Phát hiện nhân tố gây bệnh (gene fima) của vi khuẩn p gingivalis bằng phương pháp real time PCR

i LỜI CẢM ƠN Với tất cả lòng kính trọng, em xin chân thành cảm ơn các thầy cô nghành Công nghệ sinh học Trƣờng Đại Học Nha Trang đã giảng dạy và truyền đạt cho em các kiến thức quý báu trong 4 năm qua. Em xin gửi lời cảm ơn tới ban giám đốc Công Ty Cổ Phần Công Nghệ Việt Á đã tạo điều kiện cho em thực hiện và hoàn thành khóa luận này. Em xin cảm ơn cô Nguyễn Thị Hiệp, chị Hồ Thị Thanh Thủy đã tận tình giúp đỡ, giảng dạy và tạo mọi điều kiện thuận lợi để em có thể hoàn thành tốt khóa luận này. Em xin chân thành cảm ơn anh Nguyễn Duy Khánh, anh Nguyễn Văn Hƣng đã tận tình chỉ dẫn em trong suốt thời gian thực hiện khóa luận. Xin gởi lời cảm ơn chân thành đến các anh chị trong Công Ty Cổ Phần Công Nghệ Việt Á đã luôn giúp đỡ, động viên em trong suốt thời gian thực hiện khóa luận. Tôi xin cảm ơn các bạn lớp 48CNSH trƣờng Đại Học Nha Trang, đặc biệt là nhóm bạn thân và các bạn cùng làm khoá luận tại Công Ty Cổ Phần Công Nghệ Việt Á đã luôn giúp đỡ, chia sẽ những kiến thức quý báu trong suốt thời gian làm khoá luận cũng nhƣ trong 4 năm vừa qua Và trên cả, con xin cảm ơn Ba mẹ, anh chị đã luôn động viên, chia sẽ, ủng hộ và tạo mọi điều kiện tốt nhất để con có thể hoàn thành tốt khóa luận này. Sinh viên Đoàn Thị Trang ii MỤC LỤC Trang Phần 1. ĐẶT VẤN ĐỀ i PHẦN 2. TỔNG QUAN 2 1. GIỚI THIỆU BỆNH VIÊM NHA CHU 2 1.1 Bệnh viêm nha chu 2 Thành phần chính trong mảng bám gồm có: 2 1.2 Các triệu chứng của bệnh nhƣ sau 3 1.3 Tác nhân gây bệnh 4 1.4 Ảnh hƣởng của bệnh trên ngƣời 5 2. Tình hình bệnh viêm nha chu trên thế giới và tại Việt Nam 6 2.1 Trên thế giới 6 2.2 Tại Việt Nam 7 3. Vi khuẩn porphyromonas gingivalis 7 3.1 Vi khuẩn Porphyromonas gingivalis 7 3.2 Phân loại khoa học [9] 8 Giới: Eubacteria 8 3.3 Cấu trúc bộ gene 8 3.4. Giới thiệu Gene fimA 9 3.5. Giới thiệu gene 16s rRNA 9 4. Cơ chế gây bệnh viêm nha chu: 10 5. Các phƣơng pháp phát hiện bệnh viêm nha chu 12 5.1. Phƣơng pháp nuôi cấy 13 5.2 Phƣơng pháp lai DNA-DNA (checkboard DNA-DNA hybridisation) 13 5.3 Phƣơng pháp PCR và realtime PCR 13 6. Phƣơng pháp realtime PCR và ứng dụng 14 6.1 Định nghĩa 14 6.2 Nguyên tắc 14 iii 6.3 Các bƣớc cơ bản của một chu kỳ nhân gene 14 6.4. Các thành phần và ảnh hƣởng của chúng tới hiệu quả các phản ứng real time PCR: 16 6.4.1. DNA mẫu (DNA template) 16 6.4.2 Primer và nhiệt độ lai 16 6.4.3 Enzyme 16 6.4.4. Các thành phần khác 16 a. Nồng độ dNTP (các deoxynucleotide triphotphat) 16 b. Nồng độ MgCl 2 17 c. Dung dịch đệm 17 6.5 Ƣu điểm của Real-time PCR 17 6.6 Vấn đề hạn chế đối với Real-time PCR 17 PHẦN 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 18 1. Vật liệu 18 1.1 Mẫu 18 1.2 Primer và probe 18 1.3 Hóa chất xử lý và tách chiết