Quy trình chẩn đoán bệnh viêm gan siêu vi B bằng phương pháp real -time PCR

Theo tổ chức Y tế thế giới WHO, hiện nay có khoảng 2 tỉ người nhiễm virus viêm gan siêu vi B trên thế giới, trong đó có khoảng 6% nhiễm viêm gan siêu vi B cấp và 5 - 10% trong số này chu

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN BỆNH VIÊM GAN SIÊU VI B

BẰNG PHƯƠNG PHÁP REAL-TIME PCR

Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Tôi xin cam đoan bài luận văn tốt nghiệp này là công trình nghiên cứu của cá nhân, được thực hiện trên cơ sở nghiên cứu lý thuyết

Các số liệu, những kết quả thí nghiệm trong báo cáo luận văn tốt nghiệp

là trung thực Nội dung bài báo cáo này có tham khảo và sử dụng các tài liệu, thông tin được đăng tải trên các tạp chí và các trang web theo danh mục tài liệu tham khảo

MỤC LỤC

LỜI MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Đại cương về bệnh viêm gan siêu vi B 3

1.1.1 Định nghĩa bệnh viêm gan siêu vi B 3

1.1.2 Lịch sử bệnh viêm gan siêu vi B 3

1.2 Đặc điểm sinh học của Hepatitis B Virus 4

1.2.1 Kích thước và cấu trúc của virus hoàn chỉnh 4

1.2.2 Cấu trúc bộ gen của HBV 5

1.2.3 Sự tái bản DNA 6

1.2.4 Các thành phần kháng nguyên 6

1.2.5 Cách thức tồn tại và khả năng gây bệnh 7

1.3 Tình hình bệnh viêm gan siêu vi B trên thế giới và Việt Nam 9

1.3.1 Tình hình bệnh viêm gan siêu vi B trên thế giới 9

1.3.2 Tình hình bệnh viêm gan siêu vi B trong nước 10

1.4 Đường lây của HBV, triệu chứng lâm sàng, biện pháp phòng ngừa và điều trị HBV 11

1.4.1 Đường lây của HBV 11

1.4.2 Triệu chứng lâm sàng 13

1.4.3 Biện pháp phòng ngừa và điều trị HBV 13

1.5 Các phương pháp chẩn đoán bệnh viêm gan siêu vi B 15

1.5.1 Phương pháp huyết thanh học (phát hiện kháng thể) và hóa miễn dịch (phát hiện kháng nguyên) 15

1.5.2 Phương pháp sinh học phân tử 16

CHƯƠNG 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 34

2.1 Vật liệu thiết bị 34

2.1.1 Vật liệu sinh học 34

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ 34

2.1.3 Hóa chất 37

2.2 Phương pháp tiến hành 37

2.2.1 Phương pháp thu nhận và xử lý mẫu 38

2.2.2 Phương pháp tách chiết 39

2.2.3 Phản ứng Real-time PCR 40

CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 42

KẾT LUẬN 45

TÀI LIỆU THAM KHẢO 46

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

bDNA branched DNA

Bp base pair

cDNA complementary DNA

Ct Threshold cycle (chu kỳ ngưỡng)

DNA Deoxyribonucle acid

dNTPs Deoxyribonucleotide triphosphate

ELISA Enzyme Linked Immuno Assay

HBV Hepatitis B Virus

HBcAg Hepatitis B core Antigen

HBeAg Hepatitis B envelope Antigen

HBsAg Hepatitis B surface Antigen

KN Kháng nguyên

KT Kháng thể

Nu Nuleotide

PCR Polymerase chain reaction

RNA Ribonucle acid

Tm Nhiệt độ nóng chảy của mồi

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Virus viêm gan siêu vi B trong máu của một bệnh nhân nhìn dưới kính

hiển vi điện tử 3

Hình 1.2 Cấu trúc viêm gan B 4

Hình 1.3 Cấu trúc bộ gene HBV 5

Hình 1.4 Sự xâm nhiễm và sao chép HBV 8

Hình 1.5 Sự phân bố HBsAg trên thế giới 11

Hình 1.6 Nguyên lý phát hiện HBV bằng phương pháp bDNA 17

Hình 1.7 Nguyên lý PCR 19

Hình 1.8 Tóm tắt cơ chế hoạt động của Beacon probe trong Real-time PCR 24

Hình 1.9 Tóm tắt cơ chế hoạt động của probe đôi trong Real-time PCR 26

Hình 1.10 Tóm tắt cơ chế hoạt động của Taqman probe trong Real-time PCR 28

Hình 1.11 Biểu đồ biểu diễn khuếch đại ghi nhận cường độ huỳnh quang phát ra từ ống phản ứng khi nhân được ánh sáng kích thích vào mỗi chu kỳ nhiệt 33

