PHÁT HIỆN NHÂN TỐ GÂY BỆNH VIÊM NHA CHU Ở Porphyromonas gingivalis BẰNG PHƯƠNG PHÁP REALTIME PCR

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC [\ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÁT HIỆN NHÂN TỐ GÂY BỆNH VIÊM NHA CHU Ở Porphyromonas gingivalis BẰNG PHƯƠNG PHÁP REAL-TIME PCR Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực hiện: LÊ THỊ THÚY DUNG Niên khóa: 2006 – 2010 Tháng năm 2010 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC [\ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÁT HIỆN NHÂN TỐ GÂY BỆNH VIÊM NHA CHU Ở Porphyromonas gingivalis BẰNG PHƯƠNG PHÁP REAL-TIME PCR Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực ThS NGUYỄN THỤY DẠ THẢO LÊ THỊ THÚY DUNG CN NGUYỄN DUY KHÁNH Tháng năm 2010 LỜI CÁM ƠN Lời cám ơn chân thành xin gửi đến: ™ Cha mẹ nuôi nấng dạy bảo ngày hôm ™ Ban Giám hiệu Trường Đại học Nơng Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, tất quý thầy cô truyền đạt kiến thức cho em suốt trình học tập trường ™ ThS Nguyễn Thụy Dạ Thảo CN Nguyễn Duy Khánh tận tình hướng dẫn bảo em thực tốt khóa luận tốt nghiệp ™ Anh Phan Quốc Việt, chị Hồ Thị Thanh Thủy, anh Nguyễn Văn Hưng anh chị công ty cổ phần công nghệ Việt Á tạo điều kiện giúp đỡ thời gian thực khóa luận ™ Tập thể lớp Cơng Nghệ Sinh Học DH06SH gắn bó, chia sẻ, giúp đỡ suốt năm qua ™ Các bạn trường ĐH Nha Trang, ĐH Khoa Học Tự Nhiên, ĐH Mở gắn bó, động viên, giúp đỡ tơi thực tốt khóa luận Tp HCM, tháng năm 2010 Sinh viên thực Lê Thị Thúy Dung i TÓM TẮT Bệnh viêm nha chu ảnh hưởng đến phần lớn người dân giới nhiều mức độ nặng nhẹ khác nhau, trường hợp nặng làm đổi màu, hủy hoại dẫn đến gây đau đớn Bệnh chủ yếu gây vi khuẩn Porphyromonas gingivalis với gene gây bệnh nghiêm trọng fimA Do đó, việc phát sớm tác nhân gây bệnh nhằm giảm phát triển bệnh viêm nha chu người trưởng thành ước định mức độ rủi ro hỗ trợ điều trị bệnh Các trình tự gene fimA 16S rRNA tìm kiếm NCBI, sau dùng phần mềm Annhyb, Clustal X, Bioedit để xác định đoạn trình tự tương đồng thiết kế mồi đoạn tương đồng dựa nguyên tắc việc thiết kế mồi Tiếp theo, khảo sát đặc tính hệ primer-probe lý thuyết thực nghiệm: Trên lý thuyết dùng công cụ BLAST NCBI, thực nghiệm khảo sát khả hoạt động, nhiệt độ lai, độ đặc hiệu hệ primer-probe độ nhạy quy trình Sau cùng, hệ primer-probe sau khảo sát, đạt điều kiện chuẩn đưa quy trình vào ứng dụng 30 mẫu bệnh phẩm Thiết kế thành công hệ primer-probe cho hai gene 16S rRNA gene fimA đặc tính hệ primer-probe đạt tiêu chuẩn Kết phát mẫu bệnh phẩm: khoảng 75% mẫu có nhiễm P gingivalis với gene fimA (kết tin cậy được) ii SUMMARY The thesis title: “ DETECT FACTOR CAUSES TO PERIODONTAL DISEASE IN Porphyromonas gingivalis BACTERIA BY REAL-TIME PCR METHOD” Inflammatory periodontal disease affects the majority of people in the world at many different levels of severity In severe cases, it will cause teeth discoloration, damage teeth lead to tooth loss and cause pain The disease is mainly caused by the bacterium Porphyromonas gingivalis with fimA gene that causes the most serious disease Therefore, the early detection of infectious agents is to decrease the development of periodontal