mẫu 19 1.4 Hóa chất phản ứng real time PCR 19 1.5 Thiết bị và dụng cụ 19 2. Phƣơng pháp 20 2.1 Phƣơng pháp thiết kế, đánh giá primer và probe 20 2.1.1 Tiêu chuẩn primer và probe 20 2.1.2 Phƣơng pháp thiết kế primer và probe 21 2.1.3 Phƣơng pháp đánh giá primer và probe 21 1.2. Phƣơng pháp đánh giá độ đặc hiệu của primer trên lý thuyết 21 2.3 Phƣơng pháp tách chiết DNA 22 2.4 Phƣơng pháp real time PCR 23 2.5 Phƣơng pháp khảo sát nhiệt độ lai của hệ primer-probe 24 2.6 Phƣơng pháp khảo sát độ đặc hiệu của hệ primer-probe 25 iv 2.7 Phƣơng pháp khảo sát độ nhạy của quy trình 25 PHẦN 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 1. Kết quả thiết kế primer/probe 27 2. Kết quả khảo sát các đặc tính của mồi 32 3. Kết quả khảo sát tính đặc hiệu và khả năng nhân bản chọn lọc của mồi trên lý thuyết 34 4. Kết quả xây dựng quy trình realtime PCR 38 4.1. Kết quả khảo sát khả năng hoạt động của primer/probe. 38 4.2. Kết quả chạy multiplex realtime PCR với tỷ lệ mỗi primer/probe là 1:1:1:1:1 . 40 4.3. Kết quả khảo sát nhiệt độ lai tối ƣu 42 4.4. Kết quả khảo sát độ đặc hiệu của qui trình 44 4.5. Kết quả khảo sát độ nhạy của quy trình 46 4.6. Kết quả ứng dụng quy trình trên mẫu bệnh phẩm 49 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 588 1. KẾT LUẬN 58 2. ĐỀ NGHỊ 58 v CÁC CHỮ VIẾT TẮT DNA: Deoxynucleotide acid PCR: Polymerase chain reaction FimAF: primer (F) gene fimA FimAP: probe gene fimA FimAR1: primer (R1) gene fimA FimAR2: primer (R2) gene fimA 16SF: primer (F) gene 16S rRNA 16SP: probe gene 16S rRNA 16SR: primer (R) gene 16S rRNA MTB: Mycobacterium tuberculosis CMV: Cytomegalovirus HPV: Human papiloma virus HCV: Hepatitis C virus HBV: Hepatitis B virus IDT: Internetionar DNA Technologies NST: Nhiễm sắc thể vi DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1: Một số thành phần của mảng bám 2 Bảng 2:Hệ primer và probe gene fimA 18 Bảng 3: Hệ mồi và probe gene 16S rRNA 18 Bảng 4: Các thông số của bộ primer-probe của gen fimA 32 Bảng 5: Các thông số của bộ primer-probe của gen 16S rRNA 32 Bảng 6: Hệ số hetero dimer ΔG giữa hai bộ primer-probe của gene fimA và gene 16S rRNA. 34 Bảng 7: Kết quả chạy multiplex realtime PCR với tỷ lệ mỗi primer/probe là 1:1:1:1:1 42 Bảng 8: Kết quả khảo sát nhiệt độ lai tối ưu của hệ primer và probe. 43 Bảng 9: Kết quả khảo sát độ đặc hiệu của quy trình. 46 Hình 30: Kết quả real time PCR khảo sát độ nhạy với primer và probe fimA. 47 Bảng 10: Kết quả real time PCR khảo sát độ nhạy của hệ primer và probe của fimA. 47 Hình 31: Kết quả real time PCR khảo sát độ nhạy với primer và probe 16S rRNA.48 Bảng 11: Kết quả real time PCR khảo sát độ nhạy của hệ primer và probe của gene 16S rRNA. 48 Bảng 12: Kết quả khảo sát quy trình trên mẫu bệnh viêm nha chu dương tính. 49 Bảng13: Kết quả phát hiện gene fimA và 16S rRNA các mẫu bệnh phẩm viêm nha chu của Porphyromonas gingivalis. 