Hình 2.1 Máy ly tâm thu huyết thanh 34

Hình 2.2 Máy Stratagene Mx300P 34

Hình 2.3 Máy ly tâm 35

Hình 2.4 Máy vortex 35

Hình 2.5 Máy ủ nhiệt khô 36

Hình 2.6 Máy ly tâm eppendorf 0.2ml 36

Hình 2.7 Quy trình phát hiện HBV bằng phương pháp Real-time PCR 38

Hình 2.8 Chu trình nhiệt của Real-time PCR 41

Hình 3.1 Đường biểu diễn khuếch đại mẫu thử nghiệm 43

Hình 3.2 Biểu đồ đường chuẩn 44

LỜI MỞ ĐẦU

I Đặt vấn đề

V iêm gan siêu vi B do Hepatitis B virus (HBV) gây bệnh phổ biến trên

toàn cầu, có diễn biến phức tạp, tỷ lệ chuyển sang mãn tính cao, thường dẫn tới xơ gan và ung thư gan Theo tổ chức Y tế thế giới (WHO), hiện nay có khoảng 2 tỉ người nhiễm virus viêm gan siêu vi B trên thế giới, trong đó có khoảng 6% nhiễm viêm gan siêu vi B cấp và 5 - 10% trong số này chuyển sang mãn tính ở người lớn, riêng với trẻ em tỉ lệ này lên đến 90% Tỷ lệ tử vong trong giai đoạn cấp tính là 1%, biến chứng của viêm gan B cấp là viêm gan mãn, xơ gan, xơ gan mất bù và ung thư nguyên phát, dẫn tới tử vong 1 triệu người mỗi năm Tại Việt Nam, hiện nay có khoảng 15 - 20% dân số nhiễm HBV, trong đó có khoảng 80 - 92% bệnh nhân xơ gan và ung thư gan nguyên phát có nhiễm HBV

Một trong những kỹ thuật phổ biến dùng để chẩn đoán bệnh viêm gan siêu vi B được sử dụng hiện nay là phương pháp Real-time PCR, cho kết quả nhanh chóng, độ tin cậy cao, góp phần vào việc điều trị viêm gan mãn tính

II Mục tiêu đề tài

Do tỷ lệ nhiễm HBV khá cao nên ngoài biện pháp phòng ngừa thì vấn đề điều trị nhiễm HBV hay tình trạng mạng virus lâu dài trong máu cũng đang rất quan tâm Nhưng để có thể có được những hiểu biết về các vấn đề kể trên thì cần phải xác định được một người đang mang HBsAg trong máu có thật sự đang nhiễm HBV hay không Ngoài ra, để có được chỉ định điều trị đặc hiệu cũng như theo dõi được hiệu quả điều trị thì phải phát hiện cũng như định lượng được HBV trong máu

Trước yêu cầu thực tế đó, khóa luận “Quy trình chẩn đoán bệnh viêm gan siêu vi B bằng phương pháp Real-time PCR” được thực hiện với mục đích đề xuất phương pháp định lượng HBV-DNA trong huyết thanh của người bệnh, nhằm giải quyết các vấn đề nói trên

III Nhiệm vụ đề tài

Giới thiệu sơ lược về virus gây bệnh viêm gan siêu vi B

Tìm hiểu các phương pháp chẩn đoán bệnh viêm gan siêu vi B

Tìm hiểu quy trình chẩn đoán bệnh viêm gan siêu vi B bằng phương pháp Real-time PCR

IV Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu tài liệu, lý thuyết

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Đại cương về bệnh viêm gan siêu vi B

1.1.1 Định nghĩa bệnh viêm gan siêu vi B [19]

Viêm gan siêu vi B là bệnh viêm gan do virus viêm gan B (Hepatitis B Virus) gây ra, truyền nhiễm theo đường máu và sinh dục lây đến gần 1/3 dân

số trên toàn thế giới, nhiều nhất tại các nước đang phát triển

1.1.2 Lịch sử bệnh viêm gan siêu vi B [5]

Bệnh được biết từ năm 1883 qua một vụ dịch viêm gan trên 191 người trong số 1289 công nhân đóng tàu ở Bremen (Anh) được chủng đậu mùa Tất

cả bệnh nhân là những người được chủng cùng một loại vaccine đậu mùa

Năm 1965, Blumberg phát hiện kháng nguyên gây bệnh viêm gan lây truyền qua huyết thanh, đặt tên là kháng nguyên Úc Châu (vì tìm thấy trên

một người ở Châu Úc)

HBV do Dane phát hiện năm 1970 trong huyết thanh của những bệnh nhân viêm gan bằng kỹ thuật miễn dịch hiển vi điện tử và được gọi là hạt Dane