inflammation in adults as well as to assess the level of risk and support to treat this disease fimA gene sequences and 16S rRNA gene sequences are searched in the NCBI, then use the software Annhyb, Clustal X, Bioedit to determine the sequence of similarity and design primer on these sequences basing on principle of primer design Second, survey the characteristics of the primer-probe system in theory and experiment: In theory, use BLAST tool on NCBI In experiment, survey the active ability, hybrid temperature, specificity of primer-probe system and the sensitivity of the process Last, the primer-probe system after the survey, reaching the standard conditions, will push the process to be applied on 30 samples Designing successful primer-probe system for the two genes 16S rRNA genes and fimA genes and characteristics of primer-probe systems have reached standards Results found on the disease samples: about 75% of the sample is infected with P gingivalis with fimA gene, reliable results iii MỤC LỤC Trang Lời cám ơn i Tóm tắt ii Summary iii Mục lục iv Danh sách chữ viết tắt vii Danh sách bảng viii Danh sách hình ix Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Yêu cầu đề tài 1.3 Nội dung thực Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Bệnh viêm nha chu 2.1.1 Giới thiệu bệnh viêm nha chu 2.1.1.1 Khái niệm 2.1.1.2 Triệu chứng 2.1.1.3 Tác nhân gây bệnh 2.1.1.4 Bệnh viêm nha chu bệnh khác thể 2.2 Tình hình giới 2.3 Tình hình nước 2.4 Giới thiệu vi khuẩn Porphyromonas gingivalis 2.4.1 Đặc điểm 2.4.2 Phân loại khoa học 2.4.3 Cấu trúc gene 2.4.4 Quá trình biến dưỡng 2.4.5 Tác nhân gây độc 2.4.6 Gene 16S rRNA 2.4.7 Cơ chế gây bệnh 2.4.8 Tiến trình co rút nướu xương 11 iv 2.5 Các phương pháp phát Porphyromonas gingivalis 11 2.5.1 Phương pháp nuôi cấy 11 2.5.2 Phương pháp lai DNA-DNA (checkboard DNA-DNA hybridisation) .12 2.5.3 Phương pháp PCR (PCR assays) 12 2.5.3.2 Nguyên tắc kỹ thuật PCR 13 2.5.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR .14 a DNA mẫu 14 b Enzyme .14 c Primer nhiệt độ lai 14 d Các thành phần khác 15 ¾ Nồng độ dNTP (các deoxynucleotide triphotphat) 15 ¾ Nồng độ MgCl2 15 ¾ Dung dịch đệm .15 ¾ Số lượng chu kỳ phản ứng PCR 15 2.5.4 Phương pháp real-time PCR ứng dụng phát P gingivalis 16 2.5.4.1 Real-time PCR 16 2.5.4.2 Phương pháp real-time PCR sử dụng probe thủy giải 16 2.5.4.3 Các thành phần phản ứng Realtime PCR 17 2.5.4.4 Một số điều lưu ý thực phản ứng real-time PCR 18 2.5.5 Sự khác PCR cổ điển Realtime PCR .21 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 22 3.2 Vật liệu .22 3.2.1 Mẫu 22 3.2.2 Hóa chất .22 3.2.2.1 Hóa chất dùng để tách chiết DNA 22 3.2.2.2 Hóa chất dùng cho phản ứng real-time PCR 25µl 22 3.2.3 Dụng cụ, thiết bị 23 3.3 Phương pháp nghiên cứu 23 3.3.1 Phương pháp thiết kế primer probe 24 3.3.1.1 Nguyên tắc 24 3.3.1.2 Các phần mềm máy tính sử dụng 24 v 3.3.1.3 Phương pháp tiến hành .24 3.3.2 Phương pháp xử lý mẫu bệnh phẩm 24 3.3.2.1 Lấy mẫu bảo quản 24 3.3.2.2 Xử lý mẫu ly trích DNA 24 3.3.3 Phương pháp real-time PCR 25 3.3.4 Phương pháp khảo sát độ nhạy quy trình 26 3.3.5 Phương pháp khảo sát độ đặc hiệu hệ primer-probe 26 