng enzyme tỉ lệ thuận với nồng độ enzyme khi có đầy đủ cơ chất Nồng độ enzyme càng lớn bao nhiêu thì lượng cơ chất bị biến đổi càng nhiều bấy nhiêu Cũng có trường hợp khi nồng độ enzyme quá lớn, vận tốc phản ứng chậm

V = k[E]

Trong đó :

V: Vận tốc phản ứng K: Hằng số vận tốc [E] : Nồng độ enzyme

Chất hoạt hóa là những chất có tác dụng làm cho enzyme amylase từ trạng thái không hoạt động hoặc hoạt động yếu trở nên mạnh hơn, chất hoạt hóa có bản chất giống nhau có thể là:

- Các chất hữu cơ phức tạp (coenzyme, vitamin) làm nhiệm vụ chuyển nhóm chuyển hydro Ví dụ: NAP+, NADP+, acid arcosbic (chuyển hydro), ADP (chuyển photphat)

Trang 18

- Những chất có khả năng phá vỡ một số liên kết trong phân tử tiền enzyme kết quả là bỏ một vài đoạn peptid, phá thế bị bao vây của các nhóm hoạt động trong trung tâm hoạt động của enzyme làm cho enzyme trở nên hoạt động

- Các chất có tác dụng phục hồi những nhóm chức hoạt động của trung tâm hoạt động của enzyme

Ví dụ: Trung tâm hoạt động của papain có chứa nhóm – SH sẽ chuyển thành - S – S- làm enzyme mất khả năng hoạt động Nếu thêm vào môi trường các chất hoạt hóa có tính khử như cystein, glutation, nhóm – SH sẽ được phục hồi và enzyme sẽ hoạt động trở lại

- Các anion, các ion kim loại cũng có thể tham gia tạo thành trung tâm hoạt động của enzyme làm cầu nối giữa enzyme và cơ chất hoặc ổn định cấu hình cần cho hoạt động xúc tác của enzyme

Tuy nhiên, khi sử dụng các hóa chất này phải tùy từng loại mà sử dụng nồng độ khác nhau

vì các chất hoạt hóa chỉ có tác dụng hoạt hóa ở một nồng độ nhất định Vượt quá nồng độ này chúng sẽ gây ức chế hoạt động của enzyme

Các chất kìm hãm là chất có mặt trong phản ứng enzyme làm yếu hoặc chấm dứt hoàn toàn tác dụng của enzyme nhưng lại không bị enzyme làm thay đổi tính chất hóa học, cấu tạo hóa học và tính chất vật lý của chúng

Các chất kìm hãm có bản chất hóa học khác nhau có thể là ion kim loại, các phân tử vô

cơ, các chất hữu cơ và protein Cơ chế kìm hãm của các chất kìm hãm có thể là thuận nghịch hoặc không thuận nghịch Thường phân biệt hai loại kìm hãm thuận nghịch là: Kìm hãm cạnh tranh và kìm hãm không cạnh tranh

- Kìm hãm cạnh tranh: Các chất kìm hãm cạnh tranh là những chất có cấu trúc tương tự như cấu trúc của cơ chất Chúng có khả năng kết hợp với trung tâm hoạt động của enzyme Khi đó chúng sẽ chiếm vị trí của cơ chất trong trung tâm hoạt động Cơ chế loại trừ lẫn nhau của chất kìm hãm và trung tâm hoạt động làm giảm số lượng các enzyme kết hợp với cơ chất Kết quả làm hoạt động của enzyme sẽ giảm

- Kìm hãm không cạnh tranh: Chất kìm hãm không chiếm trung tâm hoạt động của enzyme mà là ở một vị trí ngoài trung tâm hoạt động của enzyme Kết quả chất kìm hãm này làm thay đổi cấu trúc không gian của phân tử enzyme theo chiều hướng bất lợi cho hoạt động xúc tác, làm giảm hoạt động của enzyme

Tất cả các amylase đều bị kìm hãm bởi những ion kim loại nặng như: Cu2+, Ag2+,

Hg2+ Ngoài ra axit sunfosalisilic 20%, acid chlohydric làm ngưng hoạt động của enzyme

Trang 19

Amylose có trọng lượng phân tử 50000 – 160000, được cấu tạo từ 200 – 1000 phân tử glucose nối với nhau bởi liên kết α-1,4- glucoside tạo thành mạch xoắn dài không phân nhánh

D-Amylopectin có trọng lượng phân tử 400000 đến hàng chục triệu, được cấu tạo từ 600 –

6000 phân tử D-glucose nối với nhau bởi liên kết α-1,4- glucoside và α-1,6- glucosid tạo thành mạch có nhiều nhánh

Tinh bột không tan trong nước lạnh nhưng hỗn hợp tinh bột khi bị đun nóng 60 – 850C thì tinh bột sẽ bị hồ hóa và gọi là hồ tinh bột Dưới tác dụng của enzyme amylase, tinh bột bị thủy phân do các liên kết glucosid bị phân cắt Sự thủy phân tinh bột bởi enzyme xảy ra theo hai mức độ: dịch hóa và đường hóa Kết quả của sự dịch hóa là tạo ra sản phẩm trung gian dextrin và sau đó dextrin tiếp tục bị đường hóa tạo sản phẩm cuối là maltose và glucose

Carbohydrate trong thực phẩm là nguồn cung cấp năng lượng quan trong cho cơ thể con người Rau và quả cũng là nguồn cung cấp tinh bột, nhưng tinh bột này một phần đã được chuyển hóa thành disaccharide và glucose Carbohydrate có mặt trong hầu hết các loại thực phẩm nhưng nguồn cung cấp chủ yếu là đường và tinh bột

ii Glycogen

Glycogen là một loại carbohydrate dự trữ ở động vật và được cơ thể chuyển hóa để sử dụng dần dần Amylase có vai trò quan trọng trong sự chuyển hóa glucid ở tế bào động vật, vi sinh vật Glycogen được cấu tạo từ các glucose liên kết với nhau bởi liên kết α-1,4-glucosid Ở các vị trí phân nhánh, glucose nối với nhau bằng liên kết α-1,6- glucosid Glycogen có số mạch nhánh nhiều hơn tinh bột Glycogen dễ tan trong nước, nếu ta ăn quá nhiều carbohyrate thì cơ thể sẽ chuyển hóa chúng thành chất béo dự trữ Ở động vật và người, glycogen tập trung chủ yếu trong gan

2.5 Đặc tính và cơ chế tác dụng

Các enzyme amylase từ các nguồn sẽ khác nhau về tính chất, cơ chế tác dụng cũng như sản phẩm cuối cùng của sự thủy phân Ngay cả các amylase cùng loại do vi sinh vật tổng

Trang 20

hợp nên cũng có nhiều điểm khác nhau về đặc tính, cơ chế tác dụng và điều kiện hoạt động

Hình 4: Hoạt động phân cắt liên kết α-1,4 và α-1,6-glucosid của amylase

Hình 5: Cơ chế tác dụng của hệ enzyme amylase

i Đặc tính

α-amylase từ các nguồn khác nhau có thành phần amino acid khác nhau α-amylase khá giàu tyrosine, tryptophan nhưng ít methionin, có khoảng 7 – 10 gốc cysteine Trọng lượng phân tử của α-amylase từ malt là 59 kDa (Fischer, Stein, 1960), từ nấm mốc là 45 – 50 kDa

α-amylase dễ tan trong nước, trong các dung dịch muối và rượu loãng Protein của các amylase có tính acid yếu và có tính chất của globuline Điểm đẳng điện nằm trong vùng pH: 4,2 – 5,7(Bernfeld, 1951)

Trang 21

Điều kiện hoạt động của α-amylase từ các nguồn khác nhau thường không giống nhau Biên độ pH tối thích cho hoạt động của α-amylase từ malt khác với α-amylase từ vi sinh vật

Là một metaloenzyme Mỗi phân tử đều có chứa 1 – 30 nguyên tử gam Ca/mol, nhưng không ít hơn 1 – 6 nguyên tử gam/mol Ca2+ tham gia vào sự hình thành và ổn định cấu trúc bậc 3 của enzyme (Molodova, 1965) Do đó, Ca còn có vai trò duy trì sự tồn tại của enzyme khi bị tác động bởi các tác nhân gây biến tính và tác động của các enzyme phân giải protein Nếu phân tử enzyme bị loại bỏ hết Ca thì nó sẽ hoàn toàn bị mất hết khả năng thủy phân cơ chất