Hình 1.1 Virus viêm gan siêu vi B trong máu của một bệnh nhân nhìn

dưới kính hiển vi điện tử [23]

1.2 Đặc điểm sinh học của Hepatitis B Virus [8],[15],[18]

Tác nhân gây viêm gan siêu vi B là một loại virus thuộc họ Hepadnaviridae, là tác nhân chủ yếu gây viêm gan và ung thư gan, được tìm thấy trong tế bào gan và trong huyết thanh của người bị nhiễm bệnh

1.2.1 Kích thước và cấu trúc của virus hoàn chỉnh

Hình 1.2 Cấu trúc viêm gan B [24]

Virus hoàn chỉnh (virion) là một tiểu thể hình cầu có đường kính từ 42 -

47nm được gọi là hạt tử Dane, gồm:

- Một vỏ protein có bề dày khoảng 7nm chứa kháng nguyên bề mặt HBsAg, glycoprotein và lipid

- Lõi có đường kính khoảng 28nm chứa một phân tử DNA, 2 loại kháng nguyên lõi là HBcAg, HBeAg và một số enzyme quan trọng như DNA polymerase, protein kinase

1.2.2 Cấu trúc bộ gene của HBV

Phân tử DNA của virus có dạng vòng, chứa khoảng 3,2Kb gồm hai mạch đơn có chiều dài khác nhau: một mạch dài hay mạch [-] là mạch hoàn chỉnh

và một mạch ngắn là mạch [+] liên kết với phân tử DNA polymerase

Hình 1.3 Cấu tạo bộ gene HBV [18]

Mạch [-] có 4 vùng mã hóa đã được xác định: gene S, gene C, gene P và gene X

v Gene S (surface)

Mã hóa kháng nguyên bề mặt HBsAg, gồm ba vùng (pre S1, pre S2, S)

mã hóa ba loại protein của HBsAg

- Vùng S mã hóa protein nhỏ (là protein chủ yếu vì nó chiếm đa số) chứa

226 acid amin, có vị trí gắn glucose

- Vùng S và pre S2 mã hóa loại protein trung bình chứa 281 acid amin,

có vị trí gắn glucose

- Vùng S, pre S1, pre S2 mã hóa protein lớn chứa 389 - 400 acid amin, không có vị trí gắn glucose

có vai trò trong viêm gan siêu vi mãn và viêm gan siêu vi tối cấp

v Gene P (pol hay polymerase)

Gene P chiếm 3/4 bộ gene của virus Gene này gối lên phần cuối gene C, phần đầu gene X và toàn bộ gene S Gene P mã hóa một polypeptide cơ bản,

có hoạt tính DNA polymerase và ribonuclease H

1.2.4 Các thành phần kháng nguyên

v Kháng nguyên bề mặt (HBsAg)

HBsAg được tìm thấy trong huyết thanh người dưới dạng một thành phần của virus hoàn chỉnh hay dạng không hoàn chỉnh

Năm 1968, Bayer và cộng sự đã quan sát được hai dạng HBsAg dưới kính hiển vi điện tử

v Kháng nguyên lõi

Gồm hai loại: HBcAg và HBeAg

- HBcAg được tìm thấy trong nhân tế bào gan bị nhiễm HBV, trong huyết thanh người bị nhiễm HBcAg hiện diện như là một thành phần của một virus hoàn chỉnh, chứ không có ở dạng tự do

- HBeAg là loại kháng nguyên hòa tan trong huyết thanh Ở tế bào gan HBeAg hiện diện trong tế bào chất, sẽ được giải phóng khỏi phần lõi của virus khi xử lý với các chất mạnh

1.2.5 Cách thức tồn tại và khả năng gây bệnh

Các HBV gắn vào các receptor của nó trên màng tế bào gan Sau đó, chúng bị tế bào nuốt vào trong theo kiểu ẩm bào Vỏ capsid của nó (khi đã lọt vào tế bào) sẽ được một enzyme thích hợp của tế bào phân hủy và acid nucleic của HBV được giải phóng Acid nucleic này đi vào nhân tế bào gan, tại đây sẽ tái tổng hợp tiến hành phiên mã, dịch mã và cuối cùng tạo sợi DNA mới Các sợi này được lắp ráp qua lưới nội chất tạo ra các virion, và cuối cùng các virion được xuất bào ra ngoài

Virus gắn vào bề mặt tế bào gan: HBV gắn vào bề mặt tế bào gan cảm thụ nhờ sự phù hợp giữa thụ thể của tế bào với protein trên màng của virus

Virus xâm nhập tế bào: Sau khi bám vào thụ thể của tế bào chủ, có sự hòa nhập vỏ virus với màng tế bào, sau đó capsid được phóng thích vào trong

tế bào

Virus nhân lên trong tế bào: Đầu tiên, các thông tin di truyền của virus được mã hóa trong các phân tử DNA sẽ được phiên mã sang các RNA thông tin của virus Quá trình này cần đến sự tham gia của các enzyme RNA polymerase Các tRNA của virus sẽ đóng vai trò truyền tin để tạo ra các DNA của virus và các protein của vỏ capsid của virus, các virus mới sẽ được lắp ráp

từ DNA và protein

Hình 1.4 Sự xâm nhiễm và sao chép HBV [27]

1.3 Tình hình bệnh viêm gan siêu vi B trên thế giới và Việt Nam [2],[4]

1.3.1 Tình hình bệnh viêm gan siêu vi B trên thế giới

Theo tổ chức y tế thế giới (WHO), hiện nay trên thế giới có khoảng 2 tỉ người bị nhiễm HBV và 350 triệu người mang mầm bệnh mãn tính

Viêm gan siêu vi B thường là nguyên nhân dẫn đến viêm gan mãn tính,

xơ gan và ung thư gan nguyên phát với tỷ lệ tử vong là 1 - 2 triệu người

Các genotype HBV khác nhau phân bố ở vùng địa lý đặc trưng khác nhau:

- Genotype A phổ biến ở Bắc Mỹ, Châu Âu, Nam Phi và Ấn Độ

- Genotype B và C thì phổ biến ở Châu Á

- Genotype D phổ biến ở Châu Âu (vùng Địa Trung Hải), Trung Đông,

Ấn Độ và Nam Phi

- Genotype E phổ biến ở Tây Phi

- Genotype F phổ biến ở Trung và Nam Mỹ, Alaska

- Genotype G phổ biến ở Châu Âu, Mexico, Mỹ

- Genotype H thường thấy ở Trung Mỹ, Mỹ, Nhật Bản

Tình hình HBV thay đổi theo từng khu vực địa lý Tùy theo tỷ lệ người mang HBsAg [+] mà người ta chia làm 3 khu vực chính:

1.3.1.1 Khu vực lưu hành thấp

Tỷ lệ HBsAg [+] khoảng 0,1 - 0,5% dân số như ở Bắc Mỹ, Tây Âu và

Úc Tỷ lệ người mang HBsAg cao nhất ở khoảng tuổi từ 20 - 40, trẻ em hiếm khi bị nhiễm HBV

1.3.1.2 Khu vực lưu hành trung bình

Tỷ lệ HBsAg [+] khoảng 2 - 7% ở một số quốc gia miền Nam Châu Âu

và Đông Âu, Nga, Nam Mỹ Kiểu lây truyền thường là phối hợp nhưng lây nhiễm qua đường tình dục thường là quan trọng hơn Tuổi bị lây nhiễm cao nhất là từ 25 tuổi (khoảng 50% dân số)

1.3.1.3 Khu vực lưu hành cao

Tỷ lệ HBsAg [+] vào khoảng 8 - 15% Đặc điểm dịch tễ học quan trọng của vùng này là nhiễm HBV thường gặp ở trẻ em và lây nhiễm qua đường chu sinh (đường lây từ mẹ sang con) Trung Quốc, Phi Châu, Đông Nam Á được xếp vào khu vực này Ngoài ra người ta cũng ghi nhận sự lây nhiễm còn xảy

ra ở tuổi thiếu niên do các trẻ bị lây lẫn nhau trong gia đình, hoặc trong bạn

bè, thường gặp ở trẻ em châu Phi Vì vậy, hầu hết dân số bị nhiễm có huyết thanh chẩn đoán HBV dương tính rất sớm, thường là sau 10 tuổi Tuy nhiên, bệnh lại thường được phát hiện ở tuổi trưởng thành, lúc mà các biến chứng mãn tính của nhiễm HBV có thể đã xuất hiện như viêm gan mãn, xơ gan và ung thư gan nguyên phát Do nhiễm ở tuổi còn nhỏ nên nguy cơ mang siêu vi mãn tính rất cao, những phát hiện này chứng tỏ rằng người trẻ mang HBV là người có khả năng lây nhiễm nhất Việt Nam cũng được xếp vào khu vực lưu hành cao, nghĩa là nhiễm HBV khá phổ biến, tuy chưa có những nghiên cứu dịch tễ học thống nhất