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 4.1 Kết 27 4.1.1 Kết thiết kế primer probe 27 4.1.2 Kết khảo sát đặc tính hệ primer probe lý thuyết 31 4.1.3 Kết khảo sát độ đặc hiệu hệ primer-probe lý thuyết .35 4.1.4 Khảo sát khả hoạt động primer-probe 39 4.1.5 Khảo sát nhiệt độ lai hệ primer-probe 40 4.1.6 Khảo sát độ đặc hiệu hệ primer-probe 42 4.1.7 Khảo sát độ nhạy quy trình 42 4.1.8 Ứng dụng quy trình bệnh phẩm 44 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .47 5.1 Kết luận 47 5.2 Đề nghị 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 PHỤ LỤC vi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT • BLAST : Basic local alignment tool • bp : Base pair • CMV: Cytomegalovirus • DNA: Deoxyribonucleotide Acid • HBV: Hepatitis B virus • HCV: Hepatitis C virus • HPV: Human papiloma virus • kDa: Kilo Dalton • LPS : Lipopolysaccharide • MTB: Mycobacterium tuberculosis • NCBI: National Center for Biotechnology Information • Nu: nucleotide • PCR: Polymerase Chain Reaction • P.g: Porphyromonas gingivalis • rRNA: Ribosomal Ribonucleotide Acid vii DANH SÁCH CÁC BẢNG Trang Bảng 4.1 Trình tự primer probe gene fimA 28 Bảng 4.2 Trình tự primer probe gene 16S rRNA 30 Bảng 4.3 Các thông số hệ primer-probe gene fimA 32 Bảng 4.4 Các thông số hệ primer-probe gene 16S rRNA 33 Bảng 4.5 Hetero dimer hai hệ primer-probe gene fimA gene 16S rRNA 33 Bảng 4.6 Kết khảo sát nhiệt độ lai hệ primer-probe gene fimA .41 Bảng 4.8 Kết khảo sát độ nhạy hệ primer- probe gene fimA 43 Bảng 4.9 Kết khảo sát độ nhạy hệ primer- probe gene 16S rRNA 44 Bảng 4.10 Kết thực nghiệm mẫu bệnh phẩm 45 viii Hình 4.17 Kết BLAST trình tự primer ngược gene fimA NCBI Hình 4.18 Kết BLAST trình tự primer xuôi gene 16S rRNA NCBI 37 Hình 4.19 Kết BLAST trình tự probe gene 16S rRNA NCBI Hình 4.20 Kết BLAST trình tự primer ngược gene 16S rRNA NCBI 38 4.1.4 Khảo sát khả hoạt động primer-probe Các phản ứng dùng khảo sát đặc tính primer probe thực với nồng độ 5pM cho primer probe, nghiên cứu có tất năm primer hai probe với tỷ lệ 1:1:1:1:1:1:1 Tiến hành đặt phản ứng real-time PCR mẫu bệnh phẩm tách chiết DNA biết xác nhiễm vi khuẩn P gingivalis mẫu đối chứng âm nước cất vô trùng để kiểm tra tượng ngoại nhiễm Quá trình nhằm kiểm tra khả bắt cặp, khuếch đại phát tín hiệu huỳnh quang probe Chứng dương Đường Chứng âm Hình 4.21 Khảo sát khả hoạt động primer probe gene 16S rRNA Chứng dương Đường Chứng âm Hình 4.22 Khảo sát khả hoạt động primer probe gene fimA 39 fimA 16S rRNA Đường gene fimA Đường gene 16S Hình 4.23 Kết phản ứng multiplex PCR với hai hệ primer-probe Từ hình 4.20 4.21 cho thấy, chứng dương cho tín hiệu đường chứng âm cho tín hiệu đường Hình 4.20 chạy chung hai hệ primerprobe phản ứng với chứng dương cho tín hiệu đường Từ kết luận độ hoạt động hai hệ primer-probe tốt 4.1.5 Khảo sát nhiệt độ lai hệ primer-probe Nhiệt độ lai yếu tố quan trọng trình khuếch đại DNA, ảnh hưởng đến khả bắt cặp hệ primer - probe Nếu nhiệt độ lai khơng thích hợp dẫn đến tượng khuếch đại ký sinh Dùng primer probe khảo sát khả hoạt động để xác định nhiệt độ lai, chạy mix chứng dương với gradient nhiệt độ xác định cách lấy nhiệt độ trung bình primer có nhiệt độ thấp primer có nhiệt độ cao +/5( Ta= (Tm1+ Tm2)/2+/-50C) Từ tính khoảng gradient nhiệt độ từ 55 tới 650 C thành phần (DNA mẫu, primer …) điều kiện khác (điều kiện thiết bị, thời gian phản ứng…) phản ứng giữ nguyên đồng 590C Hình 4.24 Khảo sát nhiệt độ lai hệ primer – probe gene fimA 40 Bảng 4.6 Kết khảo sát nhiệt độ lai hệ primer-probe gene fimA Nhiệt độ(0C) 65 64 63 61 59 57 56 55 55 Phản ứng A03 B03 C03 D03 E03 F03 G03 H03 (-) Ct 28,2 25,9 25,5 26,0 24,6 25,5 25,4 26,2 no Ct 590C Hình 4.25 Khảo sát nhiệt độ lai hệ primer – probe gene 16S rRNA Bảng 4.7 Kết khảo sát nhiệt độ lai hệ primer-probe gene 16S rRNA Phản ứng A03 B03 C03 D03 E03 F03 G03 H03 (-) Nhiệt độ(0C) 65 64 63 61 59 57 56 55 55 Ct 26,2 26,2 25,8 26,1 24,9 25,4 27,6 25,9 no Ct Từ kết cho thấy tất nhiệt độ cho tín hiệu dương tính nhiệt độ 590C có giá trị Ct thấp hai hệ primer-probe gene fimA 16S rRNA tín hiệu huỳnh quang phát sớm nhất, điều có nghĩa nhiệt độ 590C cho hiệu nhân tốt so với nhiệt độ lai khác 41 Từ chúng tơi rút chu trình nhiệt realtime PCR sau: Hình 4.26 Chu trình realtime PCR 4.1.6 Khảo sát độ đặc hiệu hệ primer-probe Thực bước nêu phần phương pháp, thu kết sau: Từ kết nhận thấy mẫu DNA CMV, HPV, HBV, HCV, MTB cho kết dương tính với mix chuyên biệt dùng để phát chúng Nhưng lại cho kết âm tính với mix phát P gingivalis chứng dương P gingivalis cho kết tín hiệu đường Điều cho thấy primer probe có độ đặc hiệu cao Chứng dương P.gingivalis (P.g) HCV dương CMV dương MTB dương HPV dương HBV dương Đường Chứng âm P.g HCV,CMV, MTB, HPV, HBV dương Hình 4.27 Kết khảo sát độ đặc hiệu hệ primer probe 4.1.7 Khảo sát độ nhạy quy trình Độ nhạy cho biết lượng nhỏ mà phương pháp cho kết dương tính Mục đích bước nhằm xác định nồng độ thấp mẫu mà quy trình phát 42 Như bước nêu phần phương pháp, thu kết sau: 105 106 104 103 102 Đường 101 Chứng âm Hình 4.28 Khảo sát độ nhạy hệ primer-probe gene fimA Bảng 4.8 Kết real time PCR khảo sát độ nhạy hệ primer- probe gene fimA Tên mẫu 2.106 Chất phát huỳnh quang FAM Ct 23,91 105 FAM 27,65 10 FAM 31,32 103 FAM 34,92 10 FAM 36,98 101 (-) FAM FAM No Ct No Ct 105 104 106 103 102 Đường 101 Hình 4.29 Khảo sát độ nhạy hệ primer-probe gene 16S rRNA 43 Bảng 4.9 Kết real time PCR khảo sát độ nhạy hệ primer- probe gene 16S rRNA Chất phát Tên mẫu huỳnh quang Ct 2.106 HEX 22,69 105 HEX 25,85 104 HEX 29,76 103 HEX 34,25 102 HEX 36,77 101 HEX No Ct Kết cho thấy chứng âm khơng cho tín hiệu chứng tỏ quy trình hoạt động tốt Các nồng độ từ 2×102 – 2×106 cho tín hiệu huỳnh quang giá trị Ct hai gene fimA 16S rRNA, nồng độ 2×101 khơng thấy tín hiệu Ở nồng độ 2×102 copies/ml, gene fimA cho giá trị Ct 36,98 gene 16S rRNA cho giá trị Ct 36,77 Như có nghĩa quy trình chúng tơi phát DNA P gingivalis nồng độ 2×102 copies/ml Từ đưa đến kết luận độ nhạy quy trình 2×102 copies/ml 4.1.8 Ứng dụng quy trình bệnh phẩm Mẫu bệnh phẩm Tách chiết DNA (Phương pháp phenol/chloroform) Thu nhận DNA Đặt phản ứng Chạy real time PCR Đọc kết Hình 4.30 Quy trình phát gene fimA 16S rRNA P gingivalis 44 Với điều kiện chuẩn khảo sát trên, tiến hành ứng dụng quy trình lên mẫu bệnh phẩm bị bệnh nghi ngờ viêm nha chu Trong mẫu từ – 20 lấy từ bệnh nhân viêm nha chu bệnh viện hàm mặt TPHCM khoa hàm mặt Đại học Y Dược, mẫu từ 21 – 30 lấy đại trà Các mẫu bệnh phẩm sau tách chiết phương pháp phenol/chloroform cho vào phản ứng realtime PCR kèm với chứng dương để xác định hệ primer – probe hoạt động tốt hay không chứng âm để phát ngoại nhiễm hay dương tính giả có Bảng 4.10 Kết thực nghiệm mẫu bệnh phẩm Tên mẫu Ct (fimA) Kết luận Ct (16S rRNA) Kết luận (1) (2) (3) (4) (5) 01 No Ct Âm tính 29,47 Dương tính 02 25,19 Dương tính 24,78 Dương tính 03 17,94 Dương tính 20,45 Dương tính 04 19,53 Dương tính 21,66 Dương tính 05 18,88 Dương tính 21,09 Dương tính 06 36,38 Dương tính 29,49 Dương tính 07 No Ct Âm tính 27,65 Dương tính 08 No Ct Âm tính 25,29 Dương tính 09 27,62 Dương tính 28,71 Dương tính 10 18,77 Dương tính 21,73 Dương tính 11 18,91 Dương tính 21,01 Dương tính 12 29,21 Dương tính 30,51 Dương tính 13 21,83 Dương tính 23,98 Dương tính 14 29,48 Dương tính 21,91 Dương tính 15 26,34 Dương tính 27,67 Dương tính 16 No Ct Âm tính No Ct Âm tính 17 24,21 Dương tính 25,51 Dương tính 18 No Ct Âm tính 21,76 Dương tính 19 22,25 Dương tính 23,45 Dương tính 21 No Ct Âm tính No Ct Âm tính 22 No Ct Âm tính 21,79 Dương tính 45 Bảng 4.10 (tt) Kết thực nghiệm mẫu bệnh phẩm (1) (2) (3) (4) (5) 24 No Ct Âm tính No Ct Âm tính 25 31,18 Dương tính No Ct Âm tính 26 33,21 Dương tính 28,45 Dương tính 27 25,57 Dương tính 27,13 Dương tính 28 No Ct Âm tính No Ct Âm tính 29 No Ct Âm tính No Ct Âm tính 30 36,62 Dương tính No Ct Âm tính Chứng âm No Ct Âm tính No Ct Âm tính Chứng dương 22,26 Dương tính 25,74 Dương tính Kết cho thấy 20 mẫu đầu có 15 mẫu có gene fimA dương tính, 19 mẫu có gene 16S rRNA dương tính, chứng minh bệnh viêm nha chu chủ yếu P gingivalis gây ra, mẫu 16 bị bệnh cho kết âm tính hai gene vi khuẩn khác gây nêu phần tổng quan Trong 10 mẫu đại trà có mẫu có gene fimA dương tính, mẫu có gene 16S rRNA dương tính Paula Juliana Pérez-Chaparro ctv, 2009 ; Jan R van der Ploeg ctv, 2004 sử dụng phương pháp realtime PCR để định type gene fimA vi khuẩn P gingivalis nhằm xác định type gây bệnh chủ yếu kết type II gây bệnh nghiêm trọng Wu Yan-min ctv, 2006 sử dụng phương pháp multiplex PCR để phát đồng thời gene 16S rRNA, collagenase (prtC), fimbria (fimA) P gingivalis gene 16S rRNA, leukotoxin (lktA) A actinomycetemcomitans Nghiên cứu sử dụng phương pháp real-time PCR việc phát vi khuẩn khác biệt hệ primer-probe thiết kế để phát đồng thời hai tác nhân gene fimA chung cho sáu type gene 16S rRNA So với nghiên cứu tác giả Wu Yan-min ctv, 2006 đề tài có ưu điểm nhanh, nhạy, định lượng số lượng Bên cạnh đó, hệ primer-probe không cho biết type gene fimA nên khó khăn việc xác định mức độ nặng nhẹ bệnh Do giới hạn mặt thời gian nên chưa khảo sát kỹ nồng độ primer probe, nồng độ Mg2+ phản ứng, có điều kiện thực giúp cho quy trình hồn thiện 46 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Sau thời gian thực hiện, quy trình phát đồng thời gene 16S rRNA gene fimA vi khuẩn P gingivalis kĩ thuật multiplex real-time PCR xây dựng thành công với hệ primer-probe hai gene theo thứ tự sau: Primer F16: GGT TTA AAG GGT GCG TAG GTT GTT C; Probe 16: GGT AAG TCA GCG GTG AAA CCT GAG CG ; Primer R: CTG CCG CCA