51 vii DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1: Bệnh viêm nha chu 4 Hình 2. Vi khuẩn Porphyromonas gingivalis 7 Hình 3: Diễn biến của bệnh 10 Hình 4: Nguyên tắc phản ứng PCR (nguồn Andy Vierstraete, 1999) 15 Hình 5: Sơ đồ bắt cặp của fimAF/ fimAR trên gene fimA. 24 Hình 6: Sơ đồ bắt cặp của 16SF/16SR trên gene 16S rRNA. 24 Hình 7: Kết quả sắp gióng trình tự gene fimA. 27 Hình 8: Vị trí của mồi fimAF trên gene fimA 28 Hình 9: Vị trí của probe fimAP trên gene fimA. 28 Hình 10: Vị trí của mồi fimAR1 trên gene fimA 29 Hình 11: Vị trí của mồi fimAR2 trên gene fimA. 29 Hình 12: Vị trí của mồi 16SF đối với gene 16S rRNA. 30 Hình 13: Vị trí của probe 16SP đối với gene 16S rRNA 31 Hình 14: Vị trí của primer 16SR đối với gene 16S rRNA. 31 Hình 15: Cấu trúc hetero-dimer của probe với 16SR của gene 16S rRNA có giá trị ∆G nhỏ nhất. 33 Hình 16: Cấu trúc hetero-dimer của fimAR1 với fimAR2 của gene fimA có giá trị ∆G nhỏ nhất. 33 Hình 17: Cấu trúc hetero-dimer của 16SP và fimAR1 gene fimA có giá trị ∆G nhỏ nhất. 34 Hình 18: Khả năng đặc hiệu của fimAF đối với gene fimA của loài P.gingivalis. 35 Hình 19: Khả năng đặc hiệu của fimAP đối với gene fimA của loài P.gingivalis. 35 Hình 20: Khả năng đặc hiệu của fimAR1 đối với gene fimA của loài P.gingivalis. 36 Hình 21: Khả năng đặc hiệu của fimAR2 đối với gene fimA của loài P.gingivalis. 36 viii Hình 22: Kết quả sự bắt cặp của primer, probe của gene fimA sau khi chạy trên Annhyb. 37 Hình 23: Sự bắt cặp của primer, probe gene 16S rRNA sau khi chạy trên Annhyb. . 38 Hình 24 : Kết quả khảo sát khả năng hoạt động của primer và probe fimA 39 Hình 25 : Kết quả thử khả năng bắt cặp của primer và probe của 16S rRNA 40 Hình 26 : Kết quả chạy multiplex realtime PCR với tỷ lệ mỗi primer/probe là 1:1:1:1:1 41 Hình 27: Kết quả khảo sát nhiệt độ lai tối ưu của hệ primer và probe. 43 Hình 28: Kết quả chạy real time PCR với các mẫu HBV, HCV, HPV, MTB, CMV với primer và probe đặc hiệu của chúng. 45 Hình 29: Các mẫu khảo sát HBV, HCV, MTB, CMV,HPV với primer và probe của 16S rRNA và fimA. 45 Hình 30: Kết quả real time PCR khảo sát độ nhạy với primer và probe fimA 47 Hình 31: Kết quả real time PCR khảo sát độ nhạy với primer và probe 16S rRNA. . 48 Hình 32: Kết quả real time PCR mẫu 1-6, với primer/probe của 16S rRNA. 53 Hình 33: Kết quả real time PCR mẫu 1-6, với primer/probe của fimA. 53 Hình 34: Kết quả real time PCR mẫu 7-12, với primer/probe của 16S rRNA 54 Hình 35: Kết quả real time PCR mẫu 7-12, với primer/probe của fimA 54 Hình 36: Kết quả real time PCR mẫu 13-18, với primer/probe của 16S rRNA. 55 Hình 37: Kết quả real time PCR mẫu 13-18, với primer/probe của fimA. 55 Hình 38: Kết quả real time PCR mẫu 19-24, với primer/probe của 16S rRNA. 56 Hình 39: Kết quả real time PCR mẫu 19-24, với primer/probe của fimA. 56 Hình 40: Kết quả real time PCR mẫu 25-30, với primer/probe của 16S rRNA. 57 Hình 41: Kết quả real time PCR mẫu 25-30, với primer/probe của fimA. 57 1 Phần 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh viêm nha chu là bệnh răng miệng, nó ảnh hƣởng rất lớn tới dân số thế giới (hơn 90%). Bệnh này gây ra bởi sự tƣơng tác của các vi sinh vật gây hại tồn tại trong miệng, chúng xâm nhập và gây bệnh qua sự tổn thƣơng vùng miệng và sự phòng vệ của cơ thể không thể ngăn chặn đƣợc. Các vi khuẩn này gây hủy hoại răng và làm tổn thƣơng nƣớu gây đau đớn, ảnh hƣởng rất lớn đến cuộc sống hàng ngày. Ngoài ra, bệnh còn gây các bệnh lý khác nhƣ: Bệnh tim mạch và chứng xơ vữa mạch máu, sinh non, bệnh đƣờng hô hấp, đái tháo đƣờng, nhiễm khuẩn huyết, viêm nội tâm mạc nhiễm trùng. Có nhiều tác nhân gây bệnh viêm nha chu. Trong đó, một số tác nhân gây bệnh thƣờng gặp là Porphyromonas gingivalis, Actinobacillus actinomycetem- comitans, Bacteroides forsythus, Treponema denticola, T. socranskii, and Prevotella intermedia. Những vi khuẩn này cùng với P. Gingivalis thƣờng hiện diện ở cùng vị trí, trong các túi nha chu. Vi khuẩn P. gingivalis có nhiều nhân tố gây bệnh nhƣ là fimbriae, collage- nase, hemagglutinins, haemolysin, LPS, proteases, kháng nguyên vỏ. Trong đó theo nghiên cứu thì gene fimA đƣợc xem là tác nhân gây độc quan trọng nhất liên quan đến sự hủy hoại nƣớu trong bệnh răng miệng và là tác nhân chủ yếu gây bệnh viêm nha chu của vi khuẩn P. gingivalis do các hoạt động sinh lý và miễn dịch của chúng. Việc phát hiện bệnh có vai trò quan trọng trong việc theo dõi sự phát triển viêm nha chu ở ngƣời trƣởng thành cũng nhƣ ƣớc định mức độ rủi ro và hỗ trợ điều trị bệnh này. Gần đây, trên thế giới có nhiều báo cáo về việc sử dụng phƣơng pháp khác nhau trong phát hiện P.gingivalis, trong đó có phƣơng pháp real-time PCR để phát hiện P. gingivalis đã cho kết quả chính xác cao nhƣng tại Việt Nam thì chƣa đƣợc nghiên cứu cụ thể.Vì vậy mà chúng tôi thực hiện đề tài “Phát hiện nhân tố gây bệnh (gene fimA) của vi khuẩn P.gingivalis bằng phƣơng pháp real time PCR” nhằm kiểm tra vi khuẩn này bằng phƣơng pháp mới và ứng dụng trong thực tế. 2 PHẦN 2. TỔNG QUAN 1. GIỚI THIỆU BỆNH VIÊM NHA CHU 1.1 Bệnh viêm nha chu Bệnh viêm nha chu là bệnh viêm nƣớu gây chảy máu và để lộ ra nền răng. Nguyên nhân chủ yếu là do vi khuẩn có trong miệng cùng với lớp nhờn và các hạt khác liên tục tạo thành một nếp không màu (mảng bám) trên răng, khi nƣớu bị tổn thƣơng, các vi khuẩn này xâm nhiễm vào vùng chân răng và phá hủy răng, sau đó chúng chuyển qua tồn tại trong các túi nha chu xung quanh răng, tăng cƣờng tiết enzyme làm đứt