1.3.2 Tình hình bệnh viêm gan siêu vi B trong nước

Ở Việt Nam, cứ 5 - 7 người dân thì có một người nhiễm, chủ yếu là kiểu gene B và C Virus B xâm nhập tế bào gan, biến chúng thành nơi sản xuất virus mới Khi phát hiện ra sự bất thường này, hệ miễn dịch sẽ tấn công kẻ xâm lược Nếu “cuộc chiến“ thắng lợi, tế bào gan tổn thương sẽ được thay thế bằng những tế bào khỏe mạnh và bệnh nhân sẽ được phục hồi Nhưng ở một

số người, hệ miễn dịch không loại trừ được virus và họ trở thành người mang virus viêm gan B mãn tính Khoảng 10% số người nhiễm virus B rơi vào trường hợp này Trong các trường hợp xấu nhất, các tế bào gan bị virus phá hoại bị thay thế bằng các mô sợi bất thường, dẫn đến xơ gan và ung thư gan

Trên bản đồ dịch tễ của thế giới, tỷ lệ dân số Việt Nam mang kháng nguyên HBsAg (chứng tỏ nhiễm HBV) là trên 8%, xếp vào hàng các quốc gia

có tỷ lệ nhiễm HBV cao nhất thế giới Nhận định này cũng được một số công trình nghiên cứu về dịch tễ học trong và ngoài nước xác nhận Không phải tất

cả các trường hợp nhiễm HBV đều cần phải được đặt ra vấn đề phải điều trị vì

đa số bệnh nhân đều có thể tự khỏi nhờ cơ thể có thể tạo ra đáp ứng miễn dịch bằng kháng thể bảo vệ là kháng thể kháng kháng nguyên bề mặt của virus Tuy nhiên vẫn có một tỷ lệ người nhiễm HBV cần phải được điều trị đặc hiệu bằng thuốc kháng virus một khi có dấu hiệu viêm gan mãn tính và lượng virus tăng cao

Hình 1.5 Sự phân bố HBsAg trên thế giới [25]

1.4 Đường lây của HBV, triệu chứng lâm sàng, biện pháp phòng ngừa và điều trị HBV [4],[8],[19]

1.4.1 Đường lây của HBV

Phương thức lây nhiễm chủ yếu trong viêm gan siêu vi B là lây qua đường tiêu hóa Sự lây nhiễm sẽ dễ dàng xảy ra khi trong máu hoặc trong dịch tiết của người bệnh đã nhiễm có nồng độ siêu vi B rất cao và khi người bệnh tiếp xúc thường xuyên với các yếu tố nguy cơ trong một thời gian dài Mặt khác, đa số những người mang siêu vi B mãn tính thường không có triệu chứng và họ không hề hay biết để dự phòng nguy cơ lây nhiễm cho những người xung quanh

Về phương diện dịch tễ học, người ta ghi nhận có ba phương cách lây nhiễm chính:

v Lây truyền qua đường ngoài tiêu hóa do tiếp xúc với máu, các vật

phẩm của máu

Cách lây nhiễm này thường gặp ở các nhân viên y tế, người được truyền máu nhiều lần, người mắc bệnh máu khó đông và được lọc máu ngoài thận,… Ngoài ra, bệnh còn có thể lây qua đường tiêm chích hoặc khi sử dụng các dụng cụ không đảm bảo vô khuẩn như phẫu thuật, nội soi đường tiêu hóa, châm cứu, xỏ lỗ tai, xăm mình, chữa răng và nhất là những người nghiện ma túy sử dụng chung ống tiêm

HBV có tính đề kháng tương đối và bền vững khi được bảo quản ở nhiệt

độ -20oC trong nhiều năm, có thể tồn tại ở 60oC trong bốn giờ

v Lây truyền qua đường tình dục

Máu và các chất dịch của cơ thể như nước bọt, tinh dịch hoặc dịch âm đạo đều chứa virus

v Lây truyền từ mẹ sang con

HBV được lây truyền chủ yếu trong lúc sanh hơn là lúc lây qua nhau thai Mức độ nặng và tiên lượng của tình trạng lây nhiễm này tùy thuộc vào hai yếu tố: mức độ nhân đôi của siêu vi và thời gian bị nhiễm HBV cấp tính ở

mẹ

1.4.2 Triệu chứng lâm sàng

- Viêm gan cấp tính

Thời gian ủ bệnh từ 1 - 6 tháng Một số bệnh nhân có cảm giác như bị cảm nhẹ, đôi khi không biết mình bị HBV Một số khác bị vàng da, mệt mỏi, đau nhức, buồn ói, chán ăn, sốt nhẹ, biến đổi cảm giác (hiện tượng đặc biệt là người ghiền thuốc lá tự nhiên không thích mùi thuốc lá), đau bụng (dưới sườn bên phải) Những trường hợp bị viêm nặng sẽ đưa đến gan to, ngầy ngật, khó ngủ, mê muội, lãng trí hoặc bất tỉnh

Biểu hiện lâm sàng: tăng nhiệt độ, vàng da (một tuần sau khi bị nhiễm và

có thể kéo dài đến 1 - 3 tháng), gan to, lách to Hiếm khi thấy bàn tay ửng đỏ hoặc “spider nevi” (mạch máu li ti kết tỏa thành hình nhện như hoa thị trên da)

