* Qui trình tách chiết
Sau khi rã đông mẫu ở nhiệt độ phòng, tách chiết DNA theo dẫn liệu của Lƣơng Quý Phƣơng (2006).
1. Cho khoảng 0,1 g mẫu vào eppendorf 1,5 ml. Dùng chày nghiền nhuyễn mẫu.
2. Cho vào 60 µl dung dịch đệm tách chiết (50 mM Tris-HCl, 20 mM NaCl, 1 mM EDTA và 1% SDS, pH= 8) và 3 µl dung dịch protease K (20 mg/ml). Ủ hỗn hợp ở 55o
3. Cho vào 375 µl nƣớc cất khử ion vô trùng; vortex 14000 vòng/phút trong 30 giây. Cho thêm 200 µl dung dịch hỗn hợp phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1); vortex 14000 vòng/phút trong 1 phút; ly tâm 12000 vòng/phút trong 2 phút ở 10o
C.
4. Lấy phần nƣớc nổi bên trên chuyển vào eppendorf 1,5 ml mới đã có sẵn 1 ml dung dịch cồn tuyệt đối; trộn đều; ủ – 20oC trong 1 giờ.
5. Ly tâm 12000 vòng/phút trong 2 phút ở 10oC; lấy cặn làm ráo.
6. Rửa cặn bằng 1ml ethanol 70 %, ly tâm 12000 vòng/phút trong 2 phút ở 10oC, lấy cặn.
7. Làm khô cặn trong tủ ấm ở 55o
C.
8. Hòa tan cặn bằng 200 µl dung dịch TE; ủ 55oC trong 2 giờ.
Sản phẩm DNA sau khi tách chiết đƣợc trữ ở – 20oC hoặc sử dụng ngay. Kiểm tra độ tinh sạch DNA bằng cách đo mật độ quang (OD: optical density) ở bƣớc sóng 260 nm và 280 nm bằng quang phổ kế (model HP 8453). Hàm lƣợng DNA đƣợc ƣớc lƣợng theo công thức DNA (ng/μl) = 62,9*OD260nm – 36*OD280nm. Các mẫu DNA tách chiết có tỷ số OD260 nm/OD280 nm (tỷ số OD) trên 1,6 đƣợc sử dụng cho PCR.
Sau khi đo OD, chúng tôi pha loãng mẫu đến nồng độ 100 ng/ l. Kết quả OD đƣợc xử ký bằng phần mền Statgraphics Version 7.0.
3.4.4 Thực hiện phản ứng s-PCR
Để tìm quy trình PCR phù hợp cho việc xác định 3 loại thịt heo, bò, cừu trong hỗn hợp thịt, đầu tiên chúng tôi thử nghiệm phản ứng s-PCR theo quy trình của Matsugana và ctv (1998).
Bảng 3. 2 Thành phần hóa chất PCR
Tên hóa chất Nồng độ cuối
Dung dịch đệm PCR 1X
MgCl2 1,5 mM
FSIM 0,4 M
reversal Tùy mỗi loại thịt (bảng 3.3)
dNTP 200 µM/mỗi loại
Taq 1,25 UI
DNA mỗi loại 100 ng /phản ứng
H2O cất vừa đủ 50 µl
Bảng 3. 3 Nồng độ mồi ngƣợc đối với mỗi loại thịt trong s-PCR
Tên mồi Nồng độ mồi ( M)
RP 0,24
RB 0,24
RS 1,2
Và có chu trình nhiệt nhƣ bảng 3.4.
Bảng 3. 4 Chu trình nhiệt của phản ứng Giai
đoạn Diễn giải Nhiệt độ
1 Tiền biến tính 940C trong 4 phút
2 Lặp lại 35 chu kỳ Biến tính Bắt cặp Kéo dài 940C trong 30 giây. 600C trong 30 giây 720C trong 30 giây 3 Kéo dài cuối cùng 720C trong 5 phút
3.4.5 Tối ƣu hóa phản ứng m-PCR
3.4.5.1 Thực hiện m-PCR theo quy trình của Matsugana và ctv (1998)
Đầu tiên, chúng tôi thực hiện phản ứng m-PCR theo quy trình của Matsugana và ctv (1998). Thành phần phản ứng đƣợc trình bày ở bảng 3.5.
Bảng 3. 5 Thành phần hóa chất PCR
Tên hóa chất Nồng độ cuối
Dung dịch đệm PCR 1X MgCl2 1,5 mM FSIM 0,4 M RP 0,24 M RB 0,24 M RS 1,2 M dNTP 200 µM/mỗi loại Taq 1,25 UI
DNA tổng số (hỗn hợp heo, bò, cừu) 100 ng /phản ứng
H2O cất vừa đủ 50 µl
Chu trình nhiệt của phản ứng tƣơng tự bảng 3.4
Chúng tôi thực hiện lặp lại 3 lần để khẳng định quy trình.