Độ bền đối với tác dụng của acid cũng khác nhau α-amylase của nấm sợi bền vững đối với acid tốt hơn α-amylase của malt và vi khuẩn Ở pH 3,6 và 00C, α-amylase của malt bị

vô hoạt hoàn toàn sau 15 – 20 phút; α-amylase vi khuẩn bị vô hoạt 50 %, trong khi đó hoạt lực của α-amylase nấm sợi hầu như không giảm bao nhiêu

α-amylase được hoạt hóa bởi ion đơn trị nếu chúng có nguồn gốc động vật và vi sinh vật Nếu có nguồn gốc thực vật thì được hoạt hóa bởi ion hóa trị II Hoạt hóa bởi ion hóa trị I như sau: Cl- > Br- > I- Chúng bị kìm hãm bởi ion kim loại nặng như Cu2+, Hg2+…

α-amylase kém bền trong môi trường acid nhưng khá bền nhiệt (bền nhất trong hệ enzyme amylase)

Bảng 2: Khả năng chịu nhiệt của enzyme amylase

Bùi Th ị Quỳnh Hoa, 2004

Bảng 3: Khả năng chịu nhiệt của α-amylase từ các nguồn khác nhau

Nhiệt độ (0C) Hoạt tính của α-amylase, % so hoạt tính với ban đầu

Nấm sợi Malt Vi khuẩn

Trang 22

ii Cơ chế tác dụng lên mạch Amylose và Amylopectin

α-amylase có khả năng phân cắt liên kết α-1,4 Glucoside ở bất kỳ vị trí nào trên mạch tinh bột đã được hồ hóa Do đó được gọi là enzyme nội phân (endoenzyme)

α-amylase không chỉ có khả năng phân huỷ hồ tinh bột mà còn có khả năng phân huỷ cả hạt tinh bột nguyên vẹn Sự thủy phân tinh bột của α-amylase trải qua nhiều giai đoạn: Trước tiên enzyme này phân cắt một số liên kết trong tinh bột tạo ra một lượng lớn dextrin phân tử thấp, sau đó các dextrin này bị thủy phân tiếp tục để tạo thành maltose và glucose

Dưới tác dụng của enzyme α-amylase, amylose bị phân giải khá nhanh tạo thành oligoshaccaride gồm 6-7 gốc glucose, sau này các mạch này bị phân cắt dần và bị phân giải chậm đến maltose Sau thời gian thủy phân amylose sản phẩm bao gồm: 87% maltose, 13% glucose

Dưới tác dụng của enzyme amylase amylopectin bị phân giải khá nhanh nhưng vì amylase không phân cắt được liên kết α-1,6 glucoside nên dù có kéo dài thời gian thủy phân nhưng sau cùng sản phẩm có khoảng: 72% maltose, 19% glucose, dextrin phân tử thấp và izomaltose là 8%

α-Các giai đoạn của quá trình thuỷ phân tinh bột của α-amylase:

- Giai đoạn dextrin hoá:

α-amylase

Tinh bột dextrin phân tử lượng thấp

- Giai đoạn đường hóa:

α-amylase

Dextrin tetra và trimaltose di và monosaccharides

α-amylase

Amylose Oligosaccharide Polyglucose

Maltose maltotriose Maltotetrose

Khả năng dextrin hóa của α-amylase rất cao do đó người ta còn gọi α-amylase là amylase dextrin hóa hay amylase dịch hóa

i Đặc tính

β-amylase là một loại albumin Tâm xúc tác của nó chứa gốc-SH, - COOH cùng với vòng imidazol của các gốc histidin β-amylase chỉ phổ biến trong thực vật, đặc biệt có nhiều

Trang 23

trong các hạt nẫy mầm Trong vi khuẩn không có β-amylase Sự tồn tại β-amylase trong nấm mốc cho đến nay vẫn chưa được xác định

β-amylase rất bền khi không có ion Ca2+, bị kìm hãm bởi ion kim loại nặng như: Cu2+,

Hg2+, urê, ido, acetanic, iod, ozon

β-amylase chịu nhiệt kém hơn α-amylase nhưng bền với acid hơn

pH tối thích trong dung dịch bột thuần khiết là 4-6, trong dung dịch nấu là 5-5.6 Nhiệt

độ tối thích trong tinh bột thuần khiết là 40-500C Trong dung dịch nấu là: 60-650C

β-amylase bị vô hoạt ở nhiệt độ 700C

ii Cơ chế tác dụng lên mạch tinh bột

β-amylase xúc tác sự thủy phân các liên kết α-1,4 glucoside trong tinh bột, glycogen, polysaccharide đồng loại Phân cắt tuần tự từng gốc maltose một ở đầu không khử Maltose có cấu hình β được tạo thành β-amylase được gọi là enzyme ngoại phân (exo-enzyme)

β-amylase phân giải 100% amylose thành maltose Phân giải 54-58% amylopectin thành maltose Do mỗi nhánh của amylopectin có từ 20-25 phân tử glucose nên sau khi thủy phân tạo 10-12 phân tử maltose Khi tới liên kết α-1,4 glucoside gắn với α-1,6 glucoside, β-amylase sẽ ngưng tác dụng, phần saccharide còn lại là dextrin phân tử lớn Có chứa nhiều liên kết α-1,6 glucoside gọi là dextrin có màu tím đỏ với iod

Nếu tinh bột bị thủy phân đồng thời bởi cả α và β-amylase thì tinh bột sẽ bị thủy phân đến 95%

Tác dụng của β-amylase lên tinh bột như sau

β-amylase

Tinh bột maltose (54 – 58%) + β-dextrin (42 – 46%)

Hình 6: Cơ chế tác dụng của β-amylase lên tinh bột

Trang 24

2.5.3 γ-amylase (glucoamylase hay α-1,4- glucan-glucohydrolase) (EC.3.2.1.3)

i Đặc tính

γ-amylase có khả năng thủy phân liên kết α-1,4 lẫn α-1,6 glucoside Khi thủy phân liên kết α-1,4-glucan trong chuỗi polysaccharide, Glucoamylase tách lần lượt từng phân tử glucose ra khỏi đầu không khử của mạch để tạo ra glucose

Ngoài các liên kết α-1,4 và α-1,6 glucoside, glucoamylase còn có khả năng thủy phân các liên kết α-1,2 và α-1,3 glucoside

Glucoamylase có khả năng thủy phân hoàn toàn tinh bột mà không cần có sự tham gia của các amylase khác Glucoamylase thủy phân các polysaccharide có phân tử lớn nhanh hơn

so với các chất có phân tử nhỏ So với β-amylase, γ-amylase bền với acid hơn nhưng lại kém bền dưới tác dụng của rượu etylic, acetone, không bền với ion kim loại nặng: Cu2+,

Hg2+…có trong nấm mốc và một vài loại vi khuẩn

Hoạt động tốt ở 500C, hoạt lực tối đa trong vùng pH 3.5-5.5

Enzyme γ-amylase có khả năng xúc tác thủy phân cả liên kết α-1,4; 1,6 glucozid trong tinh bột, glycogen, polysaccharide kiểu maltose Là enzyme ngoại phân exo-enzyme Nó thủy phân polysaccharide từ đầu không khử tuần tự từng gốc glucose một Chúng không thủy phân được các dextrin vòng

Khi thủy phân tinh bột, cùng với việc tạo thành glucose còn có thể tạo thành oligosaccharide Ngoài ra, γ-amylase còn có thể phân cắt cả liên kết α-1,2; 1,3-glucoside nữa

Chú ý khi sử dụng hệ enzyme amylase trong sản xuất rượu:

- Nguồn gốc của hệ enzyme amylase để biết được khoảng nhiệt độ, pH thích hợp Nắm được chất hoạt hóa, chất ức chế đối với từng enzyme để làm tăng khả năng hoạt động của nó, tăng nhanh hiệu suất đường hóa

- Tùy nguyên liệu cụ thể có thành phần amylase, amylosepectin khác nhau mà sử dụng loại enzyme thích hợp, cân đối

- Tùy từng loại men, từng loại sản phẩm lên men mà có thành phần nguyên liệu khác nhau, hàm lượng đường lên men khác nhau, dẫn đến chủng loại enzyme khác nhau Nói cách khác, chúng ta phải biết được các tính chất của nguồn enzyme đang sử dụng như

tỉ lệ các loại enzyme, nhiệt độ, pH thích hợp cho enzyme đó

Trang 25

2.5.4 Oligo-1,6-glucosidase (dextrin-6-glucanhydrolase) (EC 3.2.1.10)

Enzyme này thủy phân liên kết α-1,6-glucosid trong isomaltose, panose và các dextrin tới hạn thành đường có thể lên men được Enzyme này có ở vi sinh vật nhưng đồng thời cũng

có trong hạt nảy mầm (malt, thóc mầm) Ngoài oligo-1,6-glucosidase, hệ dextrinase của hạt ngũ cốc nảy mầm còn có amylopectin-1,6-glucosidase (R-enzyme) và dextrin-1,6-glucosidase (còn gọi là amylo-1,6-glucosidase hay dextrin-6- glucanhydrolase) (EC 3.2.1.33) Hai loại enzyme này đều thủy phân dextrin triệt để hơn α-amylase và β-amylase nên trong dịch thủy phân có nhiều maltose hơn

Nhiệt độ tối thích cho hoạt động của các dextrinase là 400C và pH tối thích là 5,1

2.5.5 Pullulanase (EC3.2.1.41)

Enzyme pullulanase thủy phân các liên kết α-1,6-glucoside trong tinh bột và glycogen Phân tử lượng của nó là 145000 pH hoạt động tối thích là 5,0 và nhiệt độ hoạt động tối thích là 47,50C Enzyme này có khả năng thủy phân cả những dextrin phân tử thấp chỉ gồm hai gốc maltose nối với nhau bằng liên kết α-1,6-glucoside

2.5.6 Transglucosidase

Transglucosidase luôn tương tác với glucoamylase Nó có cả hoạt tính transferase lẫn hoạt tính thủy phân nên sự có mặt của nó trong dung dịch thường gây nhằm lẫn với sự tồn tại của glucoamylase Transglucosidase không chỉ thủy phân maltose thành glucose mà còn tổng hợp izomaltose, izomaltotriose và panose, tức là nó có khả năng chuyển gốc glucose

và gắn nó vào phân tử maltose hoặc phân tử glucose khác bằng liên kết α-1,6-glucosid để tạo thành panose hoặc izomaltose

2.7 Ứng dụng của enzyme amylase trong công nghệ thực phẩm

Người ta dùng enzyme amylase làm tác nhân đường hóa trong công nghiệp sản xuất rượu cho phép tiết kiệm được hàng vạn tấn nguyên liệu (đại mạch) loại tốt, rút ngắn quá trình sản xuất, tiết kiệm được sản xuất, bởi enzyme amylase thủy phân sâu sắc tinh bột thành đường lên men trong thời gian ngắn Amylase không những quan trọng ở giai đoạn đường hóa mà còn ở cả giai đoạn xử lý nước nhiệt nguyên liệu nữa Việc sử dụng amylase để dịch hóa tinh bột khi nấu ở nhiệt độ 85-900C cho phép có thể chỉ hoàn toàn dùng hơi thứ cấp cho đun sơ bộ và làm dịu chế độ nấu Điều này làm giảm chi phí hơi trong gia nhiệt

và giảm bớt tổn thất tinh bột Vì vậy làm cho hiệu quả sản xuất tăng

Trong công nghệ sản xuất bia, người ta thường sử dụng enzyme amylase có trong mầm đại mạch để thủy phân tinh bột có trong mầm đại mạch Nguyên liệu chính là đại mạch nẩy mầm loại tốt Khác với rượu ở đây mức độ đường hóa chứa trong nguyên liệu

Trang 26

thấp hơn Cần có các dextrin chưa đường hóa làm cho bia có hương vị Việc chuyển hóa tinh bột và các nước chiết của nguyên liệu này do các enzyme amylase đảm nhiệm nên trong quá trình dịch hóa và đường hóa thì enzyme amylase có ý nghĩa quan trọng và vai trò quan trọng bậc nhất

Ta có thể bổ sung enzyme amylase từ các nguồn khác như vi sinh vật vào trong quá trình sản xuất bia để làm tăng hiệu suất thu hồi cho từng giai đoạn Do đó việc sử dụng enzyme amylase trong sản xuất bia có hiệu suất cao sẽ:

- Giảm tổn thất tinh bột và các chất hòa tan khi cho hạt nẩy mầm, làm tăng hiệu suất chất hòa tan lên 0,6 % (tức là tiết kiệm được 0,9% đại mạch )

- Giảm giá thành nguyên liệu hạt vì sử dụng nguyên liệu thay thế như gạo, bắp những nguyên liệu không nẩy mầm

- Giảm chi phí lao động cho sản xuất malt do đó tăng hiệu suất lao động

Trong bánh mì, enzyme dược xem như một chất phụ gia cho vào quá trình làm bánh để tăng chất lượng bánh mì Enzyme được đưa vào nhằm giải quyết các vấn đề sau:

- Làm tăng nhanh thể tích bánh

- Làm màu sắc của bánh đẹp hơn

- Làm tăng mùi thơm cho bánh

Các enzyme này tham gia thủy phân tinh bột để tạo thành đường Nhờ đó nấm men

bánh tạo màu sắc và hương vị tốt cho bánh

Việc sử dụng amylase cho phép sử dụng bột mì kém phẩm chất để làm bánh hoặc có thể giảm bớt tới 50% đường cho thêm vào bánh trong thực đơn sản xuất bánh mì ngọt

Nếu chỉ tận dụng lượng enzyme có sẵn trong bột thì các phản ứng chuyển hóa từ tinh bột

sẽ xảy ra không mạnh, nhất là khi ta sử dụng loại bột xấu để sản xuất bánh Do đó người

ta phải cho thêm enzyme amylase và protease vào chế biến bột trong quá trình sản xuất bánh quy

Các enzyme này hoạt động làm tăng lượng đường khử và acid amin Đường khử và acid amin có trong khối bột đó sẽ cùng tham gia vào các phản ứng oxy hóa-khử, phản ứng Maillard và kết quả là tạo cho bánh có mùi, vị và màu hấp dẫn

Trang 27

2.7.5 Trong s ản xuất siro và các sản phẩm chứa đường

Hiện nay, các nước Châu Âu và Châu Mỹ sản xuất siro đường fructose từ bột bắp bằng phương pháp enzyme phát triển rất mạnh Theo phương pháp này phôi bắp được

xử lý bằng SO2 và vi khuẩn lactic để hạt tinh bột mềm ra và enzyme sẽ được sử dụng sau khi bột đã được hòa tan vào nước

Ở giai đoạn gia nhiệt người ta cũng cho một lượng nhỏ α-amylase vào để dịch tinh bột có

độ nhớt thấp tránh hiện tượng cháy khét Sau đó cho lượng còn lại vào giai đoạn đường hóa, các enzyme này giúp cho quá trình đường hóa rất dễ dàng Tăng hiệu suất thu hồi sản phẩm

Trang 28

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP

THÍ NGHIỆM 3.1 Phương tiện thí nghiệm

Trang 29

3.2 Phương pháp thí nghiệm

trình thuỷ phân tinh bột

Nhằm rút ngắn thời gian sản xuất và nâng cao hiệu suất sản xuất

A2 : glucoamylase từ vi khuẩn Bacillus và nấm mốc Aspergillus

A3 : glucoamylase từ nấm mốc Aspergillus niger

Ta có tổng số ml cho mỗi ống nghiệm là 6ml Ủ 2 ống nghiệm ở nhiệt độ 500C trong thời gian 5 phút Lấy 0,5ml dung dịch trong mỗi ống nghiệm thêm vào 5ml HCl 0,1N để phản

Trang 30

ứng dừng lại Tiếp tục lấy 0,5ml trong mỗi ống nghiệm và 5ml dung dịch iod cho vào 2 ống nghiệm, lắc kỹ Đo độ hấp thụ ở bước sống 620nm

- Tính vận tốc phản ứng: gọi Ao – độ hấp thụ đọc trên máy của mẫu ban đầu (mẫu đối chứng); A1 – độ hấp thụ đọc trên máy của mẫu thủy phân trong 5 phút

Ao a mg tinh bột

Ao – A1

o

o A

A

* a (số mg tinh bột bị thủy phân trong

khoảng thời gian t) Định nghĩa vận tốc phản ứng là số mg tinh bột bị thủy phân trong thời gian 1 phút

Công thức tính:

t

a A

A A o

o