Quy trình chẩn đoán bệnh viêm gan siêu vi b bằng phương pháp real time pcr

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CƠNG NGHỆ TP HCM KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP QUY TRÌNH CHẨN ĐỐN BỆNH VIÊM GAN SIÊU VI B BẰNG PHƯƠNG PHÁP REAL-TIME PCR Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực MSSV: 0811110105 : VÕ THỊ HẢI YẾN Lớp: 08CSH2 TP Hồ Chí Minh, 2011 – LỜI CAM ĐOAN — Tơi xin cam đoan luận văn tốt nghiệp công trình nghiên cứu cá nhân, thực sở nghiên cứu lý thuyết Các số liệu, kết thí nghiệm báo cáo luận văn tốt nghiệp trung thực Nội dung báo cáo có tham khảo sử dụng tài liệu, thơng tin đăng tải tạp chí trang web theo danh mục tài liệu tham khảo Khóa luận tốt nghiệp MỤC LỤC LỜI MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đại cương bệnh viêm gan siêu vi B 1.1.1 Định nghĩa bệnh viêm gan siêu vi B .3 1.1.2 Lịch sử bệnh viêm gan siêu vi B 1.2 Đặc điểm sinh học Hepatitis B Virus 1.2.1 Kích thước cấu trúc virus hoàn chỉnh 1.2.2 Cấu trúc gen HBV 1.2.3 Sự tái DNA .6 1.2.4 Các thành phần kháng nguyên 1.2.5 Cách thức tồn khả gây bệnh .7 1.3 Tình hình bệnh viêm gan siêu vi B giới Việt Nam 1.3.1 Tình hình bệnh viêm gan siêu vi B giới 1.3.2 Tình hình bệnh viêm gan siêu vi B nước 10 1.4 Đường lây HBV, triệu chứng lâm sàng, biện pháp phòng ngừa điều trị HBV .11 1.4.1 Đường lây HBV 11 1.4.2 Triệu chứng lâm sàng 13 1.4.3 Biện pháp phòng ngừa điều trị HBV 13 1.5 Các phương pháp chẩn đoán bệnh viêm gan siêu vi B 15 1.5.1 Phương pháp huyết học (phát kháng thể) hóa miễn dịch (phát kháng nguyên) 15 1.5.2 Phương pháp sinh học phân tử 16 CHƯƠNG : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 34 2.1 Vật liệu thiết bị .34 2.1.1 Vật liệu sinh học 34 SVTH : Võ Thị Hải Yến i Khóa luận tốt nghiệp 2.1.2 Thiết bị, dụng cụ 34 2.1.3 Hóa chất .37 2.2 Phương pháp tiến hành 37 2.2.1 Phương pháp thu nhận xử lý mẫu 38 2.2.2 Phương pháp tách chiết .39 2.2.3 Phản ứng Real-time PCR 40 CHƯƠNG : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 42 KẾT LUẬN 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO 46 SVTH : Võ Thị Hải Yến ii Khóa luận tốt nghiệp DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT bDNA branched DNA Bp base pair cDNA complementary DNA Ct Threshold cycle (chu kỳ ngưỡng) DNA Deoxyribonucle acid dNTPs Deoxyribonucleotide triphosphate ELISA Enzyme Linked Immuno Assay HBV Hepatitis B Virus HBcAg Hepatitis B core Antigen HBeAg Hepatitis B envelope Antigen HBsAg Hepatitis B surface Antigen KN Kháng nguyên KT Kháng thể Nu Nuleotide PCR Polymerase chain reaction RNA Ribonucle acid Tm Nhiệt độ nóng chảy mồi SVTH : Võ Thị Hải Yến iii Khóa luận tốt nghiệp DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Virus viêm gan siêu vi B máu bệnh nhân nhìn kính hiển vi điện tử .3 Hình 1.2 Cấu trúc viêm gan B Hình 1.3 Cấu trúc gene HBV Hình 1.4 Sự xâm nhiễm chép HBV Hình 1.5 Sự phân bố HBsAg giới .11 Hình 1.6 Nguyên lý phát HBV phương pháp bDNA 17 Hình 1.7 Nguyên lý PCR 19 Hình 1.8 Tóm tắt chế hoạt động Beacon probe Real-time PCR .24 Hình 1.9 Tóm tắt chế hoạt động probe đơi Real-time PCR .26 Hình 1.10 Tóm tắt chế hoạt động Taqman probe Real-time PCR .28 Hình 1.11 Biểu đồ biểu diễn khuếch đại ghi nhận cường độ huỳnh quang phát từ ống phản ứng nhân ánh sáng kích thích vào chu kỳ nhiệt .33 Hình 2.1 Máy ly tâm thu huyết 34 Hình 2.2 Máy Stratagene Mx300P 34 Hình 2.3 Máy ly tâm 35 Hình 2.4 Máy vortex 35 Hình 2.5 Máy ủ nhiệt khơ 36 Hình 2.6 Máy ly tâm eppendorf 0.2ml 36 Hình 2.7 Quy trình phát HBV phương pháp Real-time PCR 38 Hình 2.8 Chu trình nhiệt Real-time PCR 41 Hình 3.1 Đường biểu diễn khuếch đại mẫu thử nghiệm 43 Hình 3.2 Biểu đồ đường chuẩn 44 SVTH : Võ Thị Hải Yến iv Khóa luận tốt nghiệp LỜI MỞ ĐẦU I Đặt vấn đề Viêm gan siêu vi B Hepatitis B virus (HBV) gây bệnh phổ biến tồn cầu, có diễn biến phức tạp, tỷ lệ chuyển sang mãn tính cao, thường dẫn tới xơ gan ung thư gan Theo tổ chức Y tế giới (WHO), có khoảng tỉ người nhiễm virus viêm gan siêu vi B giới, có khoảng 6% nhiễm viêm gan siêu vi B cấp - 10% số chuyển sang mãn tính người lớn, riêng với trẻ em tỉ lệ lên đến 90% Tỷ lệ tử vong giai đoạn cấp tính 1%, biến chứng viêm gan B cấp viêm gan mãn, xơ gan, xơ gan bù ung thư nguyên phát, dẫn tới tử vong triệu người năm Tại Việt Nam, có khoảng 15 - 20% dân số nhiễm HBV, có khoảng 80 - 92% bệnh nhân xơ gan ung thư gan nguyên phát có nhiễm HBV Một kỹ thuật phổ biến dùng để chẩn đoán bệnh viêm gan siêu vi B sử dụng phương pháp Real-time PCR, cho kết nhanh chóng, độ tin cậy cao, góp phần vào việc điều trị viêm gan mãn tính II Mục tiêu đề tài Do tỷ lệ nhiễm HBV cao nên ngồi biện pháp phịng ngừa vấn đề điều trị nhiễm HBV hay tình trạng mạng virus lâu dài máu quan tâm Nhưng để có hiểu biết vấn đề kể cần phải xác định người mang HBsAg máu có thật nhiễm HBV hay khơng Ngồi ra, để có định điều trị đặc hiệu theo dõi hiệu điều trị phải phát định lượng HBV máu SVTH: Võ Thị Hải Yến Khóa luận tốt nghiệp Trước yêu cầu thực tế đó, khóa luận “Quy trình chẩn đốn bệnh viêm gan siêu vi B phương pháp Real-time PCR” thực với mục đích đề xuất phương pháp định lượng HBV-DNA huyết người bệnh, nhằm giải vấn đề nói III Nhiệm vụ đề tài Giới thiệu sơ lược virus gây bệnh viêm gan siêu vi B Tìm hiểu phương pháp chẩn đốn bệnh viêm gan siêu vi B Tìm hiểu quy trình chẩn đốn bệnh viêm gan siêu vi B phương pháp Real-time PCR IV Phương pháp nghiên cứu Nghiên cứu tài liệu, lý thuyết SVTH: Võ Thị Hải Yến Khóa luận tốt nghiệp CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đại cương bệnh viêm gan siêu vi B 1.1.1 Định nghĩa bệnh viêm gan siêu vi B [19] Viêm gan siêu vi B bệnh viêm gan virus viêm gan B (Hepatitis B Virus) gây ra, truyền nhiễm theo đường máu sinh dục lây đến gần 1/3 dân số toàn giới, nhiều nước phát triển 1.1.2 Lịch sử bệnh viêm gan siêu vi B [5] Bệnh biết từ năm 1883 qua vụ dịch viêm gan 191 người số 1289 cơng nhân đóng tàu Bremen (Anh) chủng đậu mùa Tất bệnh nhân người chủng loại vaccine đậu mùa Năm 1965, Blumberg phát kháng nguyên gây bệnh viêm gan lây truyền qua huyết thanh, đặt tên kháng nguyên Úc Châu (vì tìm thấy người Châu Úc) HBV Dane phát năm 1970 huyết bệnh nhân viêm gan kỹ thuật miễn dịch hiển vi điện tử gọi hạt Dane Hình 1.1 Virus viêm gan siêu vi B máu bệnh nhân nhìn kính hiển vi điện tử [23] SVTH: Võ Thị Hải Yến Khóa luận tốt nghiệp 1.2 Đặc điểm sinh học Hepatitis B Virus [8],[15],[18] Tác nhân gây viêm gan siêu vi B loại virus thuộc họ Hepadnaviridae, tác nhân chủ yếu gây viêm gan ung thư gan, tìm thấy tế bào gan huyết người bị nhiễm bệnh 1.2.1 Kích thước cấu trúc virus hồn chỉnh Hình 1.2 Cấu trúc viêm gan B [24] Virus hoàn chỉnh (virion) tiểu thể hình cầu có đường kính từ 42 47nm gọi hạt tử Dane, gồm: - Một vỏ protein có bề dày khoảng 7nm chứa kháng nguyên bề mặt HBsAg, glycoprotein lipid - Lõi có đường kính khoảng 28nm chứa phân tử DNA, loại kháng nguyên lõi HBcAg, HBeAg số enzyme quan trọng DNA polymerase, protein kinase SVTH: Võ Thị Hải Yến Khóa luận tốt nghiệp CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu thiết bị 2.1.1 Vật liệu sinh học Mẫu thử nghiệm: mẫu huyết 2.1.2 Thiết bị, dụng cụ Hình 2.1 Máy ly tâm thu huyết Máy Real-time PCR hệ thống máy tính, phần mềm hỗ trợ Hình 2.2 Máy Stratagene Mx3000P SVTH: Võ Thị Hải Yến 34 Khóa luận tốt nghiệp Hình 2.3 Máy ly tâm Hình 2.4 Máy vortex SVTH: Võ Thị Hải Yến 35 Khóa luận tốt nghiệp Hình 2.5 Máy ủ nhiệt khơ Hình 2.6 Máy ly tâm eppendorf 0.2ml Miropipette 0.5-10µl, 20-100µl, 100-1000µl Tủ cấy vơ trùng Vật liệu tiêu hao: găng tay, trang, đầu tip có phin lọc, eppendorf SVTH: Võ Thị Hải Yến 36 Khóa luận tốt nghiệp 2.1.3 Hóa chất v Hóa chất cho tách chiết DNA: - Dung dịch (1): Trizol gồm phenol 38%, guanidine thiocyanat 0.8M, glycerol 5%, pH 8.0 - Dung dịch (2): Chloroform - Dung dịch (3): Isopropanol tuyệt đối có chứa chất trợ tủa - Dung dịch (4): Ethanol 70% - Dung dịch (5): dung dịch TE 1X (Tris 0.1M - EDTA 0.001M) v Hóa chất Real-time PCR: - Real-time PCR mix Thành phần phản ứng Real-time PCR 25µl gồm: dung dịch đệm (buffer) 1X, dNTP 200µM, Taq DNA polymerase 0.625 unit, MgCl2 1.5mM, nước cất vơ trùng, mồi mẫu dị - Mẫu chứng âm (nước cất), chứng dương (chứa virus HBV) - Standard HBV (dùng xây dựng đường chuẩn) + Tube PCR mix chứa standard 102 copies + Tube PCR mix chứa standard 104 copies + Tube PCR mix chứa standard 106 copies SVTH: Võ Thị Hải Yến 37 Khóa luận tốt nghiệp 2.2 Phương pháp tiến hành Thu mẫu Tách chiết DNA Thu nhận DNA Thực Real-time PCR Phân tích kết Hình 2.7 Quy trình phát HBV phương pháp Real-time PCR 2.2.1 Phương pháp thu nhận xử lý mẫu - Lấy máu tĩnh mạch, lấy lúc đói buổi sáng tốt - Máu giữ - 8oC tối đa giờ, sau phải tách huyết SVTH: Võ Thị Hải Yến 38 Khóa luận tốt nghiệp - Lấy 3ml máu bệnh nhân cho vào ống nghiệm thu máu chuyên dụng - Ly tâm ống nghiệm chứa máu 3000 vòng/phút 15 phút - Thu khoảng 0.5ml huyết chuyển vào tube 1.5ml vô trùng - Giữ tube huyết -20oC tiến hành xét nghiệm 2.2.2 Phương pháp tách chiết v Nguyên tắc Việc tách chiết DNA bao gồm bước sau: (1) phá màng tế bào, (2) loại protein, (3) tủa DNA Để thu nhận DNA tinh sạch, người ta cần loại bỏ thành phần tạp nhiễm, mà quan trọng protein Sự tách chiết dựa nguyên tắc hòa tan khác phân tử khác (nucleic acid/protein) hai pha khơng hịa tan (phenol, chloroform/nước) Các hóa chất dùng quy trình tách chiết: phenol; guanidine thiocyanat có thành phần dung dịch Trizol, chất biến tính protein mạnh, xử lý với hai hóa chất này, tế bào bị phá vỡ giải phóng thành phần nội bào: DNA; RNA; protein… Chloroform – thường kèm với phenol, có tác dụng bổ sung loại bỏ hoàn toàn dấu vết phenol, chloroform làm biến tính protein yếu phenol Sau ly tâm, mẫu xử lý với Trizol phân tách thành hai lớp: lớp phenol, lớp nước chứa DNA, phần protein bị biến tính nằm bề mặt phân cách hai lớp bị loại bỏ DNA phần dịch thu nhận cách tủa với Isopropanol có bổ sung chất trợ tủa Chất trợ tủa loại polymer có cấu trúc mạng lưới nên dễ dàng bắt phân tử DNA, không ức chế phản ứng PCR Sau tủa, tủa rửa lại lần với Ethanol 70% cuối bảo quản TE 1X v Quy trình thực SVTH: Võ Thị Hải Yến 39 Khóa luận tốt nghiệp - Cho 200µl mẫu (huyết thanh) vào eppendorf có sẵn 900µl dung dịch (1), vortex 30s, để n 10 phút Thêm vào 200µl dung dịch (2), trộn Ly tâm 13000 vịng/phút 10 phút Mục đích bước phá màng tế bào - Thu 600µl dịch có chứa DNA vào eppendorf khác có sẵn 600µl dung dịch (3) Trộn đều, để n 10 phút Ly tâm 13000 vòng/phút 10 phút Đây bước loại protein - Loại bỏ dịch (protein), thu cặn màu hồng (DNA) Cho từ từ 900µl dung dịch (4) vào Ly tâm 13000 vòng/phút phút Với mục đích tủa DNA - Loại bỏ hết dịch nổi, thu cặn Để khô 60oC, 10 phút Cho vào 50µl dung dịch (5) Cuối bước tinh sạch, bảo quản 2.2.3 Phản ứng Real-time PCR Thực phản ứng: - Cho 5µl chứng +, chứng - dịch DNA tách chiết vào tube Real-time PCR mix - Trước sau đặt phản ứng PCR phải ly tâm tube để tất dung dịch nằm đáy tube - Đặt vào máy Real-time PCR với standard - Cài đặt chương trình định dạng vị trí mẫu block nhiệt máy, cài đặt chương trình Real-time PCR: chu kỳ: 95oC 5; 40 chu kỳ: 95oC - 15”, 60oC - 1’ (chọn đọc kết bước này) Chọn chức chờ “Heat lid” đạt 105o chương trình luân nhiệt bắt đầu SVTH: Võ Thị Hải Yến 40 Khóa luận tốt nghiệp Hình 2.8 Chu trình nhiệt Real-time PCR SVTH: Võ Thị Hải Yến 41 Khóa luận tốt nghiệp CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN v Phân tích kết định lượng HBV dựa vào đường chuẩn phương pháp Real-time PCR Để Real-time PCR xác định xác số lượng đích ban đầu có mẫu thử nghiệm phải thực Real-time PCR mẫu thử nghiệm chứa số lượng DNA đích ban đầu cần xác định số lượng lúc với mẫu chuẩn chứa số