Sàng lọc một số vị thuốc, bài thuốc nhằm điều chế thuốc điều trị viêm gan mạn do siêu vi b

cụthể đã hoàn thành các nội dung nghiên cứu sau: 1. Nghiên cứu sàng lọc tác dụng bảo vệgan trên mô hình gây tổn thương gan bằng CCl4các dịch chiết từ10 cây thuốc và 2 bài thuốc. Chọn 5 sản phẩm có tác dụng tốt nhất. 2. Nghiên cứu thành phần hóa học của 5 dịch chiết. Xác định hàm lượng các nhóm chất có tác dụng bảo vệgan. Chọn 3 sản phẩm có hiệu suất chiết cao, nguyên liệu dễkhai thác và dễtrồng đểtiếp tục nghiên cứu so sánh tác dụng dược lý. 3. Thửcác tác dụng lý sau của 3 chếphẩm chọn được: chống oxy hoá, ức chếxơgan, trên men gan GPT, GOT, bilirubin; tác dụng chống viêm mạn; tác dụng lợi mật .. Chọn 1 sản phẩm có tác dụng tốt nhất đểnghiên cứu độc tính: i. Thử độc tính cấp ii. Độc tính bán trường diễn . 4. Nghiên cứu quy trình chiết xuất sản phẩm quy mô pilot. 5. Nghiên cứu dạng bào chếvà quy trình sản xuất thuốc trịviêm gan mạn do siêu vi B. ii 6. Xây dựng tiêu chuẩn dược liệu, bán sản phẩm và thuốc mới. 7. Bào chế5.000 viên bao phim thuốc mới. 8. Công bốkết quảnghiên cứu trên các tạp chí khoa học và Hội nghịkhoa học.. Đối chiếu với các nội dung nghiên cứu đã đăng ký và đã được Bộphê duyệt ởtrang 7 của bản TM đềtài thì có 1 thay đổi: đó là tiểu mục “thử độc tính sinh sản” (thuộc nội dung nghiên cứu 5) đã được VụKH-ĐT BộY tếcho phép không thực hiện trong buổi họp thẩm định nội dung và kinh phí thực hiện nhưng khi sửa chữa bản thuyết minh, chủnhiệm đềtài đã sơxuất không xoá tiểu mục “thử độc tính sinh sản” trong phần “Nội dung nghiên cứu”. 7.2. Vềcác yêu cầu khoa học và chỉtiêu cơbản của các sản phẩm KHCN: Các sản phẩm của đềtài: 1) Danh sách các vịthuốc và bài thuốc có tác dụng bảo vệgan:

BỘ Y TẾ

BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI CẤP BỘ

SÀNG LỌC MỘT SỐ VỊ THUỐC, BÀI THUỐC NHẰM ĐIỀU CHẾ

THUỐC ĐIỀU TRỊ VIÊM GAN MẠN DO SIÊU VI B

Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS Bùi Thị Bằng

Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Dược liệu

7412

22/6/2009

Năm 2008

BỘ Y TẾ

BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI CẤP BỘ

SÀNG LỌC MỘT SỐ VỊ THUỐC, BÀI THUỐC NHẰM ĐIỀU CHẾ

THUỐC ĐIỀU TRỊ VIÊM GAN MẠN DO SIÊU VI B

Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS Bùi Thị Bằng

Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Dược Liệu

Cơ quan quản lý: Bộ Y tế

Thời gian thực hiện: Từ tháng 7/2006 đến tháng 12/2008

Tổng kinh phí thực hiện đề tài: 320 triệu đồng

Trong đó, kinh phí sự nghiệp khoa học: 320 triệu đồng

Năm 2008

BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI CẤP BỘ

1 Tên đề tài: Sàng lọc một số vị thuốc, bài thuốc nhằm điều chế thuốc điều trị viêm gan

mạn do siêu vi B

2 Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS Bùi Thị Bằng

3 Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Dược Liệu

4 Cơ quan quản lý đề tài: Bộ Y tế

5 Danh sách những người thực hiện chính:

1 PGS.TS Bùi Thị Bằng Viện Dược liệu (VDL)

2 PGS.TS Nguyễn Thị Thu Hương Trung tâm nghiên cứu Sâm và Dược liệu

TP Hồ chí Minh (TT SDL TP HCM)