- Viêm gan mãn tính

Phần lớn khi bị viêm mãn tính bệnh nhân hoàn toàn bình thường Một số

bị viêm mãn tính nặng thì tiếp tục bị các triệu chứng viêm cấp như mệt mỏi, chán ăn, đau bụng và suy gan

Biểu hiện lâm sàng: gan to, bàn tay ửng đỏ Khi bị biến chứng sơ gan có thể bị ứ nước trong bụng, vàng da, loãng máu, chảy máu trong dạ dày, tĩnh mạch tỏa lớn từ rốn (do tăng áp làm giãn tĩnh mạch cửa gan), nam vú lớn như

vú nữ, tinh hoàn teo nhỏ (vì gan yếu làm thay đổi cân bằng của các hormone giới tính)

1.4.3 Biện pháp phòng ngừa và điều trị HBV

v Phòng bệnh

Tiêm chủng vaccine: Sau khi tiêm vaccine, để đánh giá được hiệu quả bảo vệ của chúng cần làm xét nghiệm anti-HBsAg để phát hiện kháng thể chống virus đã được hình thành Khi người bệnh xét nghiệm HBsAg [+] thì không được tiêm vaccine nữa Hiện Việt Nam đã có vaccine viêm gan thế hệ III mới nhất Sci-B-Vac có độ an toàn và tính hiệu quả cao hơn trước rất nhiều

Tuyệt đối không dùng chung các dụng cụ có thể gây xây xát da, niêm mạc (dao cạo, bàn chải răng, dụng cụ y tế … hoặc truyền máu) để tránh lây lan từ người bệnh

Quan hệ tình dục có bảo vệ, có thể ngăn chặn sự lây nhiễm HBV

v Điều trị

Khi mắc bệnh viêm gan B, thường sẽ xét nghiệm một mẫu máu của bệnh nhân để tìm các dấu hiệu của bệnh gan Hai yếu tố sẽ xem xét kĩ lưỡng là lượng siêu vi (lượng HBV-DNA) lưu thông trong máu, và các enzyme của gan có thể cho biết tình trạng tổn thương gan Kiểm soát lượng siêu vi trong máu, duy trì lượng enzyme ở mức bình thường, và tăng cường hệ miễn dịch của bệnh nhân để ngừa bệnh hiệu quả Hiện nay, có các loại thuốc giúp có tác dụng chữa bệnh viêm gan B, nhưng không thể chữa khỏi được Các loại thuốc này được gọi là interferon và thuốc kháng siêu vi

Interferon, một chất đạm tự nhiên trong cơ thể, có tác dụng tăng cường

hệ miễn dịch để ngừa bệnh Các nhà nghiên cứu đã bào chế các loại interferon tổng hợp có tác dụng giúp hệ miễn dịch chống viêm nhiễm trong gan và tăng lượng kháng thể chống loại siêu vi này Interferon có thể giúp cải thiện tình trạng sức khỏe lá gan và giảm bớt lượng siêu vi trong gan Việc điều trị bằng interferon thường diễn ra trong một thời gian nhất định, thường là vài tháng,

và có thể giúp cải thiện vĩnh viễn tình trạng sức khỏe của gan mà không gây

ra triệu chứng kháng siêu vi Chính vì vậy, interferon là biện pháp điều trị tốt nhất được nhiều người lựa chọn đầu tiên, do nó có hoạt tính chống virus và kích thích hệ miễn dịch

Thuốc kháng siêu vi (dạng thuốc viên hoặc thuốc nước) can thiệp vào quá trình tái tạo HBV để ngăn chặn tình trạng tái tạo siêu vi HBV mới

Có bốn loại thuốc kháng siêu vi đã được Cơ quan Quản lý Dược phẩm và Thực phẩm Hoa Kỳ (FDA) chấp nhận Các loại thuốc kháng siêu vi khác nhau ở chỗ, chúng chú trọng tới một bộ phận khác nhau trên bộ gene của siêu

vi Tuy nhiên, dần dần HBV có thể phát sinh các đột biến giúp siêu vi này tiếp tục sinh sôi bất kể điều trị bằng thuốc viên kháng siêu vi Hiện tượng này gọi

là “kháng” siêu vi, vì siêu vi có thể “kháng lại” thuốc kháng siêu vi Các loại thuốc kháng siêu vi có thể có tác dụng trong một thời gian để giảm bớt lượng siêu vi và mức enzyme, tuy nhiên khi hiện tượng kháng thuốc xảy ra thì các mức này lại bắt đầu tăng cao