lượng DNA đích ban đầu biết rõ số lượng Và thường mẫu chuẩn mẫu pha loãng theo hệ số pha lỗng 10 chứa số lượng DNA đích ban đầu Sau hoàn tất chu kỳ nhiệt Realtime PCR, biểu đồ khuếch đại, mẫu chuẩn mẫu thử nghiệm có đường biểu diễn khuếch đại tương ứng với đường biểu diễn khuếch đại này, mẫu chuẩn mẫu thử nghiệm có chu kỳ ngưỡng (Ct) Đường biểu diễn vẽ lên mối quan hệ chu kỳ ngưỡng với số lượng DNA đích ban đầu có mẫu chuẩn, gọi đường biểu diễn chuẩn (standard curve) Đây đường thẳng tuyến tính qua điểm tọa độ xác định số lượng DNA đích ban đầu mẫu chuẩn (trên trục tung) chu kỳ ngưỡng ống phản ứng chứa số lượng DNA đích Trên biểu đồ chuẩn này, trục tung (Y) Ct trục hồnh (X) số lượng DNA đích ban đầu có mẫu chuẩn SVTH: Võ Thị Hải Yến 42 Khóa luận tốt nghiệp Định tính Hình 3.1 Đường biểu diễn khuếch đại mẫu thử nghiệm - Mẫu chuẩn dương: dương tính, cho thấy mồi mẫu dị hoạt động bình thường - Chứng nội: dương tính, chứng tỏ phản ứng diễn bình thường - Mẫu chứng âm: âm tính, chứng tỏ quy trình thực tốt, khơng có tượng nhiễm chéo xảy - Mẫu thử nghiệm: có kết dương tính với HBV SVTH: Võ Thị Hải Yến 43 Khóa luận tốt nghiệp Định lượng Hình 3.2 Biểu đồ đường chuẩn Qua biểu đồ đường chuẩn ta thấy E=101.7% (nằm khoảng 90105%), R2=0.999 (≥ 0.99) độ dốc (slope lý tưởng -3.32) đường biểu diễn -3.281 Có thể kết luận biểu đồ chuẩn lý tưởng - Tính tốn số lượng ban đầu Các mẫu chuẩn mẫu thử nghiệm có chu kỳ ngưỡng (Ct) Do biết số lượng ban đầu mẫu chuẩn, ta xây dựng phương trình đường chuẩn thể mối tương quan chu kỳ ngưỡng số lượng chu kỳ ngưỡng =a*log(số lượng ban đầu) +b (1) Từ Ct mẫu xét nghiệm phương trình (1) ta xác định số lượng ban đầu mẫu xét nghiệm SVTH: Võ Thị Hải Yến 44 Khóa luận tốt nghiệp KẾT LUẬN Trước yêu cầu cấp thiết nhà nghiên cứu y học, cần phải có thử nghiệm phát định lượng HBV-DNA máu người bệnh nghi nhiễm HBV Nhờ đó, nhà nghiên cứu y học biết tình trạng nhiễm HBV thật người bệnh, cho định điều trị đặc hiệu, theo dõi hiệu điều trị Khóa luận thực nhằm tìm hiểu quy trình chẩn đốn bệnh viêm gan siêu vi B phương pháp Real-time PCR Kết thu cho thấy việc sử dụng kỹ thuật Real-time PCR chẩn đoán HBV cho độ nhạy cao, kết xác, ổn định đặc biệt áp dụng cách dễ dàng Với kết luận trên, hy vọng phương pháp Real-time PCR chẩn đoán bệnh viêm gan siêu vi B sử dụng rộng rãi phịng thí nghiệm việc theo dõi điều trị bệnh SVTH: Võ Thị Hải Yến 45 Khóa luận tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt [1] Hồ Huỳnh Thùy Dương (2002) Sinh học phân tử (khái niệm-phương pháp-ứng dụng) NXB giáo dục [2] Nguyễn Hữu Chí Chủng ngừa viêm gan siêu vi B NXB TPHCM [3] Lê Thị Hịa (2010) Xây dựng quy trình phát đồng thời Chlamydia Trachomatis Nisseria gonorhoeae kỹ thuật Real-time PCR Đồ án tốt nghiệp đại học [4] Tạ Hùng Vương, Nguyễn Trần Khánh (2010) Xác định tỷ lệ HBV Genotyping bệnh nhân nhiễm HBV mạn tính Việt Nam Báo cáo thực tập tốt nghiệp [5] Lưu