CÁC PHƢƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ CÂY CHUY ỂN GEN Ở MỨC ĐỘ PHÒNG THÍ NGHIỆM

Công nghệ sinh học hiện đại sử dụng kỹ thuật di truy ền đã đóng góp đáng kể trong việc cải tạo năng suất chất lượng cây trồng

MỞ ĐẦU Công nghệ sinh học đại sử dụng kỹ thuật di truyền đóng góp đáng kể việc cải tạo suất chất lượng trồng Hiện có nhiều trồng sản phẩm công nghệ sinh học thương mại giới khẳng định tiềm khả phát triển lĩnh vực Trong kỹ thuật ứng dụng công nghệ sinh học vào nâng cao suất, chất lượng giống không kể đến kỹ thuật chuyển gen thực vật Ngày kỹ thuật chuyển gen áp dụng rộng rãi việc chuyển gen hữu ích vào trồng tạo trồng có nhiều ưu điểm vượt trội hẳn so với loài ban đầu Trong khoảng thời gian từ năm 1996 đến năm 2005, tỷ lệ diện tích trồng chuyển gen nước phát triển tăng hàng năm, từ 1,7 triệu hecta (1996) lên 90 triệu hecta (2005) chiếm 1/3 diện tích đất trồng nơng nghiệp Điều cho thấy ngày có nhiều nông dân nước phát triển phát triển chấp nhận trồng chuyển gen Số nước trồng biến đổi gen tăng gấp lần vòng năm (từ nước năm 1996 đến 21 nước năm 2005) (James, 2007) Kỹ thuật chuyển gen thực vật cho phép đưa nhiều gen có đặc điểm ưu việt từ lồi khác di truyền vào gen nhận thời gian ngắn Có nhiều phương pháp chuyển gen vào thực vật thử nghiệm nhiên phương pháp sử dụng rộng rãi chuyển gen súng bắn gen chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefacien Chuyển gen thơng qua vi khuẩn có ưu điểm dễ tiến hành, khả chuyển nạp cao tiết kiệm chi phí tiến hành hầu khắp phịng thí nghiệm Có nhiều quy trình chuyển gen xây dựng cho nhiều loại trồng khác thuốc lá, cà chua, khoai tây, mía, sắn… Một quy trình chuyển gen thực vật bao gồm bước sau: (1) Phân lập gen mong muốn từ sinh vật bất kỳ; (2) Tạo dòng thiết kế vector chuyển gen mang đoạn gen mong muốn đó; (3) Biến nạp vector chuyển gen vào thực vật nhận (4) Chọn lọc, phân tích biểu gen chuyển Chuyển gen hiểu đẩy đủ là: (i) gen ngoại lai (gen chuyển) phải dung hợp vào hệ gen tế bào chủ; (ii) gen chuyển phải biểu tế bào chủ; (iii) gen chuyển phải di truyền cho hệ sau, hệ sản phẩm gen chuyển phải biểu hiện; (iv) sản phẩm biểu gen chuyển phải thể chức sinh học Chính q trình chọn lọc, phân tích chuyển gen hệ thực theo ba nội dung sau: (1) Xác định có mặt gen chuyển tế bào chủ (cây mang gen chuyển); (2) Kiểm tra biểu gen chuyển thông qua xác định sản phẩm biểu mRNA protein; (3) Phân tích chức sinh học gen chuyển Mỗi nội dung có phương pháp, kỹ thuật phân tích tương ứng, phù hợp thực tiễn tiến hành phương pháp phịng thí nghiệm, nhà lưới đồng ruộng Qua hệ, cần phân tích, đánh giá xác định đặc điểm di truyền gen chuyển (sự di truyền, phân ly), phân tích đặc tính di truyền chuyển gen Hình Mô tả bước tiến hành phương pháp phân tích chuyển gen CÁC PHƢƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ CÂY CHUYỂN GEN Ở MỨC ĐỘ PHỊNG THÍ NGHIỆM Việc xác định nguyên liệu thu từ hệ thống tái sinh sau biến nạp gen có phải chuyển gen hay không cần thiết phải tiến hành Trước hết, chọn lọc mô, chuyển gen thị chọn lọc dựa vào gen thị phải tiến hành Sau đó, sử dụng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu gen chuyển để xác định có mặt gen tế bào chuyển gen Muốn xác định số copy đưa vào genome tái sinh phải thực phép lai phân tử Southern mà mẫu dò đoạn gen chuyển đánh dấu huỳnh quang DNA nhân cao phân tử tách từ chuyển gen Xác định gen chuyển có phiên mã sang mRNA hay khơng thực RTPCR với cặp mồi đặc hiệu gen chuyển khuôn cDNA từ RNA tổng số cần kiểm tra lai Northern mẫu dò đoạn DNA gen đánh dấu huỳnh quang RNA toàn phần mô chuyển gen Và bước cuối xác định gen chuyển có biểu tạo sản phẩm cuối kỹ thuật lai Western protein chuyển gen kháng thể đặc hiệu với protein tinh từ nguồn khác 1.1 ĐÁNH GIÁ CÂY CHUYỂN GEN BẰNG TÍNH KHÁNG CHẤT CHỌN LỌC Hầu hết vector chuyển gen thiết kế hệ thống gen chọn lọc kèm theo gen đích cho phép sàng lọc mơ, mang gen giai đoạn sớm biểu kháng gen với chất chọn lọc Các gen chọn lọc gen kháng kháng sinh, kháng thuốc diệt cỏ, gen thị màu gen chuyển hóa chất chọn lọc Thực chất phân tích tính kháng chất chọn lọc (kháng sinh, chất diệt cỏ) chọn dịng tế bào, mơ mang tính kháng với chất chọn lọc thông qua hoạt động gen chuyển Chất chọn lọc kháng sinh kanamycine dùng gen nptII hay hygromycine dùng gen hpt thuốc diệt cỏ basta dùng gen bar Bước phân tích áp dụng cho giai đoạn sau biến nạp từ trạng thái đơn bào đến mơ sẹo, chồi tái sinh hồn chỉnh hay non gieo từ hạt Cách thức tiến hành đơn giản: bổ sung chất theo nồng độ định vào môi trường nuôi cấy quan sát ảnh hưởng chất chọn lọc lên mô Biểu thường thấy mô không mang gen khả tạo lục lạp sau chuyển nâu đen chết (hình 2.1(B)) Cịn chồi tạo rễ không mang gen chuyển chuyển sang mơi trường có nồng độ chất kích thích rễ cao rễ nhạy cảm với chất chọn lọc Hình 1.1 Mơ sẹo cao lương chuyển gen (A) đối chứng (B) mơi trường có chất chọn lọc (Tuong Van Nguyen, 2008) Phương pháp thử tính kháng chất chọn lọc phát triển thành phương pháp tạo vết cháy Chất chọn lọc sử dụng với nồng độ cao khoảng – lần so với thử in vitro thường bổ sung thêm Twin 20 để tăng khả bám dính bề mặt sau dùng bút lơng qt lên cần thử, dùng sợi bơng kích thước lớn bình thường, thấm dịch thuốc vắt sợi qua nhiều nhiều Sau – ngày thấy nơi bôi thuốc sợi vắt qua khơng mang gen kháng thuốc hình thành vết trắng nâu mặt bị diệp lục Để đảm bảo xác phương pháp thường tiến hành lặp lại – lần (b) (a) Hình 1.2 Thử tính kháng kanamycin bơng chuyển gen tạo vết cháy (Lê Trần Bình, 2008) (a) bơng chuyển gen; (b) đối chứng Ngồi ra, Việc đưa gen thị mã hóa cho enzyme vector chuyển gen cho phép dễ dàng nhận biết mẫu mang gen nhuộm chất màu Hệ thống GUS (gus, gusA uidA) mã hóa cho protein β-glucuronidase phân tử homotetramer lần phân lập từ E coli (Jefferson et al., 1986) β-glucuronidase thường sử dụng làm thị chọn lọc để nhận biết chuyển gen ưu điểm dễ nhận biết thơng qua nhuộm màu, phản ứng có độ nhạy ổn định cao đồng thời dễ tiến hành định lượng Ngày nay, việc sử dụng GUS chuyển gen thực vật ngày tiến hành rộng rãi Nhất thí nghiệm khảo sát quy trình chuyển gen vào giống 2004) Hình 1.3 Biểu gen GUS mô chuyển gen (A) đối chứng không chuyển gen (B) (Đỗ Tiến phát cs., 2008) (Đỗ Tiến Phát cs, 2008; Lopez et al., Ngay sau GUS đưa vào thử nghiệm nhận biết chuyển gen, nhanh chóng phát triển thành hệ thống thị cho nhiều đối tượng chuyển gen thực vật (Jefferson et al., 1987) ngồi tính nhạy bền enzyme cịn dễ dàng thực kỹ thuật khối phổ, so màu phân tích tế bào học Hơn khơng có hoạt động GUS ghi nhận hầu hết mô thực vật bậc cao (Jefferson et al., 1987, Hu et al., 1990; Kosugi et al., 1990; Muhich, 1998) Trong thực vật GUS hoạt động gen hỗn hợp nhờ promoter khởi động trình mã trình tự uidA điều chỉnh biểu gen Sự biểu gen nhận diện chất có tên 5-bromo-4-chloro-3indolyl-β-D-glucuronide (X-Gluc) 4-methyl-umbelliferyl-β-D-glucuronide (MUG) thời gian ngắn Một vài hạn chế ghi nhận sau xác định hoạt động GUS mô chuyển gen là: hoạt tính (Hu et al., 1990; Thomasset et al., 1996), thường khuếch tán sản phẩm phản ứng hoạt động chất nội sinh; Tính tự phát sáng (Thomasset et al., 1996), dập tắt im lặng (Serres et al., 1997) nhiễm khuẩn Gần đây, hệ thống chọn lọc khác xem “tích cực” thay hệ thống chọn lọc dựa kháng sinh, chất diệt cỏ… chất sử dụng chọn lọc thân khơng gây độc cho thực vật hồn tồn khơng có hoạt động sinh học Trong hệ thống chọn lọc tích cực, gen mã hóa enzyme đưa vào vector chuyển gen cho phép thực vật chuyển gen sử dụng hợp chất chọn lọc môi trường để sinh trưởng, tế bào không mang gen không sinh trưởng sinh trưởng chậm mơi trường có chất chọn lọc Một ví dụ hệ thống chọn lọc tích cực cung cấp Joersbo Okkels Nghiên cứu thử nghiệm với thuốc chuyển gen mã hóa β-glucuronidase biến nạp gen vào thông qua Agrobacterim tumefaciens Chất cytokinin glucuronide cung cấp dạng chất bổ sung vào môi trường nuôi cấy Chỉ tế bào biểu GUS chuyển hóa cytokinin glucuronide, tế bào tăng sinh biệt hóa thành rễ tế bào khơng có hoạt động GUS khơng có tượng (Joersbo & Okkels, 1996) Rất nhanh sau đó, hệ thống chọn lọc tích cực chuyển gen phát triển không sử dụng chất liên quan đến hormone thực vật mà chất nguồn carbonhydrate nitơ, chất cần thiết nuôi cấy mô Hệ thống chọn lọc sử dụng carbonhydrate hệ thống chọn lọc tích cực phổ biến dễ dàng thực vật sinh trưởng mơi trường ni cấy địi