phƣơng pháp multiplex PCR
Hơn một thập kỉ qua, sau khi ra đời phƣơng pháp PCR nói chung và multiplex PCR nói riêng đã đƣợc sử dụng rộng rãi để phát hiện hay phân biệt DNA các sinh vật khác nhau từ nhiều nguồn mẫu. Vì vậy phƣơng pháp multiplex PCR cũng đã đƣợc nhiều nhà nghiên cứu sử dụng trong việc phân biệt loài động vật trong thịt chế biến.
Năm 1997, Wayne và ctv đã có công trình nghiên cứu về trình tự mtDNA
dài2001 bp của 23 dòng chó. Kết quả nghiên cứu cho thấy trên mtDNA có trình tự bảo toàn cho cả 23 dòng chó.
Tại Hoa Kỳ, Sawyer (1997) đã tìm ra một phƣơng pháp nhanh và nhạy để xác định và ngăn chặn tình trạng nhập khẩu bò nhiễm BSE. Tác giả đã xây dựng quy trình PCR phát hiện thịt bò trong thịt và bột thịt xƣơng dựa trên đoạn gen bảo tồn của mtDNA bò (B – mtDNA).
Năm 1998, Matsugana đã công bố công trình nghiên cứu phát hiện 6 loại thịt (bò, heo, gà, cừu, dê, ngựa) từ thịt chế biến. Tác giả sử dụng 7 đoạn mồi với tỉ lệ thích hợp để phát hiện DNA chuyên biệt cho từng loài. Mồi xuôi đƣợc thiết kế dựa trên trình tự DNA bảo toàn của gen mtDNA, còn mồi ngƣợc đƣợc thết kế dựa vào trình tự chuyên biệt ở mỗi loài. Các cặp mồi này cho các sản phẩm PCR có kích thƣớc khác nhau tƣơng ứng với 6 loại thịt. Các đoạn DNA của dê, gà, bò, cừu, heo, ngựa lần lƣợt có khích thƣớc: 157, 227, 274, 331, 398, 439 bp. Kết quả PCR đƣợc quan sát bằng điện di. DNA của dê, gà, bò, cừu, heo đƣợc phát hiện cả đối với DNA tách chiết từ thịt xử lý nhiệt ở 1000
C hay 1200C, riêng đối với thịt ngựa thì không phát hiện đƣợc ở 1200C. Giới hạn nhỏ nhất của nồng độ DNA mà phản ứng PCR còn phát hiện đƣợc là 0,25 ng.
Năm 2000, Montiel-Sosa và ctv đã thiết kế cặp mồi có tính chuyên biệt cao trên đoạn bảo tồn của gen mtDNA. Cặp mồi này đƣợc dùng để khuếch đại đoạn DNA dài 531bp của gia cầm bằng phƣơng pháp PCR. Phƣơng pháp này tỏ ra hữu dụng đối với cả thịt tƣơi và hỗn hợp thịt chế biến bao gồm thịt phơi khô và thịt nấu chín từ bò, cừu, gà.
Năm 2004, Myers và ctv cũng đã dựa vào đoạn mtDNA để thiết lập phản ứng multiplex PCR nhằm phát hiện thịt các loài bò, heo, cừu, dê, ngựa trong thức ăn chó. Giới hạn DNA để phát hiện là 1 g/kg. Kết quả cho thấy chỉ có 27 mẫu trong tổng số 31 mẫu là chứa thịt bò và heo (các mẫu thức ăn chó đƣợc ghi trên nhãn là chỉ gồm thịt bò và heo).
Chƣơng 3
NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU