KHẢO SÁT HIỆU SUẤT THU NHẬN CHẾPHẨM ENZYME PROTEASE TỪCANH TRƯỜNG VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS VỚI CÁC LOẠI TÁC NHÂN TỦA KHÁC NHAU

KHẢO SÁT HIỆU SUẤT THU NHẬN CHẾPHẨM ENZYME PROTEASE TỪCANH TRƯỜNG VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS VỚI CÁC LOẠI TÁC NHÂN TỦA KHÁC NHAU

1 KHẢO SÁT HIỆU SUẤT THU NHẬN CHẾ PHẨM ENZYME

PROTEASE TỪ CANH TRƯỜNG VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS

VỚI CÁC LOẠI TÁC NHÂN TỦA KHÁC NHAU

Bảng 1.1: Lượng chế phẩm enzyme protease thu được và hiệu suất thu

nhận với các loại tác nhân tủa khác nhau

Tác nhân tủa

enzyme

Khối lượng canh trường (g)

Khối lượng tủa (g) Khối

lượng tủa trung bình (g)

Hiệu suất thu nhận (%)

Nhận xét : Lượng chế phẩm enzyme thu được và hiệu suất thu nhận

enzyme cao nhất là trong trường hợp tác nhân tủa là cồn

2 KHẢO SÁT HOẠT Độ PROTEASE

2.1 Đường chuẩn Tyrosin :

Bảng 2.1: Đường chuẩn Tyrosin

Lượng

Tyrosin(µmol) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

OD (750 nm) 0 0,181 0,355 0,529 0,704 0,878

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1

Hình 2.1 : Đường chuẩn Tyrosin

2.2 Khảo sát hoạt độ protease trong canh trường vi khuẩn Bacillus subtilis:

Cân 20 g canh trường vi khuẩn Bacillus subtilis, tiến hành như mục II.3.1,

phần dịch thu được 200 ml, pha loãng 2 lần, đem 0,5ml tiến hành xác định

hoạt độ theo phương pháp Anson cải tiến như mục II.3.2

Bảng 2.2: Hoạt độ protease của canh trường vi khuẩn Bacillus subtilis

Lần ODM ODĐC ∆OD = ODM -

ODĐC

µmol Tyrosin

Hoạt độ (UI/g CT)

Hoạt độ trungbình (UI/g CT)

2.3 Khảo sát hoạt độ protease của chế phẩm enzyme được tủa bằng cồn 96 0 :

Cân 1g chế phẩm enzym protease hòa tan trong 100ml nước cất, sau đó

pha loãng 2 lần, lấy 0,5ml tiến hành xác định hoạt độ theo phương pháp

Anson cải tiến như mục II.3.2

Bảng 2.3: Hoạt độ protease của chế phẩm enzyme được tủa bằng cồn

960

Lần ODM ODĐC ∆OD = ODM -

ODĐC

µmol Tyrosin

Hoạt độ (UI/g CPE)

Hoạt độ trung bình (UI/g CPE)

1 0,425 0,300 0,125 0,139 22,24

22,61

2 0,427 0,310 0,117 0,130 20,80

3 0,429 0,290 0,139 0,155 24,80

Nhận xét : Hoạt độ của chế phẩm enzyme protease được tủa bằng cồn

960 là 22,61 UI/g CPE (giá trị trung bình)

2.4 Khảo sát hoạt độ protease của chế phẩm enzyme được tủa bằng aceton :

Cân 1g chế phẩm enzym protease hòa tan trong 100ml nước cất, sau đó

pha loãng 2 lần, lấy 0,5ml tiến hành xác định hoạt độ theo phương pháp

Anson cải tiến như mục II.3.2

Bảng 2.4: Hoạt độ protease của chế phẩm enzyme được tủa bằng

acetone

Lần ODM ODĐC ∆OD = ODM -

ODĐC

µmol Tyrosin

Hoạt độ (UI/g CPE)

Hoạt độ trung bình (UI/g CPE)

1 0,493 0,410 0,083 0,091 14,56

14,29

2 0,492 0,402 0,090 0,099 15,84

3 0,495 0,424 0,071 0,078 12,48

Nhận xét : Hoạt độ của chế phẩm enzyme protease được tủa bằng

aceton là 14,29 UI/g CPE (giá trị trung bình)

2.5 Khảo sát hoạt độ protease của chế phẩm enzyme được tủa bằng amoni

sulfat:

Cân 1g chế phẩm enzym protease hòa tan trong 100ml nước cất, sau đó

pha loãng 2 lần, lấy 0,5ml tiến hành xác định hoạt độ theo phương pháp

Anson cải tiến như mục II.3.2

Bảng 2.5: Hoạt độ protease của chế phẩm enzyme được tủa bằng Amoni

sulfat

Lần ODM ODĐC ∆OD = ODM -

ODĐC

µmol Tyrosin

Hoạt độ (UI/g CPE)

Hoạt độ trung bình (UI/g CPE)

1 0,517 0,458 0,059 0,064 10,24

6,93

2 0,489 0,462 0,027 0,027 4,32

3 0,524 0,487 0,037 0,039 6,24

Nhận xét : Hoạt độ của chế phẩm enzyme protease được tủa bằng muối

amoni sulfat là 6,93 UI/g CPE (giá trị trung bình)

2.6 Sự so sánh hoạt độ các CPE protease tủa bởi các tác nhân khác nhau:

Bảng 2.6: So sánh hoạt độ của các CPE protease với tác nhân tủa khác

nhau

Tác nhân tủa Hoạt độ (UI/g CPE) Hoạt độ trung bình (UI/g

CPE) Cồn 960

22,24

22,61 20,80

24,80

Acetone

14,56

14,29 15,84

12,48 Amoni sulfat

10,24

6,93 4,32

6,24 Nhận xét : Trong các loại chế phẩm protease, chế phẩm có hoạt độ cao

nhất là chế phẩm enzyme được tủa bằng cồn (22,61 UI/g CPE)

3 KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG PROTEIN THEO PHƯƠNG PHÁP

LOWRY

3.1 Đường chuẩn Albumin :

Bảng 3.1: Đường chuẩn Albumin

3.2 Khảo sát hàm lượng protein trong canh trường vi khuẩn Bacillus

subtilis :

Cân 20 g canh trường vi khuẩn Bacillus subtilis, tiến hành như mục II.3.1,

phần dịch thu được 200 ml, pha loãng 50 lần, đem1ml tiến hành thí nghiệm

theo phương pháp Lowry như mục II.3.3

Bảng 3.2: Hàm lượng protein của canh trường vi khuẩn Bacillus subtilis

:

Lần ODM ODĐC ∆OD

= ODM - ODĐC

Nồng độ protein tương ứng (µg/ml)

Hàm lượng protein (mg/g CT)

Hàm lượng protein trung bình (mg/g CT)

1 0,774 0,035 0,739 187,872 93,94

94,92

2 0,783 0,035 0,748 190,179 95,09

3 0,788 0,035 0,753 191,462 95,73

Nhận xét : Hàm lượng protein của canh trường vi khuẩn Bacillus

subtilis là 94,92 mg/g CT (giá trị trung bình)

3.3 Khảo sát hàm lượng protein của CPE protease được tủa bằng cồn 96 0 :

Cân 1g chế phẩm enzyme protease hòa tan trong 100ml nước cất, sau đó

pha loãng 20 lần, lấy 1ml xác định hàm lượng protein theo phương pháp

Lowry như mục II.3.3

Bảng 3.3: Hàm lượng protein của chế phẩm enzyme được tủa bằng cồn

Hàm lượng protein (mg/g CPE)

Hàm lượng protein trung bình (mg/g

Nhận xét : Hàm lượng protein của chế phẩm enzyme protease được tủa

bằng cồn 960 là 318,60 mg/g CPE (giá trị trung bình)

3.4 Khảo sát hàm lượng protein của CPE protease được tủa bằng aceton:

Cân 1g chế phẩm enzyme protease hòa tan trong 100ml nước cất, sau đó

pha loãng 20 lần, lấy 1ml xác định hàm lượng protein theo phương pháp

Lowry như mục II.3.3

Bảng 3.4: Hàm lượng protein của chế phẩm enzyme được tủa bằng cồn

Hàm lượng protein (mg/g CPE)

Hàm lượng protein trung bình (mg/g CPE)

1 0,598 0,035 0,563 142,744 285,49

284,63

2 0,594 0,035 0,559 141,718 283,44

3 0,597 0,035 0,562 142,478 284,97

Nhận xét : Hàm lượng protein của chế phẩm enzyme protease được tủa

bằng aceton là 284,63 mg/g CPE (giá trị trung bình)

3.5 Khảo sát hàm lượng protein của CPE protease được tủa bằng muối

amoni sulfat :

Cân 1g chế phẩm enzyme protease hòa tan trong 100ml nước cất, sau đó

pha loãng 20 lần, lấy 1ml xác định hàm lượng protein theo phương pháp

Lowry như mục II.3.3

Bảng 3.5: Hàm lượng protein của chế phẩm enzyme được tủa bằng amoni

Hàm lượng protein (mg/g CPE)

Hàm lượng protein trung bình

Nhận xét : Hàm lượng protein của chế phẩm enzyme protease được tủa

bằng aceton là 203,44 mg/g CPE (giá trị trung bình)

3.6 Sự so sánh hàm lượng protein của chế phẩm protease tủa bởi các tác

nhân khác nhau :

Bảng 3.6: So sánh hàm lượng protein của các loại chế phẩm enzyme

protease với tác nhân tủa khác nhau

Tác nhân tủa Hàm lượng protein

310,97 Aceton

285,49

284,63 283,44

284,97

Amoni sulfat

212,67

203,44 191,13

206,51 Nhận xét : Hàm lượng protein cao nhất ở chế phẩm enzyme protease

được tủa bằng cồn 960 là 307,85 mg/g CPE (giá trị trung bình )

4 HOẠT ĐỘ RIÊNG CỦA PROTEASE

Bảng 4.1: Hoạt độ riêng của canh trường vi khuẩn

Hoạt độ protease (UI/g CT)

Hàm lượng protein (mg protein/g CT)

Hoạt độ riêng (UI/mg Pr)

Bảng 4.2: So sánh hoạt độ riêng của từng loại chế phẩm enzyme

protease với tác nhân tủa khác nhau

Tác nhân tủa Hoạt độ protease

(UI/g CPE)

Hàm lượng protein (mg Pr/g CPE)

Hoạt độ riêng (UI/mg Pr)

Amoni sulfat 6,93 203,44 0,034

Nhận xét : Hoạt độ riêng của chế phẩm enzyme protease được tủa bằng

cồn là cao nhất 0,072 UI/mg CPE (giá trị trung bình)

5 KHẢO SÁT SỰ PHỤ THUỘC HOẠT ĐỘ CỦA CÁC CHẾ PHẨM

ENZYME PROTEASE VÀO NHIỆT ĐỘ

5.1 Khảo sát sự phụ thuộc hoạt độ của CPE protease (tủa bằng cồn)

theo nhiệt độ:

Cân 1g chế phẩm enzym hòa tan trong 100ml nước cất, sau đó pha loãng 2

lần, ở mỗi nhiệt độ khảo sát từ 300 C đến 800 C, lấy 0,5ml tiến hành xác định

hoạt độ theo Anson cải tiến như mục II.3.2

Bảng 5.1: Khảo sát sự phụ thuộc hoạt độ protease của CPE (tủa bằng cồn)

Hoạt độ (UI/g CPE)

Hoạt độ trung bình (UI/g CPE)

80 2 0,482 0,460 0,022 0,022 3,52 2,99

3 0,484 0,465 0,019 0,018 2,88

Nhận xét : Ở 550C, chế phẩm enzyme protease được tủa bằng cồn 960

có hoạt độ cao nhất là 63,40 UI/g CPE (giá trị trung bình)

0 10

Cân 1g chế phẩm enzym protease hòa tan trong 100ml nước cất, sau đó

pha loãng 2 lần, ở mỗi nhiệt độ khảo sát từ 300 C đến 800 C, lấy 0,5ml tiến

hành xác định hoạt độ theo Anson cải tiến như mục II.3.2

Bảng 5.2: Khảo sát sự phụ thuộc hoạt độ enzyme vào nhiệt độ đối với

CPE (tủa bằng aceton) :

Hoạt độ (UI/g CPE)

Hoạt độ trung bình (UI/g CPE)

Nhận xét : Ở 550C, chế phẩm enzyme protease được tủa bằng aceton có

hoạt độ cao nhất là 42,88 UI/g CPE (giá trị trung bình)

-10 0 10 20 30 40 50

5.3 Khảo sát sự phụ thuộc hoạt độ enzyme vào nhiệt độ đối với CPE

(tủa bằng amoni sulfat) :

Cân 1g chế phẩm enzym protease hòa tan trong 100ml nước cất, sau đó

pha loãng 2 lần, ở mỗi nhiệt độ khảo sát từ 300 C đến 800 C, lấy 0,5ml tiến

hành xác định hoạt độ theo Anson cải tiến như mục II.3.2

Bảng 5.3: Khảo sát sự phụ thuộc hoạt độ của CPE protease (tủa bằng

amoni sulfat) theo nhiệt độ

Hoạt độ (UI/g CPE)

Hoạt độ trung bình (UI/g CPE)

Nhận xét : Ở 550C, chế phẩm enzyme protease được tủa bằng muối

amoni sulfat cĩ hoạt độ cao nhất là 37,33 UI/g CPE (giá trị trung bình)

0 5 10 15 20 25 30 35 40

NHIỆT ĐỘ (ĐỘ C)

HOẠT ĐỘ

(UI/g CPE)

Hình 5.3: Sự phụ thuộc của hoạt độ chế phẩm protease (tủa bằng amoni

sulfat) theo nhiệt độ

6 KHẢO SÁT SỰ BIẾN ĐỔI HOẠT ĐỘ CỦA CHẾ PHẨM

PROTEASE TỪ BACILLUS SUBTILIS THEO pH.

Cân 1g chế phẩm enzym hịa tan trong 100ml nước cất, sau đĩ pha

lỗng 2 lần, ở nhiệt độ 550C, mỗi pH khảo sát từ 3 đến 10, lấy 0,5ml tiến

hành xác định hoạt độ theo Anson cải tiến như mục II.3.2

Bảng 6.1: Sự biến đổi hoạt độ của CPE protease theo pH

pH Lần ODM ODĐC ∆OD

= ODM -

ODĐC

µmol Tyrosin

Hoạt độ (UI/g CPE)

Hoạt độ trung

bình(UI/g CPE)

Nhận xét : ở pH = 6,0; chế phẩm enzyme protease được tủa bằng cồn

960 có hoạt độ cao nhất là 78,45 UI/g CPE (giá trị trung bình )

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

7.1 Khảo sát quá trình thủy phân albumin :

Với điều kiện nhiệt độ 550C ; pH = 6,0

Bảng 7.1: Sự biến đổi lượng NF theo thời gian thủy phân albumin bởi

Lượng N-formol tương ứng (g/100 ml dịch thủy phân )

Trung bình lượng N-formol tương ứng (g)

Với cơ chất là albumin, quá trình thủy phân có vận tốc tăng nhanh trong

khoảng từ 0 – 5 giờ Giờ thứ 6 và thứ 7, lượng N-formol có tăng nhưng

lượng có chiều hướng giảm Từ giờ thứ 8, quá trình thủy phân gần như ổn

định

7.2 Khảo sát quá trình thủy phân casein :

Với điều kiện nhiệt độ 550C và pH = 6,0

Bảng 7.2: Sự biến đổi lượng NF theo thời gian thủy phân casein bởi

Lượng N-formol tương ứng (g/100 ml dịch thủy phân)

Trung bình lượng N-formol tương ứng (g)

Nhận xét :

Với cơ chất là casein, quá trình thủy phân có vận tốc tăng nhanh trong

khoảng từ 0 – 9 giờ Giờ thứ 10 và thứ 11, lượng N-formol có tăng nhưng

lượng có chiều hướng giảm Từ giờ thứ 12, quá trình thủy phân gần như ổn

định

7.3 Khảo sát quá trình thủy phân protid đậu nành hạt :

Với điều kiện nhiệt độ 550C và pH = 6,0

Bảng 7.3: Sự biến đổi lượng NF theo thời gian thủy phân đậu nành hạt

bởi CPE protease

Lượng N-formol tương ứng (g/100 ml dịch thủy phân)

Trung bình lượng N-formol tương ứng (g)

Với cơ chất là đậu nành hạt, quá trình thủy phân có vận tốc tăng nhanh

trong khoảng từ 0 – 10 giờ Giờ thứ 11, lượng N-formol có tăng nhưng

lượng có chiều hướng giảm Từ giờ thứ 12, quá trình thủy phân gần như ổn

định

7.4 Khảo sát quá trình thủy phân protid nấm rơm :

Với điều kiện nhiệt độ 550C và pH = 6,0

Bảng 7.4: Sự biến đổi lượng NF theo thời gian thủy phân nấm rơm bởi

Lượng N-formol tương ứng (g/100 ml dịch thủy phân)

Trung bình lượng N-formol tương ứng (g)

Với cơ chất là nấm rơm, quá trình thủy phân có vận tốc tăng nhanh trong

khoảng từ 0 – 10 giờ Giờ thứ 11 và thứ 12, lượng N-formol có tăng nhưng

lượng có chiều hướng giảm Từ giờ thứ 13, quá trình thủy phân gần như ổn

định

7.5 Khảo sát quá trình thủy phân thịt heo nạc :

Với điều kiện nhiệt độ 550C và pH = 6,0

Bảng 7.5: Sự biến đổi lượng NF theo thời gian thủy phân thịt heo nạc

bởi CPE protease

Trung bình lượng N-formol tương ứng (g)

Với cơ chất là thịt heo nạc, quá trình thủy phân có vận tốc tăng nhanh

trong khoảng từ 0 – 7 giờ Giờ thứ 8 và thứ 9, lượng N-formol có tăng

nhưng lượng có chiều hướng giảm Từ giờ thứ 10, quá trình thủy phân gần

như ổn định

0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35

Hình 7.1: Sự biến đổi hàm lượng NF theo thời gian trong quá trình thủy

phân các cơ chất khác nhau bởi chế phẩm protease

MỤC LỤC

1 KHẢO SÁT HIỆU SUẤT THU NHẬN CHẾ PHẨM ENZYME

PROTEASE TỪ CANH TRƯỜNG VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS

VỚI CÁC LOẠI TÁC NHÂN TỦA KHÁC NHAU 1

2 KHẢO SÁT HOẠT ĐỘ PROTEASE 1

2.1 Đường chuẩn Tyrosin : 1

2.2 Khảo sát hoạt độ protease trong canh trường vi khuẩn Bacillus subtilis:

2.5 Khảo sát hoạt độ protease của chế phẩm enzyme được tủa bằng 4

2.6 Sự so sánh hoạt độ các CPE protease tủa bởi các tác nhân khác nhau: 4

3 KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG PROTEIN THEO PHƯƠNG PHÁP LOWRY

5

3.1 Đường chuẩn Albumin : 5

3.3 Khảo sát hàm lượng protein của CPE protease được tủa bằng cồn 960 : 6

3.4 Khảo sát hàm lượng protein của CPE protease được tủa bằng aceton: 7

3.5 Khảo sát hàm lượng protein của CPE protease được tủa bằng muối

amoni sulfat : 7

3.6 Sự so sánh hàm lượng protein của chế phẩm protease tủa bởi các tác

nhân khác nhau : 8

4 HOẠT ĐỘ RIÊNG CỦA PROTEASE 9

5 KHẢO SÁT SỰ PHỤ THUỘC HOẠT ĐỘ CỦA CÁC CHẾ PHẨM

ENZYME PROTEASE VÀO NHIỆT ĐỘ 9

5.1 Khảo sát sự phụ thuộc hoạt độ của CPE protease (tủa bằng cồn) theo

nhiệt độ: 9

5.2 Khảo sát sự phụ thuộc hoạt độ enzyme vào nhiệt độ đối với CPE (tủa

bằng aceton) : 11

5.3 Khảo sát sự phụ thuộc hoạt độ enzyme vào nhiệt độ đối với CPE (tủa bằng amoni sulfat) : 13

6 KHẢO SÁT SỰ BIẾN ĐỔI HOẠT ĐỘ CỦA CHẾ PHẨM PROTEASE TỪ BACILLUS SUBTILIS THEO pH 15

7 KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN PROTID CỦA CHẾ PHẨM PROTEASE 17

7.1 Khảo sát quá trình thủy phân albumin : 17

7.2 Khảo sát quá trình thủy phân casein : 19

7.3 Khảo sát quá trình thủy phân protid đậu nành hạt : 20

7.4 Khảo sát quá trình thủy phân protid nấm rơm : 21

7.5 Khảo sát quá trình thủy phân thịt heo nạc : 22