hỏi có mặt nguồn carbon Hơn nữa, hầu hết nguồn carbon thường dễ kiếm, rẻ thu nhận từ nhiều nguồn sucrose, glucose maltose Nếu đưa nguồn carbon thay cho carbon thực vật sử dụng vào môi trường, phần lớn trường hợp nghiên cứu, tế bào thực vật khơng có khả phát triển chết hợp chất chuyển hóa tạo sản phẩm trung gian làm thực vật nuôi cấy sử dụng để phát triển Ví dụ manose dùng làm chất chọn lọc nhanh chóng chuyển hóa thành manose-6-phosphate (M6P), chất thực vật hấp thụ chuyển hóa, hoạt động hexokinase Trong trường hợp này, thực vật có mang gen manA E.coli mã hóa cho phosphomanose isomerase (PMI) PMI chuyển hóa M6P thành fructose-6-phosphate Hệ thống chọn lọc PMI triển khai hiệu tiến hành chuyển gen vào củ cải đường, ngơ, lúa, lúa mì, Arabidopsis (Joersbo et al., 1998; Negrotto et al., 2000; Wang et al., 2000; Wringht et al., 2001; Lucca & Potrykus, 2001) nhiều thực vật hai mầm mầm khác Hiện nay, hai hệ thống chọn lọc tích cực khơng tích cực sử dụng chuyển gen thực vật (Brasileiro & Aragao, 2001) Phương pháp chọn lọc, phân tích chuyển gen chất chọn lọc dễ thực hiện, chi phí thấp nhiên phương pháp sử dụng ban đầu để loại bớt không mang gen quần thể tái sinh sau nuôi cấy phương pháp khơng cho biết gen cần chuyển đưa vào hay chưa, gen đưa vào có hoạt động khơng… Chính cần phải có phân tích sâu mức độ phân tử 1.2 PHÂN TÍCH CÂY CHUYỂN GEN BẰNG SINH HỌC PHÂN TỬ Trên nguyên tắc gen ngoại lai biến nạp vào tế bào tồn tế bào chủ trạng thái: (1) Tạm thời dạng DNA tự do; (2) Lâu dài dạng thể plasmid độc lập tự nhân (3) ổn định đoạn DNA genome tế bào chủ nhân lên theo dạng tương hợp hay không tương hợp Đây trạng thái mong muốn tạo chuyển gen tính bền vững thể biến nạp, hồn tồn phụ thuộc vào trình tái tổ hợp Hầu hết nghiên cứu biến nạp gen thuộc nhân phát thấy tượng nhân không tương hợp gen lạ hòa đồng vào DNA nhân vị trí đoạn gen lạ ghép nối ảnh hưởng đến biểu hay gen chủ gần Chính thế, phương pháp sinh học phân tử nhằm xác định có mặt gen biểu gen tế bào bước làm cần thiết 1.2.1 Phân tích chuyển gen kỹ thuật PCR PCR (Polymerase chain reaction) Kary B Mullis phát năm 1983 Đây phương pháp ống nghiệm để tổng hợp trình tự DNA đặc hiệu nhờ enzyme, sử dụng hai mồi oligonucleotide để khuếch đại vùng DNA quan tâm nằm hai mồi cách lặp lại nhiều chu kỳ với bước biến tính mạch DNA khn, bắt cặp mồi kéo dài sợi Kỹ thuật PCR đơn giản dễ thực với hầu hết phịng thí nghiệm trang bị máy PCR Trong phân tích chuyển gen, gen chuyển biết trình cần sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho gen tách chiết DNA từ mẫu thực vật cần xác định làm khn tiến hành PCR Sử dụng plasmid mang gen chuyển làm đối chứng, sản phẩm PCR điện di có kích thước dự kiến với đối chứng mẫu phân tíc coi dương tính Tuy nhiên, PCR dương tính khơng đồng nghĩa với chuyển gen thành cơng có nhiều cách để giải thích có mặt DNA mẫu phân tích: (1) Vi khuẩn A tumefaciens mang gen chuyển cịn tồn khối mô hay gian bào mẫu phân tích Hiện tượng xuất nhiều loại đối tượng gọi dương tính giả Nếu mẫu phân tích thực vật qua nhân giống hữu tính tức qua vài hệ tượng loại trừ (2) Gen chuyển tồn tự tế bào chất (có thể biến qua sinh sản hữu tính) (3) Gen chuyển không hoạt động, tức không phiên mã biểu protein có chức sinh học Chính lý mà kết PCR có giá trị định hướng ban đầu phân tích chuyển gen Tuy nhiên, kỹ thuật PCR lại tỏ hữu dụng việc phân tích phát mẫu lương thực phực phẩm biến đổi gen (genetic modify origanismGMO) Để phục vụ việc xác định GMO, PCR phát triển thành kỹ thuật multiplex PCR (MPCR) (Matsuoka et al., 2001) Với việc sử dụng đồng thời nhiều cặp mồi nhận biết gen khác (promoter, terminator, gen chọn lọc, gen đích…) phản ứng, MPCR cho phép phát đồng thời nhiều trình tự đích mẫu có mang gen Thơng thường cặp mồi sử dụng multiplex PCR mồi P35S, TNOS, NPT-II, GUS, EPSPS Nếu kết dương tính với cặp mồi mẫu cần xác định chuyển gen 1.2.2 Phƣơng pháp xác định số copy chuyển gen Lai Southern để xác định số copy chuyển gen phương pháp tin cậy thông dụng Ngoài việc khẳng định tồn gen chuyển genome nhận thông qua lai DNA tổng số mẫu phân tích với DNA mẫu dị cho biết số lượng đưa vào Mẫu dị đoạn gen chuyển có kích thước từ 100 – 300 bp đánh dấu phóng xạ hay huỳnh quang Các bước kỹ thuật Southern bao gồm: (1) tách chiết DNA tổng số mẫu cần phân tích; (2) Xử lý DNA tổng số với – enzyme giới hạn mà điểm cắt không nằm gen; (3) Điện di gel agarose; (4) chuyển lên màng nitrosocellulose hay gọi blotting; (5) Tổng hợp sợi DNA mẫu dò có đánh dấu phóng xạ hay huỳnh quang PCR với mồi ngẫu nhiên; (6) Lai mẫu dò với màng DNA (7) Hiển thị phim X quang phân tích kết Hình 1.4 Mơ tả bước kỹ thuật lai Hình 1.5 Kết lai Southern southern hai dòng cao lương chuyển gen SB1 SB4 (Tuong Van Nguyen, 2008) Hình 1.5 hiển thị kết lai southern hai dòng cao lương chuyển gen SB1 SB4 (Tuong Van Nguyen, 2008) cho thấy dòng SB4 xuất vạch SB1 xuất nhiều vạch sản phầm lai điều có nghĩa dịng SB4 có gen chuyển genome, kết mong muốn chuyển gen vào thực vật Gần đây, kỹ thuật thường sử dụng để hỗ trợ cho lai Southern việc phát số copy chuyển gen Quantitave real-time PCR (QPCR) Q-PCR tiến hành đồng thời nhiều mẫu cần phân tích, ngồi cịn dễ thực hiện, tiết kiệm ngun liệu, chi phí cơng sức (James et al., 2002; Bubner et al., 2004) Real-time PCR khuếch đại DNA diễn theo chu kỳ nhiệt theo dõi trực tiếp gồm trình diễn đồng thời: (1) Khuếch đại DNA PCR (2) Đo độ phát quang tỷ lệ thuận với số lượng phân đoạn DNA tạo thành Nguyên lý chủ yếu real-time PCR dựa sở phát định lượng thể thông báo huỳnh quang Hàm lượng sản phẩm PCR bắt đầu tăng cao lên từ chu kỳ ngưỡng tương quan chặt chẽ với hàm lượng DNA khuôn ban đầu Có nhiều chất huỳnh quang tìm sử dụng rộng rãi Một số chất sử dụng rộng rãi TaqMan TaqMan realtime PCR kỹ thuật tích lũy sản phẩm PCR kiểm tra có mặt phát sáng huỳnh quang phản ứng Tức là, thí nghiệm TaqMan, mẫu dị đánh dấu đầu (TaqMan) thiết kế để lai với đoạn trình tự hai mồi Mẫu dị tổng hợp với đầu 5‟ phát quang đầu 3‟ có hoạt tính dập tắt huỳnh quang Khi mẫu dị cịn ngun vẹn chất phát từ chất phát huỳnh quang bị dập tắt đầu dập tắt hiệu ứng huỳnh quang thấp không nhận biết Trong chu kỳ phản ứng PCR, polymerase kéo dài từ mồi bắt gặp đoạn lai phân cắt mẫu dò từ 5‟-3‟ nhờ hoạt động exonuclease Taq polymerase Mẫu dị giải phóng chất huỳnh quang phát quang Kết phát quang định lượng sau phản ứng có liên quan đến lượng sản phẩm PCR tích lũy Hình 1.6 Mơ tả phương pháp TaqMan định lượng sản phẩm PCR Để sử dụng real-time PCR xác định số copy chuyển gen người ta dựa vào mối tương quan giá trị Ct (chu kỳ ngưỡng) số copy DNA mẫu ban đầu Có nhiều phương pháp khác thử nghiệm, dựa vào Ct đo với đường chuẩn thu từ nồng độ pha loãng khác plasmid mang trình tự gen chuyển mà biết trọng lượng phân tử nồng độ DNA xác từ tính tương đối số copy mẫu cần kiểm tra Hoặc phương pháp tương đối hiệu việc xác định số copy real-time PCR phương pháp dựa vào giá trị Ct tương đối (2-ΔΔCt) (Ingham et al., 2001; Bubner et al., 2004) Phương pháp dựa vào ΔCt độ chênh lệch Ct chuyển gen (Ctt) Ct mẫu chuẩn mẫu mang gen nội sinh mà biết có copy (Cte) Trong phản ứng với hiệu suất cách làm chuẩn nồng độ DNA ban đầu đưa vào phản ứng, tất mẫu có giá trị ΔCt với mẫu chuẩn chứa gen chuyển 1.2.3 Phân tích biểu gen 10 Nghiên cứu biểu gen chuyển cần thiết mục đích chuyển gen, gen đưa vào genome mà khơng biểu coi khơng có giá trị Biểu gen sinh học phân tử trình hoạt động gen để tạo sản phẩm cuối protein Quá trình biểu gen thể qua hai giai đoạn: (1) Phiên mã từ DNA sang mRNA (2) Dịch mã từ mRNA tổng hợp phân tử protein thông qua máy ribosome Để xác định có mặt sản phẩm phiên mã thực phép lai Northern, RT-PCR lai in situ (lai chỗ) cịn muốn đánh giá có mặt protein gen chuyển tạo thực số kỹ thuật khác kỹ thuật lai Western, ELISA kỹ thuật phát hoạt động protein (hoặc enzyme) Phƣơng pháp xác định biểu gen qua mRNA Northern blot kỹ thuật sử dụng sinh học phân tử để nghiên cứu biểu phiên mã gen cách phát RNA mẫu nghiên cứu (Kevil et al., 1997) Kỹ thuật lai Northern cho phép tìm hiểu hoạt động điều khiển tế bào qua cấu trúc chức cách xác định mức độ biểu gen thành phần suốt q trình biệt hóa, tạo điều kiện bất thường stress (Schlamp et al., 2008) Kỹ thuật nghiên cứu phát triển từ năm 1977 (Alwine et al., 1977) nhanh chóng trở thành cơng cụ hỗ trợ hữu hiệu phân tích chuyển gen Hầu hết cơng trình nghiên cứu chuyển gen sử dụng kỹ thuật để phát mRNA dòng chuyển gen Về nguyên lý Northern blot dựa tính cặp đơi base bổ sung sợi nucleic acid Sounthern blot Trong phương pháp này, RNA tổng số tách chiết điện di gel agarose, sau thấm truyền lên màng lai nitrosocellulose với mẫu dò đặc biệt tổng hợp PCR từ gen cần tìm với mồi ngẫu nhiên dài khoảng nucleotide Các mẫu dị bám lên sợi đơn RNA sợi đơi DNA Nếu kết dương tính, màng lai xuất băng sản phẩm lai Gen phiên mã mạnh tín hiệu lai rõ Hình 1.6 mơ tả kết lai Northern dòng cao lương SB1 SB4 chuyển gen hệ T1(Tuong Van Nguyen, 2008) Kết lai cho thấy vạch lai dòng SB1 đậm dòng SB4 đồng nghĩa với lượng mRNA nhiều điều hoạt động phiên mã gen dịng SB1 mạnh 11 Hình 1.7 (A) Kết lai Northern dòng cao lương SB1 SB4 chuyển gen hệ T1; (B) RNA tổng số (Tuong Van Nguyen, 2008) RT-PCR (Reverse transcription polymerase chain reaction) kỹ thuật cho phép phát nhanh biểu gen chuyển gen, đặc biệt trình tự gen chuyển có độ tương đồng thấp với gen nội sinh genome chủ Về kỹ thuật PCR khuôn để chạy phản ứng cDNA tổng hợp từ RNA tổng số RT-PCR gồm có bước sau: (1) Tách chiết RNA tổng số từ mẫu cần phân tích; (2) Tổng hợp cDNA khuôn RNA nhờ enzyme phiên mã ngược, bước quan trọng để thực RTPCR DNA polymerase hoạt động khuôn DNA; (3) thực phản ứng PCR với mồi đặc hiệu để khuếch đại đoạn gen quan tâm Hạn chế TRPCR việc định lượng kiểm tra khả hoạt động gen chuyển, ngồi cho kết dương tính giả bắt cặp khơng đặc hiệu mồi Hạn chế khắc phục cách sử dụng kỹ thuật real-time RTPCR phát triển từ kỹ thuật real-time PCR Real-time RT-PCR kỹ thuật với độ nhạy cao cho phép định lượng số copy mRNA gen đặc hiệu (Freeman et al., 1999) Lai chỗ (In situ hybridization ) kỹ thuật xác định phần tử chuyển gen phận khác chuyển gen, nhận biết định vị q trình phiên mã mô khác Kỹ thuật đặc biệt giá trị mô phát triển promoter sử dụng đặc hiệu để biểu gen chuyển mơ Lai in situ tiến hành cách lai sợi đơn đánh dấu (mẫu dị) bổ sung với trình tự mRNA đặc hiệu mảnh mô quan thực vật Chỗ mô cắt từ chuyển gen cố định nhiệt độ lạnh nhanh sau gắn vào màng lai methacrylate lai với mẫu dò Mẫu dò sử dụng sợi đơn có trình tự bổ sung với mRNA 12 đánh dấu DIG (Angerer et al., 1987) Kỹ thuật cho pháp phát đồng thời gen khác mẫu mơ (gen chọn lọc gen đích) cách xen kẽ hai chất màu nhận biết để đánh dấu cho mẫu dò RNA đặc hiệu với gen (Long & Rebagliati, 2002; Lee et al., 2000) Phƣơng pháp xác định biểu protein Kỹ thuật lai Western kỹ thuật sử dụng rộng rãi phân tích để phát protein dựa nguyên lý phản ứng miễn dịch kháng nguyên (là sản phẩm protein cần tìm) kháng thể đặc hiệu kháng nguyên Để tiến hành kỹ thuật này, trước hết protein toàn phần tách chiết từ mẫu cần phân tích, sau điện di gel polyacrylamid (PAGE) thấm truyền protein lên màng lai nitrosocellulose sau lai với kháng thể tổng hợp từ trước nhờ kháng nguyên gốc tinh hay kháng nguyên tái tổ hợp thông qua kỹ thuật sản xuất kháng thể đơn dịng hay đa dịng Q trình hiển thị sản phẩm lai thực thơng qua phản ứng tạo màu với phosphatase kiềm hay phim thông qua phản ứng quang ECL Để phát protein chuyển gen, người ta sử dụng kỹ thuật ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) Đây kỹ thuật sinh hóa để phát kháng thể kháng nguyên mẫu xét nghiệm với độ nhạy cao Elisa sử dụng nhiều lĩnh vựu nghiên cứu y học, nơng nghiệp kiểm tra an tồn chất lượng sản phẩm sinh học Nguyên lý Elisa dựa vào phản ứng kháng nguyên – kháng thể tiến hành pha rắn gồm bước sau: (1) Kháng nguyên chưa biết gắn lên bề mặt; (2) Kháng thể biết gắn kết với enzyme tráng qua bề mặt đó; (3) Thêm vào chất để enzyme chuyển hóa để tạo tín hiệu xác định máy nhận biết mắt thường Trong nghiên cứu có phương pháp để tiến hành Elisa bao gồm Elisa gián tiếp, sanwich Elisa Elisa cạnh tranh Mỗi phương pháp có ưu điểm riêng tùy điều kiện sử dụng phương pháp Trong nghiên cứu chuyển gen thực vật Elisa thường dùng để nhận biết có mặt protein mã hóa gen chuyển để đánh giá sơ mức độ biểu gen Ngồi thực vật chuyển gen kháng virus, kỹ thuật sử dụng để kiểm tra mức độ kháng dịng chuyển gen thơng qua lượng virus suy giảm sau thời gian lấy nhiễm dòng chuyển gen đối chứng (Phạm Thị Vân, 2009) 13 CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH SỬ DỤNG TRONG NHÀ LƢỚI VÀ ĐỒNG RUỘNG 2.1 PHÂN TÍCH CHỨC NĂNG SINH HỌC CỦA GEN CHUYỂN Sau khẳng định nguyên liệu tạo chuyển gen thực thông qua kỹ thuật sinh học phân tử phịng thí nghiệm, bước phải xác định phương thức, đặc điểm di truyền gen chuyển tính trạng gen chuyển mã hóa đồng thời kiểm tra mức độ đồng hợp tử hệ chúng cách lai chéo hay tự phối lai phân tích Biến nạp gen với mục đích cuối đưa tính trạng mong muốn vào trồng, bước phân tích trực tiếp tính trạng bước có giá trị định cuối Các gen chuyển thuộc nhiều nhóm khác phương pháp phân tích khác phụ thuộc vào tính trạng quan tâm gồm nhóm tính trạng sau: 2.1.1 Phân tích tính kháng bệnh Sâu bệnh nguyên nhân làm suy giảm nghiêm trọng đến suất chất lượng trồng (Levine, 2007) Nghiên cứu tạo giống có đặc tính kháng bệnh nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu thu nhiều thành tựu đáng kể (He et al., 2009; Jackson et al., 2004; Kahs et al., 2008) Trong nghiên cứu tạo kháng bệnh, tính kháng virus, vi khuẩn, nấm hay kháng sâu thường thử hình thức lây nhiễm nhân tạo tác nhân gây bệnh lên chuyển gen thường tiến hành với phịng thí nghiệm bệnh học thực vật Các quy trình thử nghiệm xây dựng khác tùy thuộc vào đối tượng nghiên cứu Đối với tính kháng sâu cho sâu ăn trực tiếp phận (thân, rễ, lá…) bổ sung dịch chiết protein chuyển gen vào phần ăn theo dõi biểu sâu thông qua số sinh trưởng phát triển thời gian sống so với đối chứng (Lê Trần Bình, 2008) Đối với thử tính kháng virus lây nhiễm học tạo vết xước nhiễm dịch chiết bệnh lên vết xước loại virus lây truyền tự nhiên (Phạm Thị Vân cs., 2008) lây nhiễm thông qua côn trùng truyền bệnh (Inoue-Nagata et al., 2007) sau theo dõi mức độ kháng chuyển gen dựa vào thang điểm bệnh chuẩn nhà bệnh học công bố Dù sử dụng phương cách điều kiện thí 14 nghiệm phải chuẩn hóa ln sử dụng đối chứng không chuyển gen (WT) Sau thử nghiệm phịng thí nghiệm nhà lưới, cần triển khai đồng ruộng nơi có áp lực bệnh cao qua vài để kiểm chứng dòng lựa chọn Bước cuối khảo nghiệm đồng ruộng nhiều địa điểm khác phải qua vụ liên tiếp 2.1.2 Phân tích tính chống chịu Tính chống chịu thường kiểm tra thí nghiệm gây điều kiện ngoại cảnh bất lợi nhân tạo, nhiên việc làm không dễ Đối với khơ hạn có nhiều cách bố trí thí nghiệm khác như: (1) xử lý hạn cách xử lý PEG hay đường saccharose, chất cạnh tranh nước với rễ cây; (2) Bố trí thí nghiệm gây hạn nhân tạo nhà trồng không tưới tưới phục hồi hạn chế, thí nghiệm tiến hành với trồng cát đất trồng chậu; (3) tiến hành thực tế vùng khô hạn Tương tự vậy, nhiên cứu tính chịu mặn, phèn cần có bố trí thí nghiệm tự nhiên hợp lý không khác biệt với điều kiện bất lợi tự nhiên 2.1.3 Phân tích gen cải tiến chất lƣợng sản phẩm Đây loại phân tích dễ tiến hành quan tâm đến tính trạng chất lượng tiến hành phân tích tiêu chất lượng Các tính trạng thường quan tâm để cải tiến chất lượng trồng tăng hàm lượng chất dinh dưỡng (đường, tinh bột, amino acid…), tăng lượng chất sản xuất nguyên liệu (hàm lượng chất gỗ, dầu…) đặc tính khác tính chín chậm cà chua, tính chống đổ lúa … Các tính trạng quan sát mắt thường, sử dụng hình thức cân đong đo đếm xử lý tính tốn thống kê (đối với tính trạng số lượng) hỗ trợ kỹ thuật phân tích số sinh hóa (thường tính trạng chất lượng) 2.2 PHÂN TÍCH ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN VÀ NHẬN BIẾT THỂ ĐỒNG HỢP TỬ CỦA THẾ HỆ SAU Khi chuyển gen vào trồng, điều mong muốn copy đưa vào hệ gen Sau sử dụng tất phương pháp phân tích đủ chứng minh kết tạo chuyển gen mong muốn việc phân tích phân li để lựa chọn dịng đồng hợp tử hệ sau nhằm làm nguyên liệu phục vụ cho việc cải tiến giống Theo quy luật phân li Mendel, gen chuyển vào nằm nhiễm sắc thể T0 tự 15 thụ phấn, tỉ lệ phân li mang gen/cây không mang gen T1 3:1, gen nằm nhiễm sắc thể cho tỷ lệ 15:1 tương tự trường hợp gen nằm 3, 4, 5… nhiễm sắc thể (3:1)n n số nhiễm sắc thể mang gen chuyển Bước việc lựa chọn dòng đồng hợp tử hệ cho hạt T0 nảy mầm chọn dòng phân li 3:1 Sau T1 mang gen tiếp tục cho tự thụ phấn (hoặc lai phân tích) để kiểm tra kiểu gen dựa vào phân li T2 Nếu phân li T2 tiếp tục tỉ lệ 3:1 mẹ T1 dị hợp cịn T2 cho tồn mang gen T1 đồng hợp Như đồng hợp lựa chọn từ hệ T2 (hạt T1) trở Các phương pháp sử dụng để nhận biết mang gen hệ T1, T2… bao gồm dựa vào đặc tính kháng chất chọn lọc kỹ thuật PCR Có thể gieo hạt T0 môi trường nuôi cấy in vitro, sau hạt nảy mầm cắt chuyển sang mơi trường kích thích rễ bổ sung chất chọn lọc, mang gen rễ sinh trưởng phát triển cịn khơng chứa gen khơng thể rễ chết dần Bằng cách người ta dễ dàng xác định tỷ lệ phân li T1 Đây cách thường dùng đơn giản, tiết kiệm chi phí mà tính xác cao Ngoài ra, để xác định tỷ lệ phân li hệ cịn tạo vết cháy chất chọn lọc gieo hạt vào chậu thí nghiệm phun chất chọn lọc lên… Một điều lưu ý phân tích tỷ lệ phân li số lượng mẫu phân tích cần đủ lớn để đảm bảo tính xác tương đối Thơng thường phải tiến hành 30 mẫu Số mẫu thử nhiều tính xác cao Để đảm bảo tính xác việc xác định có mặt gen phân li gen chuyển hệ sau cần phải tiến hành phản ứng PCR Bằng cách gieo hạt nảy mầm sau thu tách chiết DNA chạy PCR với mồi đặc hiệu gen chuyển, dựa vào xuất hay không băng DNA sau điện di người ta dễ dàng biết xác phân li hệ dòng chuyển gen Trong trường hợp qua sinh sản hữu tính nên biểu dương tính giả tạp nhiễm vi khuẩn loại trừ hoàn toàn kết thu có độ tin cậy cao 16 Hình 2.1 Kết phân tích tỷ lệ phân li dịng cao lương SH4 SH7 chuyển gen hệ T1 (Tuong Van Nguyen, 2008) Hình 2.1 mơ tả kết xác định tỉ lệ phân li dòng cao lương chuyển gen hệ T1 kỹ thuật PCR (Tuong Van Nguyen, 2008) Dựa vào kết hình ta thấy rõ dịng T1SH4 có tỉ lệ mang gen/không mang gen tương ứng 19/6 phù hợp với tỷ lệ phân ly 3:1 dòng TSH7 có tỉ lệ phân ly xấp xỉ 15:1 Như dòng T1SH4 gen chuyển nằm nhiễm sắc thể T1SH7 nằm nhiễm sắc thể khác Trong phân tích lựa chọn dịng đồng hợp tử, phương pháp xác định biểu gen lai Northern, Western phân tích chức sinh học gen chuyển cần tiến hành lặp lại vài hệ để chứng minh ổn định gen chuyển chuyển gen trước đưa vào làm nguyên liệu cho lai tạo giống 17 TÀI LIỆU THAM KHẢO Alwine JC, Kemp DJ, Stark GR (1977) "Method for detection of specific RNAs in agarose gels by transfer to diazobenzyloxymethyl-paper and hybridization with DNA probes" Proc Natl Acad Sci USA 74 (12): 5350– 5365 Angerer LM, Cox KH, Angerer RC (1987) Demonstration of tissuespecific gene expression by in situ hybridization Meth Enzymol 152: 649– 661 Brasileiro ACM and Aragao FJL (2001) Marker genes for in vitro selection of transgenic plants Plant Biotech 3: 113–121 Bubner B, Gase K, Baldwin IT (2004) Twofold differences are the detection limit for determining transgene copy numbers in plants by realtime PCR BMC Biotechnol 4:14 Carleton KL and Kocher TD (2001) Cone opsin genes of African cichlid fishes: tuning spectral sensitivity by differential gene expression Mol Biol Evol 18: 1540–1550 Đỗ Tiến Phát, Đinh Thị Phịng, Chu Hồng Hà (2008) Đánh giá ảnh hưởng mật độ huyền phù vi khuẩn tới hiệu chuyển gen vào (Gossypium hirsutum L.) thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens.Tạp chí cơng nghệ sinh hoc số 6: 689-695 Freeman WM, Walker SJ, Vrana KE (1999) Quantitative RT-PCR: Pitfalls and potential BioTechniques 26: 112–125 Gause WC and Adamovicz J (1994) The use of PCR to quantitate geneexpression PCR Methods Applicat 3: S123–S135 He KJ, Wang ZY, Zhang YJ (2009) Monitoring Bt resistance in the field: China as a case study.In: Ferry N, Gatehouse AMR (eds) Environmental impact of genetically modified/novel crops CAB International, Oxford, UK, 344–360 10.Hu CY, Chee PP, Chesney RH, Zhou JH, Miller PD (1990) Intrinsic GUS-like activities in seed plants Plant Cell Rep 9: 1–5 11.Ingham DJ, Beer S, Money S, Hansen G (2001) Quantitative realtime PCR assay for determining transgene copy number in transformed plants Biotechniques 31:132–140 18 12.Inoue-Nagata A, Nagata T, de Avila AC, de BGordano L (2007) A reliable egomovirus inoculation method for screening Lycopersicon esculentum lines Horticultura Brasileira 25: 447-450 13.Jackson RE, Bradley JR Jr, Van Duyn JW (2004) Performance of feral and Cry1Ac-selected Helicoverpa zea (Lepidoptera: Noctuidae) strains on transgenic cottons expressing either one or two Bacillus thuringiensis ssp kurstaki proteins under greenhouse conditions Entomol Sci 39:46–55 14.James C (2007) Global status of commercialized biotech/GM crops ISAAA Briefs 37, ISAAA 15.Jefferson RA, Burgess SM, Hirsh D (1986) β-Glucuronidase from Escherichia coli as a gene-fusion marker Proc Natl Acad Sci USA 83: 8447–8451 16.Jefferson RA, Kavanagh TA, and Bevan MW (1987) GUS fusions: betaglucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants Embo 6: 3901–3907 17.Joersbo M and Okkels FT (1996) A novel principle for selection of transgenic plant cells: positive selection Plant Cell 16: 219–221 18.Joersbo M, Donaldson I, Kreiberg J, Petersen SG, Brunstedt J, Okkels FT (1998) Analysis of mannose selection for the production of transgenic sugar beet Mol Breed 4: 111–117 19.Kahn RS, Sjahril R, Nakamura I, MiiM (2008) Production of transgenic potato exhibiting enhanced resistance to fungal infections and herbicide applications Plant Biotechnol 2:13–20 20.Kevil CG, Walsh L, Laroux FS, Kalogeris T, Grisham MB, Alexander JS (1997) An Improved, Rapid Northern Protocol Biochem and Biophys Research Comm 238:277-279 21.Kosugi S, Ohashi Y, Nakajima K, Arai Y (1990) An improved assay for β-glucuronidase in transformed cells: methanol almost completely suppresses a putative endogenous β-glucuronidase activity Plant Sci 70: 133–140 22.Kunze I, Ebneth M, Heim U, Geiger M, Sonnewald U, Herbers K (2001) 2-Deoxyglucose resistance: a novel selection marker for plant transformation Mol Breed 7: 221–227 19 23.Lee MLT, Kuo FC, Whitmore GA, Sklar J (2000) Importance of replication in microarray gene expression studies: statistical methods and evidence from repetitive cDNA hybridizations Proc Natl Acad Sci USA 97: 9834–9839 24.Levine MJ (2007) Pesticides: a toxic time bomb in our midst Praeger, USA: 213–214 25.Lê Trần Bình (2008) Phát triển trồng chuyển gen Việt nam NXB Khoa học Tự nhiên Công nghệ 26.Long S and Rebagliati M (2002) Sensitive two-color whole-mount in situ hybridizations using digoxygenin - and dinitrophenol-labeled RNA probes BioTechniques 32: 494–500 27.Lopez SJ, Kumar RR, Pius PK, Muraleedharan N (2004) Agrobacterium tumefaciens-mediated genetic transformation in Tea (Camellia sinensis [L.] O Kuntze) Plant molecular biology reporter 22: 201a-201j 28.Lucca P, Ye X, Potrykus I (2001) Effective selection and regeneration of transgenic rice plants with mannose as selective agent Mol Breed 7: 43– 49 29.Matthews PR, Wang MB, Waterhouse PM, Thornton S, Fieg SJ, Gubler F, Jacobsen JV (2001) Marker gene elimination from transgenic barley, using co-transformation with adjacent „twin T-DNAs‟ on standard Agrobacterium transformation vector Mol Breed 7: 195- 202 30 Muhitch MJ (1998) Characterization of pedicel β-glucuronidase activity in developing maize (Zea mays) kernels Physiol Plant 104: 423–430 31.Negrotto D, Jolley M, Beer S, Wenck AR, Hansen G (2000) The use of phosphomannose-isomerase as a selectable marker to recover transgenic maize plants (Zea mays L.) via Agrobacterium transformation Plant Cell Rep 19: 798–803 32.Phạm Thị Vân, Nguyễn Văn Bắc, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng hà, Lê Trần Bình (2008) Tạo thuốc kháng bệnh virus khảm dưa chuột kỹ thuật RNAi Tạp chí Cơng nghệ sinh học số 6: 679 – 687 33.Phạm Thị Vân (2009) Nghiên cứu tạo thuốc kháng bệnh khảm kỹ thuật RNAi Luận văn Thạc sỹ sinh học 34.Schlamp K, Weinmann A, Krupp M, Maass T, Galle PR, Teufel A (2008) BlotBase: A northern blot database Gene 427: 47-50 20 ... hành phương pháp phân tích chuy? ??n gen CÁC PHƢƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ CÂY CHUY? ??N GEN Ở MỨC ĐỘ PHỊNG THÍ NGHIỆM Việc xác định ngun liệu thu từ hệ thống tái sinh sau biến nạp gen có phải chuy? ??n gen hay khơng... cần xác định chuy? ??n gen 1.2.2 Phƣơng pháp xác định số copy chuy? ??n gen Lai Southern để xác định số copy chuy? ??n gen phương pháp tin cậy thơng dụng Ngồi việc khẳng định tồn gen chuy? ??n genome nhận... có giá trị ΔCt với mẫu chuẩn chứa gen chuy? ??n 1.2.3 Phân tích biểu gen 10 Nghiên cứu biểu gen chuy? ??n cần thiết mục đích chuy? ??n gen, gen đưa vào genome mà không biểu coi khơng có giá trị Biểu gen