CTG AAC TCAA; Primer Ff: TTG CTG CTC TTG CTA TGA CAG C; Probe f: TAA CAA AGA CAA CGA GGC AGA ACC CRT T ; Primer R1: GCT GGT CTT CAA WAC CAC GCT G; Primer R2: TCT TGA ACT TGA CCT GCA TAG ACC A • Nhiệt độ lai thích hợp cho phản ứng 590C • Độ nhạy quy trình cho phép phát lượng DNA P.gingivalis 102 copies/ml phản ứng 5.2 Đề nghị Lập lại quy trình lượng mẫu lớn để khảo sát thống kê So sánh với quy trình khác chuẩn hóa để khẳng định tính hiệu quy trình ứng dụng vào thực tiễn 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Hồ Huỳnh Thùy Dương 2002 Sinh học phân tử Nhà xuất giáo dục 2.Cao Minh Nga, Phan Quốc Việt Hồ Thị Thanh Thủy 2008 Ứng dụng sinh học phân tử chẩn đoán bệnh nhiễm người Tài liệu tập huấn Công ty Việt Á Phạm Hùng Vân 2001 PCR Realtime PCR vấn đề áp dụng thường gặp Nhà xuất y học TIẾNG ANH Atsuo Amano 2007 Disruption of epithelial barrier and impairment of cellular function by Porphyromonas gingivalis Departments of Oral Frontier Biology, Osaka University Graduate School of Dentistry, Suita-Osaka 565-0871, Japan Atsuo Amano, Ichiro Nakagawa, Kosuke Kataoka and Shigeyuki Hamada 1999 Distribution of Porphyromonas gingivalis Strains with fimA Geneotypes in Periodontitis Patients pp 1426–1430 Ashimoto, A., C Chen, I Bakker, and J Slots 1996 Polymerase chain reaction detection of putative periodontal pathogenes in subgingival plaque of gingivitis and advanced periodontitis lesions Oral Microbiol Immunol.11:266–273 Ansai T, Yu W, Urnowey S, Barik S and Takehara T 2003 Construction of a pepO gene-deficient mutant of Porphyromonas gingivalis: potential role of endopeptidase O in the invasion of host cells Oral Microbiol Immunol 18:398–400 Eberhard J, Jepsen S, Jervøe-Storm PM, Needleman I and Worthington HV Fullmouth disinfection for the treatment of adult chronic periodontitis Cochrane Database Syst Rev 2008 Jan 23.(1):CD004622 E Andrian, D Grenier and M Rouabhia Porphyromonas gingivalis-Epithelial Cell Interactions in Periodontitis Groupe de Recherche en Écologie Buccale, Faculté de médecine dentaire, Université Laval, Quebec City, Quebec, Canada, G1K 7P4 Journal of dental research 10 Jan R van der Ploeg, Elin Giertsen, Beat Lüdin , Christian Mörgeli , Annelies S Zinkernagel and Rudolf Gmür 2004 Quantitative detection of Porphyromonas gingivalis fimA geneotypes in dental plaque pp 31-37 11 Jose F Siqueira, Isabela N Rôcas, Milton De Uzeda, Ana P Colombo and Kátia R N Santos 2002 Comparison of 16S rDNA-based PCR and checkerboard DNA–DNA hybridisation for detection of selected endodontic pathogenes.pp 1090-1096 12 Khalil Boutaga, Arie Jan van Winkelhoff, Christina M J E Vandenbroucke-Grauls, and Paul H M Savelkoul 2003 Comparison of Real-Time PCR and Culture for Detection of Porphyromonas gingivalis in Subgingival Plaque Samples pp 4950-4954 13 K Greisen, M Loeffelholz, A Purohit, and D Leong 1994 PCR Primers and Probes for the 16S rRNA Gene of Most Species of Pathogeneic Bacteria, including Bacteria Found in Cerebrospinal Fluid J Clin Microbiol 32, 335-351 48 14 Konrad Sachse and Joachim Frey 2003 Methods in Molecular Biology, vol 216:PCR Detection of Microbial Pathogenes, Humana Press