KHẢO SÁT SỰ THỦY PHÂN PROTEIN TỪ ĐẬU NÀNH DƯỚI TÁC DỤNG ENZYME PROTEASE CỦA NẤM MỐC ASPERGILLUS ORYZAE

Ảnh hưởng của cơ chất (bột mì) đến sự phát triển và sản sinh enzyme protease của nấm mốc Aspergillus oryzaetrong quá trình ủ mố

KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

LÊ MINH SƠN

KHẢO SÁT SỰ THỦY PHÂN PROTEIN TỪ ĐẬU NÀNH DƯỚI TÁC DỤNG ENZYME PROTEASE

CỦA NẤM MỐC ASPERGILLUS ORYZAE

Luận văn tốt nghiệp Ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

Luận văn tốt nghiệp Ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

Tên đề tài:

KHẢO SÁT SỰ THỦY PHÂN PROTEIN TỪ ĐẬU NÀNH DƯỚI TÁC DỤNG ENZYME PROTEASE

CỦA NẤM MỐC ASPERGILLUS ORYZAE

MSSV: 2051673

Lớp: CNTP K31

Cần Thơ, 2009

Luận văn đính kèm theo đây, với đề tài “Khảo sát sự thủy phân protein từ đậu

nành dưới tác dụng enzyme protease của nấm mốc Aspergillus oryzae” do sinh

viên Lê Minh Sơn thực hiện và báo cáo đã được hội đồng chấm luận văn thông qua

Giáo viên hướng dẫn

Cần Thơ, ngày … tháng … năm 2009

Chủ tịch hội đồng

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

LỜI CẢM TẠ

Trong suốt thời gian học tập tại Trường Đại Học Cần Thơ, dưới sự chỉ dạy tận tìnhcủa các thầy cô, em xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn của mình đến các Thầy côTrường Đại Học Cần Thơ, Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, Bộ mônCông Nghệ Thực Phẩm Và em sẽ luôn ghi nhớ những tình cảm cao quý đó tronghiện tại cũng như sau khi ra trường

Em xin trân trọng cảm ơn Thầy Võ Tấn Thành – giáo viên trực tiếp hướng dẫn emthực hiện đề tài Mặc dù bận rộn với công việc giảng dạy nhưng thầy luôn quan tâm,theo dõi và giúp đỡ em tận tình về kiến thức, phương pháp học tập, nghiên cứu,…Thầy đã tạo điều kiện tốt nhất để em có thể hoàn thành tốt luận văn này

Em xin chân thành cảm ơn Giám Đốc Công ty TNHH Phong Dinh, các anh chịphòng kỹ thuật, phòng kinh doanh, tổ cơ điện và anh chị em công nhân trong công

ty đã giúp đỡ, chỉ dạy và tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành tốt luận vănnày

Em xin cảm ơn thầy Lý Nguyễn Bình, trưởng Bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm,Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng đồng thời là cố vấn học tập của lớpCông Nghệ Thực Phẩm K31, đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho em thực hiện luận văn

và hoàn thành quá trình nghiên cứu của mình

Em xin chân thành biết ơn tập thể cán bộ phòng thí nghiệm của Bộ môn Công NghệThực Phẩm cùng tất cả các bạn sinh viên lớp Công Nghệ Thực Phẩm K31 đã nhiệttình đóng góp ý kiến và tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt thời gian vừa qua.Một lần nữa em xin chân thành cảm ơn đến tất cả các quý thầy cô và các bạn Kínhchúc quý thầy cô và các bạn luôn thành công trong công việc cũng như trong cuộcsống

Sinh viên thực hiện

Lê Minh Sơn

TÓM TẮT

Nhằm mục đích cải tiến quy trình sản xuất nước tương lên men truyền thống bằngphương pháp kiểm soát trực tuyến thời gian ủ mốc, nhiệt độ lên men và sử dụng

mấm mốc Aspergillus oryzae thuần chủng trong quá trình ủ mốc, để sản xuất nước

tương lên men có giá trị dinh dưỡng và chất lượng cao, không chứa độc tố aflatoxin

và rút ngắn thời gian sản xuất, đề tài “Khảo sát sự thủy phân protein từ đậu nành

dưới tác dụng enzyme protease của nấm mốc Aspergillus oryzae” được tiến hành.

Phần nghiên cứu thí nghiệm được tiến hành với các nội dung:

- Sử dụng kỹ thuật xử lý ảnh (Image Processing) để thể hiện hoạt lực enzyme

protease theo màu sắc của nấm mốc Sử dụng hệ màu ”RGB” (red, green, blue)

để khảo sát hoạt tính nấm mốc theo màu sắc trong thời gian ủ

- Ảnh hưởng của cơ chất (bột mì) đến sự phát triển và sản sinh enzyme protease của nấm mốc Aspergillus oryzae trong quá trình ủ mốc.

- Ảnh hưởng của nồng độ muối và tỉ lệ phối trộn bột mì (trong quá trình ủ mốc)

đến quá trình thủy phân protein của đậu nành trong quá trình lên men

Nghiên cứu thu được một số kết quả như sau:

- Có thể Sử dụng kỹ thuật xử lý ảnh (Image Processing) để theo dõi hoạt lực enzyme protease trong quá trình ủ mốc Có thể sử dụng hệ màu “RGB” (red, green, blue) hoặc “Lab” để biết được khoảng thời gian chính xác nấm mốc sinh

ra nhiều enzyme nhất để kết thúc quá trình ủ nhằm rút ngắn thời gian sản xuất

sản sinh ra nhiều enzyme protease thủy phân protein

môi trường lên men đạt hiệu suất thủy phân cao nhất

MỤC LỤC

LỜI CẢM TẠ iii

TÓM TẮT iv

MỤC LỤC v

DANH SÁCH HÌNH vii

DANH SÁCH BẢNG viii

Chương 1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1

1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ .1

1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 1

Chương 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2

2.1 MỘT SỐ QUY TRÌNH SẢN XUẤT TRONG NƯỚC 2

2.1.1 Qui trình sản xuất nước tương hoá giải 2

2.1.2 Qui trình sản xuất nước tương lên men 3

2.2 NGUYÊN LIỆU 4

2.2.1 Đậu nành 4

2.2.2 Lúa mì 6

2.2.3 Muối ăn 7

2.2.4 Aspergillus oryzae 8

2.3 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG TRONG QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT 9

2.3.1 Ngâm đậu 9

2.3.2 Hấp đậu 9

2.3.3 Độ ẩm trong quá trình nuôi mốc 9

2.3.4 Nhiệt độ trong quá trình nuôi mốc 9

2.3.5 Lên men trong nước muối 10

2.3.6 Nhiệt độ và khuấy đảo trong quá trình lên men 10

2.4 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC VÀ NGOÀI NƯỚC LIÊN QUAN ĐẾN SẢN XUẤT NƯỚC TƯƠNG 11

Chương 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

3.1 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 13

3.1.1 Địa điểm và thời gian 13

3.1.2 Nguyên liệu 13

3.1.3 Thiết bị và dụng cụ 13

3.1.4 Hóa chất 13

3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

3.2.1 Qui trình thí nghiệm sản xuất nước chấm lên men từ đậu nành 16

3.2.2 Các chỉ tiêu cần phân tích 17

3.2.3 Phân tích số liệu 17

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 18

4.1 Thí nghiệm 1: Sự thay đổi giá trị màu sắc(red, green, blue) trong quá trình ủ nấm mốc 18

4.2 Thí nghiệm 2: Sự ảnh hưởng của tỉ lệ phối trộn bột mì trong quá trình ủ và nồng độ muối trong quá trình thủy phân đến hàm lượng đạm amin sinh ra 20

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 29

5.1 Kết luận 29

5.2 Đề nghị 29

TÀI LIỆU THAM KHẢO 30

PHỤC LỤC 1 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH x

PHỤ LỤC 2 SỐ LIỆU VÀ KẾT QUẢ THỐNG KÊ xiv

DANH SÁCH HÌNH

Hình 1 Phương pháp sản xuất nước tương theo công nghệ acid (Trần Bích Lam, 2007) 2

Hình 2 Qui trình sản xuất nước tương và tương Tàu 3

Hình 3: Aspergillus oryzae 8

Hình 4: Qui trình thí nghiệm sản xuất nước chấm lên men từ đậu nành 16 Hình 5: Đồ thị thể hiện sự thay đổi màu sắc trong quá trình ủ mốc theo thời gian ủ với hàm lượng bột mì bổ sung 0% 18 Hình 6: Đồ thị thể hiện sự thay đổi màu sắc trong quá trình ủ mốc theo thời gian ủ với hàm lượng bột mì bổ sung 5% 19 Hình 7: Đồ thị thể hiện sự thay đổi màu sắc trong quá trình ủ mốc theo thời gian ủ với hàm lượng bột mì bổ sung 10% 19 Hình 8: Sự thay đổi hàm lượng đạm amin ở các mẫu cùng hàm lượng bột mì 0% và khác nhau về hàm lượng muối theo thời gian lên men 22 Hình 9: Đồ thị thể hiện tương tác của hàm lượng muối và thời gian lên men đến hàm lượng đạm amin sinh ra ở hàm lượng bột mì bổ sung là 0% 22 Hình 10: Sự thay đổi hàm lượng đạm amin ở các mẫu cùng hàm lượng bột mì 5% và khác nhau về hàm lượng muối theo thời gian lên men 23 Hình 11: Đồ thị thể hiện tương tác của hàm lượng muối và thời gian lên men đến hàm lượng đạm amin sinh ra ở hàm lượng bột mì bổ sung là 5% 24 Hình 12: Sự thay đổi hàm lượng đạm amin ở các mẫu cùng hàm lượng bột mì 10% và khác nhau về hàm lượng muối theo thời gian lên men 25 Hình 13: Đồ thị thể hiện tương tác của hàm lượng muối và thời gian lên men đến hàm lượng đạm amin sinh ra ở hàm lượng bột mì bổ sung là 10% 25 Hình 14: Đồ thị so sánh hàm lượng đạm amin sinh ra theo thời gian lên men giữa các mẫu tốt nhất ở 0%, 5% và 10% bột mì bổ sung 26 Hình 15: Sự thay đổi hàm lượng ammoniac theo hàm lượng bột mì bổ sung 28

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 1 Thành phần hoá học chính của đậu nành (% căn bản khô) 5

Bảng 2 Thành phần acid amin tối cần thiết của đậu nành và thành phần acid amin chất lượng chuẩn của FAO (g/16g protein) 5

Bảng 3 Thành phần hoá học của bột lúa mì 7

Bảng 4: Thể hiện sự tương tác giữa hai nhân tố nồng độ muối (A)và tỉ lệ bột mì (B) 15

Bảng 5: Hàm lượng đạm amin ( gN/l) theo thời gian (ngày) 21

Bảng 6: Hàm lượng đạm amoniac ( gN/l) theo thời gian (ngày) 27

Bảng 7: Sự thay đổi màu sắc của nấm mốc và đậu nành trong quá trình ủ ở những hàm lượng bột mì bổ sung khác nhau theo thời gian ủ xiv

Bảng 8: Kiểm định LSD 95% hàm lượng đạm amin ở 0% bột mì theo nồng độ muối xx

Bảng 9 : kết quả thống kê thể hiện sự tương tác giữa nồng độ muối và thời gian ảnh hưởng đến đạm amin xx

Bảng 10: Kiểm định LSD 95% hàm lượng đạm amin ở 5% bột mì theo nồng độ muối xxi Bảng 11 : kết quả thống kê thể hiện sự tương tác giữa nồng độ muối và thời gian ảnh hưởng đến đạm amin xxi

Bảng 12: Kiểm định LSD 95% hàm lượng đạm amin ở 10 % bột mì theo nồng độ muối xxii

Bảng 13: kết quả thống kê thể hiện sự tương tác giữa nồng độ muối và thời gian ảnh hưởng đến đạm amin xxii

CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Thực phẩm lên men truyền thống là loại thực phẩm được sản xuất thủ công, mangbản sắc riêng của từng dân tộc Công nghệ sản xuất các sản phẩm truyền thốngđược thực hiện từ rất lâu và được truyền từ đời này sang đời khác

Tương và nước tương là sản phẩm tiêu biểu của các sản phẩm lên men truyềnthống được chế biến từ đậu nành Đặc biệt là nước tương, một loại nước chấmthường được sử dụng trong bữa ăn của người Việt Nam Nước tương không chỉ cótác dụng giúp hương vị món ăn thêm đậm đà mà còn thể hiện một nét riêng, đặctrưng của ẩm thực Việt Nam

Thế nhưng, tình hình sản xuất nước tương ở nước ta hiện nay còn khó kiểm soátchất lượng Đa số các cơ sở sản xuất tương đều sản xuất theo phương pháp cổtruyền hoặc phương pháp hoá giải Sản xuất theo phương pháp cổ truyền thì phụthuộc rất lớn vào thiên nhiên nên thời gian lên men kéo dài, năng suất thấp, chấtlượng tương không ổn định, thay đổi theo thời tiết và vùng sản xuất, sản phẩmtương không đồng nhất và dễ bị hư hỏng do nhiễm các tạp khuẩn gây thối,… Đôi

lúc nhiễm cả nấm mốc Aspergillus flavus sinh độc tố aflatoxin tồn tại trong sản

phẩm gây ung thư (Nguyễn Đức Lượng, 2003) Ngược lại, nếu sản xuất theophương pháp hoá giải thì chi phí sản xuất cao, thiết bị ăn mòn sinh ra các chất phụđộc hại và chứa hàm lượng cao chất 3-MCPD, 1.3-DCP, …là các chất gây ung thư.Hiện nay, vài quy trình chế biến nước tương sạch đã được nghiên cứu và công bố

(Viện Sinh học nhiệt đới, Tp Hồ Chí Minh, 2007) với hàm lượng 3-MCPD có thể

chấp nhận trong sản phẩm Thế nhưng, các quy trình đó cũng chỉ khảo sát tiếntrình và các điều kiện tối ưu để sản xuất trong qui mô nhỏ, chưa có nghiên cứukiểm soát tiến trình triệt để ở qui mô thí điểm để có thể phát triển thành sản xuấtlớn Vì vậy, cần phải có nghiên cứu để đưa ra một quy trình sản xuất nước tương

có kiểm soát tiến trình để áp dụng vào sản xuất lớn

Nghiên cứu môi trường thích hợp để nuôi cấy mốc Aspergillus oryzae và thời gian

để mốc sản sinh nhiều enzyme protease (có quan sát tiến trình).

Sử dụng mốc Aspergillus oryzae thuần chủng có hoạt tính cao để thủy phân protein

từ đậu nành đạt hiệu quả cao, đồng thời rút ngắn thời gian ủ mốc và thời gian lênmen

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

Ở nước ta nước tương thông thường được sản xuất theo hai phương pháp chính làphương pháp hóa giải và phương pháp lên men truyền thống

2.1.1 Qui trình sản xuất nước tương hoá giải

Trước đây, các sản phẩm nước tương trên thị trường Việt Nam chủ yếu được sảnxuất theo phương pháp thuỷ phân bằng acid HCl đậm đặc tạo ra sản phẩm phụ độchại là 3-MCPD, nước tương sản xuất bằng qui trình này có mùi vị rất ngọt, thơm,hậu ngọt hơi chua và phù hợp với hương vị người tiêu dùng, thường được gọi vớitên khác là “tàu vị yểu” Qui trình công nghệ theo sơ đồ sau:

Hình 1 Phương pháp sản xuất nước tương theo công nghệ acid (Trần Bích Lam, 2007)

Phương pháp này có ưu điểm là rẻ, nhanh, hiệu suất thủy phân cao từ 85 ÷ 90%,sản phẩm giàu acid amin và dễ bảo quản Nhược điểm chính của phương pháp acid

một phần hay hoàn toàn, sinh ra nhiều hợp chất phụ độc hại, đặc biệt là 3-MCPD

và các chất đồng đẳng của chúng,…(Trần Bích Lam, 2007)

2.1.2 Qui trình sản xuất nước tương lên men

2.1.2.1 Qui trình sản xuất nước tương truyền thống

Tương và nước tương là hai sản phẩm lên men với nguyên liệu chính là đậu nành.Qui trình sản xuất tương và nước tương thường giống nhau, nhưng trong qui trìnhsản xuất nước tương sẽ thêm một công đoạn ép lấy nước tương và loại bỏ bã.Trong qui trình sản xuất tương sẽ không áp dụng công đoạn ép, lọc

Ở Việt Nam có hai loại tương: tương Tàu và tương Ta được sản xuất theo hai quitrình có một vài điểm khác biệt, trong đó người ta dùng bột gạo hoặc bột mì để làm

cơ chất giúp vi sinh vật phát triển

Sau 72 ÷ 76 giờ hạt đậu bóp ra màu nâu và cứng

1 kg muối đun sôi trong

10 lít nước, để nguội Cho vào lu hay bể chứa

Ban ngày phơi nắng, đêm đậy kín

Đảo khuấy ngày/lần trong 1 tháng

Các qui trình sản xuất thủ công thường không ổn định do việc sử dụng nguồn nấmmốc có trong tự nhiên Bên cạnh sản lượng thành phẩm không ổn định do khôngthể khống chế được số lượng bào tử và lượng enzyme sinh ra không đủ hoạt lực,…Ngoài ra việc sử dụng nguồn nấm mốc có trong tự nhiên còn có khả năng nhiễm

các loại nấm mốc khác như Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus sinh độc tố aflatoxin tồn tại trong sản phẩm là nguyên nhân gây bệnh ung thư (Võ Thị Hạnh et al., 2007; Nguyễn Đức Lượng, 2003).

Ở nước ngoài (Nhật), bằng việc sử dụng nguồn vi sinh vật thuần và hệ thống trang

thế bị kỉ thuật tiên tiến theo qui trình công nghệ mới giúp kiểm soát được tiếntrình, tạo ra sản phẩm có chất lượng cao và luôn ổn định Dựa trên sự khác biệt vềthành phần nguyên liệu, điều kiện lên men hay thời gian ủ chín mà nước tương lênmen được chia làm 5 loại: Koikuchi, Usukuchi, Tamari, Shiro và Saishikomi(Hesseltine and Wang, 1986)

2.2.1 Đậu nành

Đậu nành có tên khoa học là Glycine max (L.) Merrill, có nguồn gốc Á Đông, du

nhập sang phương Tây vào thế kỷ 20 (Endres, 2001 ; Liu, 2004) Đậu nành cónhiều màu sắc khác nhau, trong đó đậu nành màu vàng là loại tốt nhất nên đượctrồng và sử dụng nhiều (Ngạc Văn Giậu, 1983; Nguyễn Đức Lượng, 2002, 2003;Nguyễn Thị Hiền, 2004)

Đậu nành xuất xứ từ vùng đông bắc Trung Quốc vào khoảng 2200 năm TrướcCông nguyên Hàm lượng protein trong đậu nành rất cao (35 ÷ 45%) là một nguồnprotein rất quan trọng đối với con người Năm 2002, bốn nước sản xuất đậu nànhhàng đầu thế giới là Hoa Kỳ (chiếm 39% sản lượng trên thế giới), Brazil (26%),Argentina (18%) và Trung Quốc (8%) (Trần Phước Đường, 2004)

Hạt đậu nành gồm 3 bộ phận: Vỏ chiếm 8% trọng lượng hạt; phôi chiếm 2%; tửdiệp chiếm 90% (Nguyễn Đức Lượng, 2003; Nguyễn Thị Hiền, 2004)

Hạt đậu nành chứa nhiều protein, lipid, carbohydrate, nhiều loại khoáng chất trong

đó đáng chú ý là calci, phosphor, mangan, kẽm và sắt Ngoài ra, hạt đậu nành chứanhiều loại vitamin, trừ vitamin C và D (Trần Minh Tâm, 2000; Nguyễn ĐứcLượng, 2003; Nguyễn Thị Hiền, 2004; Trần Phước Đường, 2004)

Bảng 1 Thành phần hoá học chính của đậu nành (% căn bản khô)

Bảng 2 Thành phần acid amin tối cần thiết của đậu nành và thành phần acid amin chất

lượng chuẩn của FAO (g/16g protein)

2.2.1.1 Isoflavon

Isoflavon ở hạt đầu nành có hàm lượng cao nhất, chiếm 0,1 ÷ 0,4% trọng lượngchất khô Đã có rất nhiều bài báo cáo khoa học nói về những ảnh hưởng đến có lợicủa isoflavon đối với sức khỏe con người trong việc ngăn ngừa và điều trị bệnh timmạch, ung thư, loãng xương, hội chứng tiền kinh nguyệt và tiền mãn kinh

2.2.1.2 Sapoin

Sapoin là chất hoạt động bề mặt, chiếm 0,17 ÷ 6,16% trong hạt đầu nành Nhiềunghiên cứu đã cho thấy saponin làm giảm hàm lượng cholesterol trong máu do nóliên kết với cholesterol sau đó theo đường ruột và bài tiết ra ngoài Ngoài ra, nócòn làm giảm nguy cơ ung thư và bệnh tim bằng cách liên kết với acid mật, loại bỏ

cholesterol do đó giảm nguy cơ ung thư ruột hay liên kết với tế bào ung thư và nhưthế ức chế được sự phát triển của tế bào ung thư (Liu, 2004).

2.2.1.3 Phytate

Phytate là muối của inositol hexaphosphoric acid (hay acid phytic) với Ca, Mg, K.

Phytate là nguồn cung cấp phosphor chủ yếu của đậu nành, chiếm 1,0 ÷ 1,47%trọng lượng chất khô và đại diện cho 51,4 ÷ 57,1% phosphor của hạt Phytate ảnhhưởng đến hoạt tính sinh học của khoáng chất và tính tan của protein khi hiện diệntrong thực phẩm hay thức ăn chăn nuôi

2.2.1.4 Chất ức chế

Chất ức chế trypsin, do gắn vào cấu trúc của enzyme (trypsin hay chymotrypsin)

và làm mất hoạt tính enzyme Một số nghiên cứu cho thấy chất ức chế trypsin làmphình to tuyến tụy và làm ảnh hưởng đến khả năng tiết dịch tụy để tiêu hóa thức

ăn 75 ÷ 95% chất này bị phá hủy bởi nhiệt

2.2.1.5 Lectin

Lectin hay còn gọi là hemaglutinin, là một loại protein Nghiên cứu trên động vậtlectin liên kết với mô tế bào làm phình to tuyến tụy, giảm insulin trong máu, ứcchế enzyme disaccharidase và proteinase trong ruột, làm suy gan và thận, ảnhhưởng sự hấp thu sắt và chất béo Giống như chất ức chế trypsin, lectin cũng bịphá hũy bởi xử lý nhiệt nhưng xử lý nhiệt ướt hiệu quả hơn xử lý nhiệt khô

2.2.2 Lúa mì

Lúa mì có thành phần chủ yếu là glucid, protein và nước Theo Ngạc Văn Giậu(1983), protein có 4 loại: albumin, globulin, prolamin và glutelin Trong đó chủyếu là glutelin và prolamin, chiếm khoảng 75% hàm lượng protein Trong tinh bộtcủa lúa mì có một lượng nhỏ glucose (0,1 ÷ 0,37%) và các loại đường khác (1 ÷3,7%) Các loại đường này có tầm quan trọng đặc biệt đối với quá trình lên men

Ngoài ra, trong lúa mì còn có một số enzyme như amylase, proteinase (protease),

và E (Ngạc Văn Giậu, 1983; Nguyễn Đức Lượng, 2003; Nguyễn Đức Lượng,2006)

B ảng 3 Thành phần hoá học của bột lúa mì

với nhau Khi hòa tan muối ăn vào nước các phân tử dung môi bao quanh các ion

gọi là sự hydrat hóa (hay solvate hóa), khi lực liên kết giữa các phân tử dung môi

và ion lớn hơn lực hút giữa 2 ion của muối thì mạng tinh thể sẽ bị phá vỡ thành ion

Cl- và Na+

Vì vậy, khi hòa tan muối hay bất kỳ một chất tan vào nước sẽ làm giảm hoạt độcủa nước Hoạt độ của nước được miêu tả là lượng nước dùng để hydrat hóa chấttan, ký hiệu aw

aw = Xw* γw = P/P0Trong đó:

X: là phân tử mol của nước

γw: là hằng số hoạt động của nước

P: là áp suất hơi nước riêng phần của thực phẩm

P0: là áp suất hơi nước riêng phần của nước ở cùng điều kiện

Nước tinh khiết có aw = 1 Mỗi vi sinh vật có một giá trị awgiới hạn, dưới giá trịnày vi sinh vật không thể sống, tạo bào tử và sản sinh độc tố Phần lớn vi sinh vậtphát triển tốt aw = 0,91 ÷ 0,99 Nồng độ nước muối từ 4,4% trỡ lên có thể làmngưng sự phát triển của các loại vi khuẩn gây bệnh và nói chung nồng độ nước

muối đạt 10% thì có thể kiềm chế được sự phát triển của những vi khuẩn thôngthường (Nguyễn Trọng Cẩn và Đỗ Minh Phụng, 1990).

2.2.4 Aspergillus oryzae

Aspergillus oryzae là nấm mốc sinh bào tử đính màu vàng hoa cau, thuộc giống Aspergillus, họ Aspergillaceae, trong bộ Plectascales (Bộ Cúc khuẩn) Họ nấm mốc Aspergillaceae có thể có tới hơn 200 loài Aspergillus sinh khuẩn ty có vách ngăn, sinh đính bào tử trên tế bào hình chai Một số loài trong họ Aspergillaceae

có nhiều ứng dụng trong thực tế sản xuất, chế biến thực phẩm như A oryzae…

Chúng sinh ra nhiều enzyme: amylase, protease, pectinase và được ứng dụng nhiềutrong công nghiệp sản xuất thực phẩm lên men như sản xuất rượu, tương, nướctương… (Lương Đức Phẩm, 2001)

Hình 3: Aspergillus oryzae

A oryzae sinh sản chủ yếu bằng đính bào tử, rất ít khi sinh sản bằng bào tử nang.

Cơ sở phân loại giống Aspergillus là ở đặc điểm cấu tạo, màu sắc của cuống đính bào tử (Lê Xuân Phương, 2001; Nguyễn Văn Bá et al., 2005).

Trước đây, khi sử dụng nấm mốc tự nhiên trong qui trình sản xuất tương và nướctương truyền thống thường gặp phải 2 vấn đề chính:

- Sản lượng và chất lượng sản phẩm không ổn định, hiệu suất thấp

- Nấm mốc sinh độc tố không mong muốn gây hại cho sức khoẻ người sử dụng

Trong giống Aspergillus có một số loài có khả năng sinh độc tố aflatoxin gây độc cho người sử dụng như A flavus, A niger… Bằng việc nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng nấm mốc thuần A oryzae, qui trình sản xuất và nước tương cải tiến đã

khắc phục một phần 2 vấn đề trên (Nguyễn Đức Lượng, 2003)

Nấm mốc Aspergillus oryzae là loại vi sinh vật hiếu khí, phát triển tốt nhất ở pH

5,4 ÷ 6,5; nhiệt độ 27 ÷ 30ºC và độ ẩm 45 ÷ 55% (Nguyễn Thị Hiền, 2004) Khi

A oryzae có khả năng sản xuất nhiều loại enzyme cắt các đại phân tử: như

amylase, pectinase, phosphatase, protease, peptidase, glutaminase và lipase, trong

đó amylase có hoạt lực rất cao (Lê Xuân Phương, 2001) Các enzyme này biến đổicác polymer không hoà tan trong nước thành những chất hoà tan trong nước, cótrọng lượng phân tử nhỏ và có giá trị sinh học cao Đồng thời, các sản phẩmchuyển hoá hoá sinh tạo ra hàng trăm thành phần tạo mùi như aldehyde, amoniac,alcohol, hợp chất chứa sulfur, lactone, làm cho sản phẩm có mùi tự nhiên (LêXuân Phương, 2001)

2.3.1 Ngâm đậu

Nhằm tạo độ ẩm thích hợp cho vi sinh vật và các phản ứng sinh hóa hoạt động.Đồng thời tạo điều kiện cho quá trình nấu nhanh hơn, tiết kiệm nhiên liệu.Trongquá trình ngâm chất khô sẽ hòa tan ra ngoài môi trường nước ngâm dẫn đến hàmlượng chất khô và một số chất khoáng bị mất Các yếu tố có thể ảnh hưởng đếnquá trình ngâm: thời gian ngâm, nhiệt độ ngâm, lượng nước ngâm (Nguyễn ThịHiền, 2004 và Ngạc Văn Dậu, 1983)

2.3.3 Độ ẩm trong quá trình nuôi mốc

Độ ẩm thấp sẽ khuếch tán chậm chất dinh dưỡng và chất chuyển hóa, độ ẩm caodẫn đến sự liên kết cơ chất làm giảm bề mặt phân chia rắn khí Do đó điều chỉnh

độ ẩm vừa đủ, hoạt độ nước thích hợp là cần thiết trong quá trình lên men bề mặt.Theo phương pháp truyền thống thì độ ẩm trong quá trình nuôi mốc được chỉnhbằng kinh nghiệm Theo Wood, (1994) và Hesseltine, (1983) thì độ ẩm thích hợpnhất cho quá trình nuôi mốc là 40 ÷ 45%

2.3.4 Nhi ệt độ trong quá trình nuôi mốc

hợp cho khuẩn ty phát triển đồng thời ngăn cản sự nhiễm Bacillus sp (Liu, 2004).

Trong quá trình nuôi mốc cần chú ý đến việc làm nguội khối nguyên liệu Do sau

20 ÷ 25 giờ ủ, nấm mốc phát triển và hô hấp mạnh làm nhiệt độ khối ủ tăng cao,

nhiệt độ có thể lên đến 400C sẽ làm giảm sản lượng enzyme hoặc có thể làm nấmmốc không phát triển được thậm chí có thể tiêu diệt nấm mốc Vì vậy, cần thôngkhí hoặc khuấy trộn để hạ nhiệt độ (Steinkraus, 2004; Liu, 2004) Trong giai đoạnsau, trước khi hình thành bào tử, hạ nhiệt độ thấp xuống còn 20 ÷ 250C để kíchthích khuẩn ty sản sinh enzyme tối đa (Liu, 2004).

2.3.5 Lên men trong nước muối

Đây là quá trình chuyển hóa chính trong điều kiện có muối, nhằm ngăn cản sựcạnh tranh của các tạp khuẩn trong môi trường giàu đạm và đường khử, đồng thờitiếp tục chuyển hóa tinh bột, protein thành các loại đường, acid amin, các acid hữu

cơ, rượu, aldehyde, ester, cuối cùng cho nước tương có hương vị đặc trương

2.3.6 Nhi ệt độ và khuấy đảo trong quá trình lên men

Nhiệt độ là nhân tố quan trọng trong quá trình thủy phân Thông thường, nhiệt độtăng tốc độ phản ứng thủy phân tuy nhiên nhiệt độ quá cao tốc độ phản ứng thủy

phân bị giảm do enzyme bị biến tính (dưới tác dụng nhiệt độ) Mỗi loại enzyme có

một nhiệt độ tối ưu ở nhiệt độ này thì enzyme đó sẽ cho tốc độ phản ứng cực đại(Dương Thị Hương Giang, 2006) Nhiệt độ thích hợp còn giúp cho sự phát triển vàchuyển hóa của vi sinh vật tối ưu, làm tăng nhanh tốc độ khuếch tán vật chất từđậu nành ra môi trường thủy phân

Nhiệt độ lên men còn phụ thuộc vào độ rộng thiết bị sử dụng Trong quá trình lênmen, thỉnh thoảng khuấy đảo là cần thiết Mục đích khuấy là làm đồng nhất nhiệt

độ trong môi trường thủy phân, làm tăng khả năng tiếp xúc giữa cơ chất vàenzyme, làm tăng khả năng khuếch tán của acid amin hòa tan từ đậu nành ra môitrường bên ngoài Tuy nhiên, khuấy đảo nhiều quá cũng không tốt cho quá trìnhlên men (Liu, 2004)

2.4 M ỘT SỐ NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC VÀ NGOÀI NƯỚC LIÊN QUAN ĐẾN SẢN XUẤT NƯỚC TƯƠNG

Theo Đặng Ánh Tuyết (2008), kết quả của ứng dụng công nghệ sinh học cải tiếnquy trình sản xuất nước tương Cho thấy sử dụng tỉ lệ nguyên liệu đậu nành tách

béo : gạo lúa mì là 1 : 1 và bổ sung 0,2% koji giống thuần Aspergillus oryzae cho

hoạt tính protease cao gấp 3,5 lần so với làm koji theo phương pháp cổ truyền

Sử dụng trực tiếp bánh dầu đậu nành nuôi cấy nấm mốc Aspergllus oryzae để sản

bào tử/ml, thời gian nuôi 56 giờ thì hoạt tính protease là 25 U/gck Sau đó tiếp tụcthuỷ phân ở 450C, pH = 6, cơ chất : dung dịch đệm là 1 : 3 và trong 24 giờ để đạthiệu suất cao nhất (56,7% N) ( Lý Thị Thùy Trang, 2006)

Kết quả của Nguyễn Tiến Sĩ (2007), cho thấy việc sử dụng nguyên liệu bánh dầuđậu nành cho nước tương có chất lượng tốt nhất và có lợi nhất về giá trị kinh tế.Nguyên liệu sau ủ được xay nhuyễn có tác dụng làm tăng khả năng phân cắt củaenzyme amylase đối với các hợp chất đường trong bánh dầu đậu nành Quy trình

có bổ sung enzyme bromelin có tác dụng làm tăng giá trị dinh dưỡng của nướctương và lượng enzyme bromelin bổ sung thích hợp nhất là 10 g/kg

Theo Lý Thị Dù Múa (2005), sử dụng mốc thuần Aspergillus oryzae chế biến nước

tương cho giá trị đạm amin (6,58g/l) và đạm tổng (13,37g/l) cao, gần với giá trịđạm amin (7g/l) và đạm tổng (16g/l) của nước tương Nhật Bản

Phương pháp cải tiến của Nguyễn Đình Trị cho tương hột tốt hơn phương pháp cổtruyền đã được ứng dụng vào trong nghiên cứu tương, kết hợp với tỉ lệ mốc là0,2% và nồng độ nước muối là 15% cho tương có chất lượng tốt nhất (Phạm XuânPhong, 2006)

Ngoài ra theo nghiên cứu Keshun Liu, (2004): Để duy trì sự phát triển và hoạt tínhlên men cao của tế bào nấm men cũng như hạn chế thấp sự nhiễm khuẩn,

Zygosaccharomyces rouxii được bổ sung vào dịch lên men muối trong quá trình

lên men theo phương thức hai giai đoạn Trong giai đoạn đầu, nấm men được nuôicấy trong môi trường 9% (w/v) Muối ăn ở 300C để nấm men phát triển mạnh.Trong giai đoạn hai, chủng vi sinh vật được bổ sung với 16% (w/v) muối ăn ở

150C để ức chế vi khuẩn Lactobacillus.

Theo Chandran Sandhya et al., (2004): Nghiên cứu sản xuất protease trung tính bởi A.oryzae bằng phương pháp lên men bề mặt và lên men chìm Thí nghiệm sử dụng 3 dòng A.oryzae (A.oryzae NRRL1808, 6270, 1989) và 4 dòng Penicillium

sp (P funiculsun NRRL 1768, 1132, P pinophilum NRRL 106, P aculeatum

NRRL 2129) với cơ chất là cám mì Kết quả nuôi cấy bề mặt với dòng nấm

A.oryzae NRRL 1808, ẩm độ môi trường là 43,6%, mật số bào tử 8.108 bào tử/ml,

ở 300C trong 72 giờ sản xuất enzyme có hoạt tính cao

Trong các nghiên cứu trên, quá trình nuôi cấy nấm mốc Aspergillus oryzae đã được các tác giả Chandran Sandhya et al., (2004), Lý Thị Thuỳ Trang (2006),

Đặng Ánh Tuyết (2008) đề cập Khảo sát hoạt tính enzyme protease trong quátrình nuôi cấy nấm mốc để được hoạt tính cao (Lý Thị Thuỳ Trang, 2006 và Đặng

m ốc để đạt được hoạt tính cao chưa được đề cập.

Mặt khác, khi theo dõi quá trình thuỷ phân protein đậu nành trong các đề tài củacác tác giả Ngô Đại Nghiệp (2004), Lý Thị Dù Múa (2005), Phạm Xuân Phong(2006), Lý Thị Thuỳ Trang (2006), Nguyễn Tiến Sĩ (2007), Đặng Ánh Tuyết(2008) thì quá trình thuỷ phân protein đậu nành đều được tiến hành trong điều kiệntĩnh, không có khuấy trộn hoặc khuấy trộn theo định kỳ, khó có thể đưa vào sảnxuất với qui mô công nghiệp

Thêm vào đó, các nghiên cứu trước chỉ chú trọng đến hàm lượng đạm amin trongsản phẩm cuối cùng (Lý Thị Dù Múa, 2005; Phạm Xuân Phong, 2006; Lý ThịThuỳ Trang, 2006; Nguyễn Tiến Sĩ, 2007), chưa quan tâm đúng mức đến các phảnứng của quá trình thuỷ phân, đặc biệt là hàm lượng 3-MCPD, một chất có khảnăng gây ung thư cho người tiêu thụ

Tóm lại, cần phải có một nghiên cứu có thể:

- Các điều kiện lên men có thể kiểm soát được chất lượng nước tương giúp sảnphẩm luôn có chất lượng ổn định

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1.1 Địa điểm và thời gian

- Các thí nghiệm được thực hiện tại Công Ty TNHH Phong Dinh (địa chỉ: 108đường 3/2, Quận Ninh Kiều, TP Cần Thơ) và phòng thí nghiệm Bộ môn côngnghệ thực phẩm Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng của Trường Đại HọcCần Thơ

- Thời gian thực hiện: 9/2/2009 – 15/6/2009

3.1.2 Nguyên li ệu

Đậu nành, bột mì, muối ăn (NaCl), soy protein

Chủng nấm mốc Aspergillus oryzae thương phẩm nhập khẩu từ Nhật.

dịch formaldehyde, methyl đỏ, methyl xanh,

3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Thí nghiệm tiến hành qua các bước:

1 Khảo sát sự phát triển của nấm mốc Aspergillus oryzae trên môi trường có

tỉ lệ phối trộn thành phần bột mì khác nhau: 0% bột mì; 5% bột mì; 10% bột

mì (có quan sát tiến trình phát triển).

2 Khảo sát sự thuỷ phân protein thành acid amin dưới ảnh hưởng của nhiệt

độ, tỉ lệ bột mì và nồng độ muối (thuỷ phân trong các thiết bị sản xuất có

điều khiển nhiệt độ) có khả năng phát triển ở quy mô công nghiệp.

Thực hiện

1 Khảo sát quá trình nuôi cấy nấm mốc Aspergillus oryzae:

enzyme protease theo màu sắc của nấm mốc Sử dụng hệ màu “RGB”

(red, green, blue) hoặc “Lab” để khảo sát hoạt tính nấm mốc theo màu

sắc

 Chụp ảnh quá trình lên mốc (10 min/lần) suốt quá trình lên mốc

khoảng 48h

 Từ đó tìm được mối quan hệ giữa yếu tố màu sắc và hoạt tính củaenzyme trên các thông số tìm được từ kỹ thuật xử lý ảnh

2 Khảo sát sự thuỷ phân protein thành acid amin dưới tác dụng của nhiệt độ

và nồng độ muối:

Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với 2 nhân tố là tỉ lệ phối trộn bột mì (A) vànồng độ muối (B)

 Với A1,A2, A3,lần lượt là tỉ lệ phối trộn của bột mì: 0%, 5%, 10%

 Với B1, B2, B3 lần lượt là nồng độ muối cho vào trong quá trình thủyphân: 0%, 10%, 15%

B ảng 4: Thể hiện sự tương tác giữa hai nhân tố nồng độ muối (A)và tỉ lệ bột mì (B)

Vậy ta có 9 đơn vị thí nghiệm với 1 lần lặp lại

Sơ đồ thí nghiệm được bố trí như hình 4

3.2.1 Qui trình thí nghi ệm sản xuất nước chấm lên men từ đậu nành

Ủ trong tủ ủ, khuấy đảo 1 lần/ngày (500C)

Theo dõi, khuấy đảo 1 lần/ngày, lên men 20÷ 30 ngày

( Lấy mẫu phân tích Đạm:

Từ các thí nghiệm trên mẫu được chọn là mẫu cho ra chất lượng nước tương tốt

(hàng ngày) từ đó ta tính được đạm amin có trong nước tương.

Kết luận: Khả năng thuỷ phân protein thành acid amin và xác định thời gian kếtthúc quá trình thuỷ phân Từ đó xác định thời gian tối ưu, tỉ lệ bột phối trộn trongquá trình ủ và nồng độ muối tối ưu cho quá trình thuỷ phân

3.2.2 Các ch ỉ tiêu cần phân tích

Phân tích các chỉ tiêu chất lượng của nước tương được chế biến từ các phươngpháp khác nhau, trên cơ sở đó có thể so sánh và đánh giá chất lượng nước tương từcác phương pháp chế biến, từ đó chọn ra được một phương pháp chế biến thíchhợp nhất và cho sản phẩm chất lượng tốt nhất

Các chỉ tiêu cần phân tích (phương pháp chi tiết được thể hiện ở phụ lục 1)

a Xác định đạm formol bằng phương pháp chuẩn độ formol.

b Xác định đạm amoniac bằng phương pháp chưng cất lôi kéo hơi nước.

c Đạm amin: Đạm amin = Đạm formol – Đạm amoniac.

3.2.3 Phân tích s ố liệu

- Kết quả thí nghiệm được xử lý bằng kỹ thuật xử lý ảnh (Image Processing) để

thể hiện hoạt lực enzyme protease theo màu sắc của nấm mốc Sử dụng hệ màu

“RGB” (red, green, blue) hoặc “Lab” để khảo sát hoạt tính nấm mốc theo màu sắc,

Excel và phương pháp phân tích thống kê, chọn ra nghiệm thức tối ưu bằngchương trình Statgraphic phus version 4.0

- Sử dụng phương pháp hồi quy nhiều chiều và mặt đáp ứng (Response surfaces)

để đánh giá quá trình thủy phân tối ưu của các mẫu