Các nhà nghiên cứu vẫn chưa bào chế được loại thuốc kháng siêu vi hoặc biện pháp điều trị kết hợp hoàn hảo có tác dụng xóa bỏ hoàn toàn HBV Các loại thuốc kháng siêu vi hiếm khi tạo ra các triệu chứng là phản ứng phụ Hiện nay FDA chấp nhận 5 thuốc để điều trị viêm gan mãn virus B: interferon alpha-2b (1992), lamivudine (1998), adefovir dipivoxil (2002) và entecavir (2005) và peginterferon alpha-2a (tháng 5-2005)

1.5 Các phương pháp chẩn đoán bệnh viêm gan siêu vi B

1.5.1 Phương pháp huyết thanh học (phát hiện kháng thể) và hóa miễn dịch (phát hiện kháng nguyên) [5]

HBV cũng tạo ra kháng nguyên “e” hay HBeAg, được phóng thích vào máu và phát hiện bằng thử nghiệm huyết thanh học Sự hiện diện HBeAg và DNA virus lưu hành trong máu là một dấu hiệu chỉ điểm virus đang tăng sinh

và có độ gây nhiễm rất cao Khi tình trạng nhiễm trùng phục hồi, HBeAg và HBsAg không còn trong máu, và có dấu hiệu chuyển đổi huyết thanh: xuất hiện các kháng thể anti-HBe và anti-HBs Vì vậy, dựa vào nguyên lý tính đặc hiệu kháng nguyên – kháng thể có thể chẩn đoán HBV bằng kỹ thuật ELISA Các bước cơ bản:

- Kháng nguyên - antigen (KN) chưa biết, được gắn trên một bề mặt

- Kháng thể - antibody (KT) biết trước Kháng thể này được gắn kết với enzyme

- Thêm vào một cơ chất (subtance), enzyme sẽ biến đổi cơ chất này và tạo tín hiệu có thể xác định được

- Đối với các ELISA phát quang, ánh sáng sẽ được phát ra từ mẫu chứa

KN - KT Sự hiện diện của phức hợp KN - KT sẽ quyết định cường độ sáng phát ra

Với nguyên lý trên, ELISA giúp xác định sự có mặt hay không có mặt cũng như lượng KN trong mẫu nghiên cứu

Nhưng phương pháp này rất hạn chế do KN không đặc hiệu sẽ ảnh hưởng đến kết quả xét nghiệm

1.5.2 Phương pháp sinh học phân tử

1.5.2.1 Phương pháp khuếch đại tín hiệu bằng DNA nhánh (bDNA)

[8]

Là phương pháp phát hiện và định lượng DNA (hoặc RNA) bằng kỹ thuật lai và khuếch đại tín hiệu trên pha rắn là các giếng thử nghiệm Phương pháp được thực hiện theo các bước sau: (1) HBV-DNA nếu có trong mẫu thử

sẽ lai với các đoạn dò đích (target probes), có hai loại: một loại có đầu đặc hiệu với đoạn dò tóm bắt, một loại có đầu đặc hiệu với DNA nhánh (bDNA) (2) Trên bề mặt của các giếng thử nghiệm có gắn các đoạn dò tóm bắt (capture probes) Các đoạn dò này sẽ tóm bắt các đoạn dò đích, đã được lai với HBV-DNA, nhờ đó đã tóm bắt HBV-DNA lên giếng thử nghiệm (3) Các đoạn dò đích, đã lai với HBV-DNA, có đầu đặc hiệu bDNA vẫn được tự do sẽ được lai với bDNA (4) Các nhánh của bDNA sẽ được lai với các đoạn dò phát hiện đã đánh dấu enzyme Alkaline phosphatase, nhờ đó phát hiện được

sự hiện diện của HBV-DNA đã bị tóm bắt trên giếng Phương pháp này có thể phát hiện một lượng tối thiểu là 7.105 phân tử DNA trong một ml máu

Hình 1.6 Nguyên lý phát hiện HBV bằng phương pháp bDNA [14]

1.5.2.2 Phương pháp PCR [1],[3],[22]

v Nguyên tắc

Đây là một kỹ thuật tạo dòng in vitro, không cần sự hiện diện của tế bào, cho phép khuếch đại một đoạn DNA nằm giữa hai vùng trình tự oligonucleotide đã biết trước Hai trình tự oligonucleotide này được gọi là mồi xuôi - bắt cặp với mạch [+] DNA và mồi ngược bắt cặp với mạch [-] DNA Một phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu

kỳ gồm ba giai đoạn:

- Giai đoạn biến tính

Nhiệt độ phản ứng là 94oC trong 30 giây đến 1 phút, làm cho phân tử DNA biến tính tách ra làm đôi hoàn toàn, tất cả hoạt động của các enzyme đều dừng lại, phân tử DNA duỗi thẳng ra hoàn toàn, từ đó dễ dàng cho việc bắt cặp và gắn các Nu vào mạch đơn đó theo nguyên tắc bổ sung

- Giai đoạn bắt cặp

Các primer (đoạn mồi) là các đoạn Nu ngắn (khoảng 20 - 25 Nu) sẽ bắt cặp vào các chuỗi đơn DNA sau khi biến tính theo nguyên tắc bổ sung Sự bắt cặp này sẽ có hai ý nghĩa đặc hiệu: đặc hiệu theo nguyên tắc bổ sung với đoạn gene mà ta cần khuếch đại và đặc hiệu theo chiều dài của đoạn gene khuếch đại

- Giai đoạn kéo dài

Sau khi primer bắt cặp đặc hiệu với các mạch đơn DNA, nhờ tác dụng

của enzyme Taq polymerase ở điều kiện thích hợp sẽ gắn các Nu vào các

primer theo nguyên tắc bổ sung, từ đó làm cho đoạn mồi dài ra và hình thành nên một mạch đơn mới bổ sung với mạch đơn cũ Và một bản sao DNA mới

đã được hình thành Như vậy, sau giai đoạn này ta có được hai phân tử DNA

có cấu trúc giống hệt như phân tử DNA ban đầu

Chu kỳ này được lặp lại nhiều lần (30-40 lần), kết quả từ một số lượng DNA đích ban đầu (N), sau n chu kỳ sẽ tạo thành N x 2n bản sao

một phản ứng Thông thường, nồng độ DNA ban đầu tốt nhất cho phản ứng PCR ở khoảng 105 bản sao/phản ứng

- Mồi

Đây là một trong những yếu tố quan trọng nhất trong phản ứng PCR, có vai trò làm mồi cho hoạt động kéo dài mạch của DNA polymerase Do đó, việc thiết kế mồi phải được tiến hành thật chính xác, tránh ảnh hưởng đến hiệu quả và độ chuyên biệt của phản ứng PCR Nồng độ mồi trong mỗi phản ứng PCR phải được tính toán tối ưu bằng thực nghiệm Nếu nồng độ mồi quá cao sẽ dẫn đến hiện tượng khuếch đại kí sinh, ngược lại sẽ làm hiệu quả khuếch đại của phản ứng không cao Giới hạn nồng độ mồi thường là 0.1 - 1µl

Mồi thiết kế phải tuân thủ những nguyên tắc sau:

• Tm của mồi “xuôi” và mồi “ngược” không khác nhau quá 5oC

• Tránh sự bắt cặp bổ sung giữa mồi “xuôi” và mồi “ngược”

• Tránh các cấu trúc “kẹp tóc” trong thành phần mỗi mồi

• Thành phần nucleotide của mồi phải cân bằng

• Tránh các cặp GC lặp đi lặp lại nhiều lần

• Thành phần GC khoảng 40 - 60%

• Trình tự mồi phải đặc trưng cho trình tự DNA cần nhân bản

- Enzyme chịu nhiệt Taq polymerase

Enzyme này có thể chịu được nhiệt độ tới 95oC Một phản ứng PCR từ

25 - 50µl thông thường có liều lượng Taq polymerase nằm trong giới hạn từ

đến hiện tượng khuếch đại kí sinh Vì vậy, phải thiết kế nồng độ MgCl2 tối ưu nhất cho từng phản ứng PCR cụ thể, thông thường là từ 1.5 - 4mM

- Dung dịch đệm PCR

Dung dịch này có vai trò cung cấp những ion cần thiết cho phản ứng xảy

ra Tùy theo nguồn DNA polymerase mà nồng độ và pH của dung dịch đệm cũng như nồng độ KCl tối ưu sẽ thay đổi cho phù hợp Thông thường, một phản ứng PCR sẽ có dung dịch đệm điển hình là: 50mM KCl, 10mM Tris - HCl, pH 8.3 ở nhiệt độ phòng

ü Nguyên lý của Real-time PCR

Real-time PCR kiểm soát lượng huỳnh quang giải phóng ra trong phản ứng, từ đó có thể biết được lượng sản phẩm PCR trong từng thời điểm (chu kỳ) của quá trình khuếch đại, trái ngược với PCR truyền thống chỉ biết được lượng sản phẩm được khuếch đại ở thời điểm cuối cùng của phản ứng khuếch đại

- Real-time PCR là một phản ứng động, cho phép phát hiện “huỳnh quang phát ra nhờ sự khuếch đại của sản phẩm PCR” tại mỗi chu kỳ của phản ứng PCR

- Phân tích kết quả phản ứng mà không cần bước điện di trên gel

- Phân tích kết quả huỳnh quang phát ra theo thời gian tại mỗi chu kỳ phản ứng PCR bằng máy tính

Các đặc tính của Real-time PCR