Inc., Totowa, NJ, pp – 15 Loc Giang Do 2001 Smoking and Periodontal Disease in Vietnamese Middle-Aged Population Professor A John Spencer, Social and Preventive Dentistry, Adelaide University pp: 22-23,24-29 16 Oă zlem Yilmaz 2008 The chronicles of Porphyromonas gingivalis: the microbium, the human oral epithelium and their interplay Microbiology, 154, 2897–2903 17 Paula Juliana Pérez-Chaparro, Gloria Inés Lafaurie, Patrice Gracieux, Vincent Meuric, Zohreh Tamanai-Shacoori, Jaime Eduardo Castellanos and Martine BonnaureMallet 2009 Distribution of Porphyromonas gingivalis fimA geneotypes in isolates from subgingival plaque and blood sample during bacteremia pp 1426-1430 18 Park Y, Yilmaz O, Jung IY and Lamont RJ 2004 Identification of Porphyromonas gingivalis genes specifically expressed in human gingival epithelial cells by using differential display reverse transcription-PCR Infect Immun 72:3752–3758 19 Poul Erik Petersen, Denis Bourgeois, Hiroshi Ogawa, Saskia Estupinan-Day and Charlotte Ndiaye 2005 The global burden of oral diseases and risks to oral health 20 Stephen and James 2002 Gingivitis eMedicine 21 Stevens and Jane E January 1997 "Oral Ecology." Technology Review 48-55 http://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Porphyromonas 22 Wu Yan-min, Yan Jie, Chen Li-li, Gu Zhi-yuan 2006 Association between infection of different strains of Porphyromonas gingivalis and Actinobacillus actinomycetemcomitans in subgingival plaque and clinical parameters in chronic periodontitis pp 121-131 INTERNET 23 Báo tuổi trẻ http://tuoitre.vn/Chinh-tri-xa-hoi/Song-khoe/92892/Viem-nha-chuBien-chung-thu-sau-cua-tieu-duong.html 24 Porphyromonas From MicrobeWiki, the student-edited microbiology resource http://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Porphyromonas http://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Porphyromonas gingivalis 25 WHO http://www.who.int/oral_health/en/ 49 PHỤ LỤC Bảng: Họ tên bệnh nhân lấy mẫu nghiên cứu cung cấp Bệnh viện Răng Hàm Mặt TP.HCM STT TÊN STT TÊN Trần Văn Liêm 16 Nguyễn Tuấn Hùng Đỗ Thị Ngọc Diễm 17 Nguyễn Thanh Sơn Nguyễn Thị Đan Thanh 18 Đinh Đào Linh Nguyễn Thành Nam 19 Lê Thị Mỹ Linh Lê Nguyễn Trung Hiếu 20 Phạm Hà Tường Ly Trần Ngọc Quỳnh 21 Nguyễn Thị Yến Thu Trương Thanh Quốc 22 Lê Văn Ngọc Lâm Thị Thanh Hằng 23 Ngô Thị Hân Bùi Quốc Dũng 24 Lê Thị Minh Phương 10 Lê Thị Mai 25 Lê Thị Dung 11 Lương Thành Vinh 26 Trần Nguyên Dũng 12 Nguyễn Thị Trúc Đào 27 Phạm Thị Hoa 13 Nguyễn Lan Phương 28 Hà Thị Anh Thư 14 Trần Thanh Tùng 29 Võ Ngọc Sơn 15 Ngô Quốc Anh 30 Đào Minh Quân ... ta thường thi t kế probe trước thi t kế primer, cặp primer thi t kế gần với vị trí probe khơng trùng lắp Thành phần GC trình tự nucleotide probe phải nằm khoảng 20 – 80% Cần tránh nucleotide lặp... tồn cao dùng để thi t kế primer xuôi probe gene fimA 28 Hình 4.3 Vùng thi t kế primer ngược gene fimA 28 Hình 4.4 Vùng thi t kế primer ngược gene fimA 29 Hình 4.5 Vùng thi t kế primer... không mong muốn với số lượng lớn ¾ Dung dịch đệm Một nồng độ cao dung dịch đệm PCR sử dụng để tăng cường hiệu cho phản ứng PCR Sau dung dịch đệm PCR xem tốt dung dịch đệm có mặt thị trường: •