dây chằng của nƣớu và làm mục xƣơng răng và cuối cùng là gây gãy răng. Lúc đầu, trên răng sẽ hình thành một màng (mảng bám) trong suốt bám vào. Thành phần chính trong mảng bám gồm có: Vi khuẩn: chiếm khoảng 90 - 95% trọng lƣợng ƣớt của mảng bám (1g mảng bám răng (ẩm) có 2x10 11 vi khuẩn). Có khoảng 500 loại vi khuẩn đƣợc tìm thấy ở đây, hiện tại ngƣời ta không thể nuôi cấy hay xác định tất cả chúng. Còn lại 5 - 10% là một số tế bào của vật chủ (tế bào biểu mô, đại thực bào, leukocytes), khuôn hữu cơ và ion vô cơ (gồm chất vô cơ và chất hữu cơ, có nguồn gốc từ nƣớc bọt, dịch nƣớu, thức ăn, sản phẩm của vi khuẩn). Bảng 1: Một số thành phần của mảng bám Thành phần hữu cơ - Glucid :Có nguồn gốc từ vi khuẩn và là chất keo để vi khuẩn bám vào. Chủ yếu Glucid 30 - 40% Lipid 6 – 7% Protein 25 - 30% Nƣớc và các ion khác Còn lại [...]... các vi khuẩn nhƣ Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, P endodontalis ,Bacteroides forsythus, Peptostreptococcus micros và Treponema denticola thì phƣơng ph p này có độ nhạy và độ đặc hiệu th p, khả năng phát hiện gene fimA th p ( theo Jose F Siqueira và ctv, 2002) 5.3 Phƣơng ph p PCR và realtime PCR Ngày nay các phƣơng ph p sinh học phân tử đặc biệt là kỹ thuật PCR, realtime... xác định vi khuẩn P. gingivalis [14] 5.1 Phƣơng ph p nuôi cấy Nuôi cấy kỵ khí là phƣơng ph p đƣợc sử dụng phổ biến nhất để phát hiện và định lƣợng thành phần của mảng nƣớu, và để xác định tính nhạy cảm của vi khuẩn đối với thuốc kháng sinh trong invitro Tuy nhiên, phƣơng ph p này có nhiều trở ngại là tốn thời gian, công sức và độ nhạy th p Điều này là do vi khuẩn gây bệnh trong răng miệng phát triển... 600C, 10-15 phút Cho vào 50μl dung dịch 5- TE 1X để bảo quản mẫu 2.4 Phƣơng ph p real time PCR Trong nghiên cứu này, phƣơng ph p realtime PCR đƣợc thiết kế để phát hiện Porphyromonas gingivalis (dựa trên trình tự đích là gene 16S rRNA) và tác nhân gây bệnh chính của nó là gene fimA Để phát hiện hai gene này, chúng tôi thiết kế hai hệ primer/probe cho gene 16S rRNA và gene fimA Các hệ primer/probe sử dụng... cụ phổ biến hiện nay Tuy nhiên, các phƣơng ph p trên có những nhƣợc điểm nhƣ vi c chuẩn đoán mất nhiều thời gian, kết quả không chính xác Ngoài ra, sử dụng phƣơng ph p PCR khó khăn trong quá trình đọc kết quả.[14] Gần đây, phƣơng ph p Realtime -PCR sử dụng Taqman probe đƣợc phát triển để phân tích định lƣợng DNA So với các phƣơng ph p khác để định lƣợng tác nhân gây bệnh răng miệng, bao gồm cả lai phân... kèm Tuy nhiên ở những phƣơng ph p trƣớc thì vấn đề hạn chế này cũng tƣơng tự, chính vì vậy phƣơng ph p realtime- PCR là phƣơng ph p tối ƣu nhất hiện nay 18 PHẦN 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PH P 1 Vật liệu 1.1 Mẫu Khảo sát trên 30 mẫu dịch phết răng miệng của bệnh nhân