Phương Nam (2011) Quy trình định lượng HBV phương pháp Real-time PCR Báo cáo thực tập tốt nghiệp [6] Phan Quốc Việt, Hồ Thị Thanh Thủy (2008) Ứng dụng sinh học phân tử chẩn đoán bệnh nhiễm người Tài liệu tập huấn Công ty Cổ phần Thương mại Sản xuất Dịch vụ Việt Á [7] Phạm Hùng Vân (2009) PCR Real-time PCR Các vấn đề áp dụng thường gặp NXB Y học chi nhánh TP.HCM [8] Lê Thúy Quyên (1999) PCR-phát định lượng HBV-DNA Luận án thạc sĩ khoa học [9] Bruce Alberts, Alexander Johnson, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts, and Peter Walter (2008) Molecular Biology of the cell NXB: Taylor & Francis Tài liệu tiếng Anh SVTH: Võ Thị Hải Yến 46 Khóa luận tốt nghiệp [10] Welzel TM, Miley WJ, Parks TL, Goedert JJ, Whitby D, OrtizConde BA (2006 Sep) Real-time PCR assay for detection and quantification of hepatitis B virus genotypes A to G [11] Monjardino J, Velosa J, Thomas HC, de Moura MC (1991 Jul) Serum HBV DNA detected by PCR in dot blot negative HBV chronic carriers with active liver disease [12] Dr Yamina Lazizi*, Jacques Pillot (March 1993) Delayed clearance of HBV-DNA detected by PCR in the absence of viral replication [13] Chien-Hung Chen a, Jin-Town Wang a,b,* , Cha-Ze Lee a, Jin-Chuan Sheu a, Teh-Hong Wang a, Ding-Shinn Chen a,c (January 1995) Quantitative detection of hepatitis B virus DNA in human sera by branchedDNA signal amplification [14] Gregory J Tsongalis, PhD (2006) Branched DNA Technology in Molecular Diagnostics Tài liệu Internet [15] http://yhocquany.com/?cmd=act:news|newsid:840 [16] http://vietbao.vn/Suc-khoe/ [17] http://nhasinhhoctre.com [18] http://www.drthuthuy.com/reseach/HBVGenotype.html [19]http://dichbenh.com/index.php/viem-gan-sieu-vi-b/8-kien-thuc/103-tongquat-ve-viem-gan-sieu-vi-b [20] http://giangduongykhoa.wordpress.com [21] http://tusach.thuvienkhoahoc.com/wiki/ELISA [22] http://cesti.gov.vn [23] http://ungthu.org/cacbenhungthu/ut_gan/Hep_B.asp [24] http://vho.vn/wap/?module=1&id=17108 [25] http://www.camnangbenh.com/gan-mat-tuy/viem-gan-sieu-vi-b/ SVTH: Võ Thị Hải Yến 47 Khóa luận tốt nghiệp [26] http://vi.wikipedia.org/wiki/Viem_gan_sieu_vi_B [27] https://www.qiagen.com/geneglobe/pathwayview.aspx?pathwayID=217 SVTH: Võ Thị Hải Yến 48 ... sơ lược virus gây b? ??nh vi? ?m gan siêu vi B Tìm hiểu phương pháp chẩn đốn b? ??nh vi? ?m gan siêu vi B Tìm hiểu quy trình chẩn đốn b? ??nh vi? ?m gan siêu vi B phương pháp Real- time PCR IV Phương pháp nghiên... TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đại cương b? ??nh vi? ?m gan siêu vi B 1.1.1 Định nghĩa b? ??nh vi? ?m gan siêu vi B [19] Vi? ?m gan siêu vi B b? ??nh vi? ?m gan virus vi? ?m gan B (Hepatitis B Virus) gây ra, truyền nhiễm theo... gây b? ??nh .7 1.3 Tình hình b? ??nh vi? ?m gan siêu vi B giới Vi? ??t Nam 1.3.1 Tình hình b? ??nh vi? ?m gan siêu vi B giới 1.3.2 Tình hình b? ??nh vi? ?m gan siêu vi B nước 10 1.4 Đường lây HBV,