vi m nha chu, đƣợc lấy tại Bệnh Vi n Răng Hàm Mặt Trung Ƣơng Mẫu chứng dƣơng đƣợc cung c p bởi Trung Tâm nghiên cứu Gene-Protein, Đại học Y Hà... dài hơn so với lúc trẻ biểu hiện của bệnh vi m nha chu) Ngày nay chúng ta biết rằng có thể ngăn chặn bệnh này bằng vi c đánh răng thƣờng xuyên 5 Các phƣơng ph p phát hiện bệnh vi m nha chu Trong nghiên cứu bệnh vi m nha chu, ngƣời ta đã sử dụng một số phƣơng ph p nhƣ: nuôi cấy vi sinh vật, lai phân tử (DNA- DNA) và phƣơng ph p sinh học phân tử Trong đó, kỹ thuật chuẩn đoán PCR đã trở thành một công cụ... 3 Vi khuẩn porphyromonas gingivalis Hình 2 Vi khuẩn Porphyromonas gingivalis 3.1 Vi khuẩn Porphyromonas gingivalis Vi khuẩn Porphyromonas gingivalis đƣợc tìm thấy trong miệng, phía trên đƣờng hô h p, tiêu hóa và trong ruột già Các vi khuẩn này là vi khuẩn gram âm, kỵ khí, hình que, màu đen, không có khả năng di động, xung quanh tế bào P gingivalis 8 đƣợc bao bọc bởi l p polysaccharide gọi là vỏ capsules... trùng Máy real- time PCR Stratagene 2 Phƣơng ph p 2.1 Phƣơng ph p thiết kế, đánh giá primer và probe 2.1.1 Tiêu chuẩn primer và probe  Tiêu chuẩn thiết kế primer Trong phƣơng ph p PCR, mồi là chỉ tiêu quan trọng nhất để đạt đƣợc sự khuếch đại đặc trƣng và có hiệu quả cao Vi c chọn mồi là giai đoạn mang tính quyết định của phƣơng ph p PCR và tuân thủ một số nguyên tắc: Trình tự của mồi đƣợc chọn sao... các phản ứng này là 2 phản ứng chứng dƣơng và chứng âm cũng đƣợc thực hiện Dựa vào kết quả của các phản ứng này, chúng tôi có thể xác định độ đặc hiệu của primer/probe mà chúng tôi sử dụng 2.7 Phƣơng ph p khảo sát độ nhạy của quy trình Bất kỳ phƣơng ph p nào, các đối tƣợng mục tiêu cũng chỉ có thể đƣợc phát hiện ở một nồng độ giới hạn của chúng trong mẫu Một phƣơng ph p tốt khi nó có thể phát hiện. .. trƣờng phát triển chuyên biệt (theo Khalil Boutaga và ctv, 2003) 5.2 Phƣơng ph p lai DNA-DNA (checkboard DNA-DNA hybridisation) Phƣơng ph p lai DNA-DNA là phƣơng ph p lai số lƣợng lớn DNA mẫu với số lƣợng lớn mẫu dò DNA trên màng lai Nó cho ph p phát hiện đồng thời sự hiện diện của vô số các loài vi khuẩn trong một hoặc nhiều mẫu và đặc biệt ứng dụng trong nghiên cứu dịch tễ học Nhƣng trong vi c phát hiện . mà chúng tôi thực hiện đề tài Phát hiện nhân tố gây bệnh (gene fimA) của vi khuẩn P. gingivalis bằng phƣơng ph p real time PCR nhằm kiểm tra vi khuẩn này bằng phƣơng ph p mới và ứng dụng trong. 21 2.3 Phƣơng ph p tách chiết DNA 22 2.4 Phƣơng ph p real time PCR 23 2.5 Phƣơng ph p khảo sát nhiệt độ lai của hệ primer-probe 24 2.6 Phƣơng ph p khảo sát độ đặc hiệu của hệ primer-probe 25. chế gây bệnh vi m nha chu: 10 5. Các phƣơng ph p phát hiện bệnh vi m nha chu 12 5.1. Phƣơng ph p nuôi cấy 13 5.2 Phƣơng ph p lai DNA-DNA (checkboard DNA-DNA hybridisation) 13 5.3 Phƣơng pháp