3 DS Nguyễn Kim Phượng VDL

Những chữ viết tắt

AASLD Hiệp hội Nghiên cứu bệnh gan Mỹ

GOT Glutamic oxaloacetate transaminase GPT Glutamic pyruvic transaminase HBsAg Kháng nguyên bề mặt của virút VGB

NCKH Nghiên cứu khoa học SKLCA Sắc ký lỏng cao áp VDL Viện Dược liệu

VGMHĐ VGB mạn hoạt động WHO Tổ chức Y tế thế giới YHCT Y học cổ truyền

3 Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS Bùi Thị Bằng

4 Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Dược Liệu

5 Thời gian thực hiện: Bắt đầu từ tháng 7 năm 2006 Kết thúc tháng 12 năm 2008

6 Tổng kinh phí thực hiện đề tài: 320 triệu đồng

Trong đó, kinh phí từ NSNN: 320 triệu đồng

7 Tình hình thực hiện đề tài so với đề cương:

7.1 Mức độ hoàn thành khối lượng công việc: Đã hoàn thành đầy đủ khối lượng công

việc theo đề cương nghiên cứu, cụ thể đã hoàn thành các nội dung nghiên cứu sau:

1 Nghiên cứu sàng lọc tác dụng bảo vệ gan trên mô hình gây tổn thương gan bằng CCl4 các dịch chiết từ 10 cây thuốc và 2 bài thuốc Chọn 5 sản phẩm có tác dụng tốt nhất

2 Nghiên cứu thành phần hóa học của 5 dịch chiết Xác định hàm lượng các nhóm chất có tác dụng bảo vệ gan Chọn 3 sản phẩm có hiệu suất chiết cao, nguyên liệu

dễ khai thác và dễ trồng để tiếp tục nghiên cứu so sánh tác dụng dược lý

3 Thử các tác dụng lý sau của 3 chế phẩm chọn được: chống oxy hoá, ức chế xơ gan, trên men gan GPT, GOT, bilirubin; tác dụng chống viêm mạn; tác dụng lợi mật Chọn 1 sản phẩm có tác dụng tốt nhất để nghiên cứu độc tính:

i Thử độc tính cấp

ii Độc tính bán trường diễn

4 Nghiên cứu quy trình chiết xuất sản phẩm quy mô pilot

5 Nghiên cứu dạng bào chế và quy trình sản xuất thuốc trị viêm gan mạn do siêu vi

B

6 Xây dựng tiêu chuẩn dược liệu, bán sản phẩm và thuốc mới

7 Bào chế 5.000 viên bao phim thuốc mới

8 Công bố kết quả nghiên cứu trên các tạp chí khoa học và Hội nghị khoa học

Đối chiếu với các nội dung nghiên cứu đã đăng ký và đã được Bộ phê duyệt ở trang 7 của bản TM đề tài thì có 1 thay đổi: đó là tiểu mục “thử độc tính sinh sản” (thuộc nội dung nghiên cứu 5) đã được Vụ KH-ĐT Bộ Y tế cho phép không thực hiện trong buổi họp thẩm định nội dung và kinh phí thực hiện nhưng khi sửa chữa bản thuyết minh, chủ nhiệm

đề tài đã sơ xuất không xoá tiểu mục “thử độc tính sinh sản” trong phần “Nội dung nghiên cứu”

7.2 Về các yêu cầu khoa học và chỉ tiêu cơ bản của các sản phẩm KHCN:

Các sản phẩm của đề tài:

1) Danh sách các vị thuốc và bài thuốc có tác dụng bảo vệ gan:

Kết quả thử tác dụng bảo vệ gan của các dịch chiết n-hexan, cồn 80% và nước của

10 vị thuốc và 2 bài thuốc trên chuột nhắt trắng bị gây độc gan bằng carbon tetraclorid đã cho phép chọn được:

• Bảy vị thuốc có tác dụng bảo vệ gan sau:

• Hai bài thuốc có tác dụng bảo vệ gan:

Bài số 1: Hạ khô thảo (30 g), ý dĩ (20 g), gừng khô (3 lát), dành dành (12 g), Hoài sơn (20

Bài số 2: Hạ khô thảo (40 g); thổ phục linh (12 g), nghệ vàng (10 g), mã đề (40 g), rau

má (40 g)

Hai bài thuốc có tác dụng bảo vệ gan tương đương với silymarin (liều 100mg/kg thể trọng chuột), làm giảm có ý nghĩa thống kê hoạt tính của enzym GPT từ 46,08 đến 57,54% và giảm từ 46,63 đến 44,98% hàm lượng bilirubin bị gây tăng bởi CCl4 (P<0,05)

2) Báo cáo kết quả nghiên cứu tác dụng dược lý và thành phần hoá học của vị thuốc điều trị viêm gan mạn do virút VGB

2.1- Nghiên cứu tác dụng dược lý: Kết quả nghiên cứu so sánh tác dụng chống viêm

gan mạn, tác dụng lợi mật, tác dụng chống viêm mạn của 3 chế phẩm chọn được là flavonoid ban tròn, cao nước lá muồng trâu và bài thuốc số 2 đã cho phép chọn chế phẩm

flavonoid chiết xuất từ lá cây ban tròn (Hypericum patulum Thunb ex Murray) làm thuốc

điều trị viêm gan mạn do siêu vi B - được gọi là “Cao ban tròn” (còn gọi là bột Hypatin) Kết quả thử các tác dụng dược lý của bột Hypatin như sau:

-Tác dụng bảo vệ gan: Với liều thử 250mg/kg thể trọng chuột nhắt trắng, bột Hypatin

đã làm giảm có ý nghĩa thống kê 36,50% hoạt độ của enzym GPT và 53,58% hàm lượng bilirubin trong huyết thanh chuột bị gây tăng bởi CCl4

-Tác dụng ức chế xơ gan: Bột Hypatin với các liều thử 125mg/kg và 250mg/kg đã làm

giảm hàm lượng colagen trong gan chuột cống trắng bị gây viêm gan mạn và gây tăng colagen bằng CCl4: 10,76% (P<0.05) và 15,24% (P<0,001) tương ứng

-Tác dụng chống oxy hoá: Bột Hypatin với các liều thử 125mg/kg và 250mg/kg đã làm

giảm hàm lượng MDA trong gan chuột cống trắng bị gây tăng peroxy hoá lipid bằng CCl4: 21,38% và 13,65% tương ứng

-Tác dụng trên tổ chức tế bào gan: Bột Hypatin đã thể hiện tác dụng bảo vệ gan trên

chuột cống trắng bi gây xơ gan bằng CCl4, tuy không giúp hồi phục hoàn toàn nhưng đã cải thiện rõ rệt các tổn thương gan Đặc biệt đã hạn chế mức độ xơ hoá gan rất nhiều so với lô chuột bệnh lý không được điều trị Đây là kết quả mới đáng ghi nhận đối với cây ban tròn và chế phẩm flavonoid toàn phần

-Tác dụng chống viêm mạn: Bột Hypatin với liều thử 250mg/kg đã làm giảm có ý nghĩa

thống kê 23,5% trọng lượng ổ viêm do amian gây ra trên chuột cống trắng

-Tác dụng lợi mật: Bột Hypatin với liều thử 250mg/kg đã làm tăng tiết mật 29,29%

(P<0,05) so với lô chứng trên chuột nhắt trắng trưởng thành (mô hình Rudi)

Với các tác dụng dược lý thử trên chuột bị gây viêm gan cấp và mạn tính bằng CCl4

đã liệt kê ở trên, chế phẩm flavonoid ban tròn đáp các yêu cầu đối với một thuốc điều trị viêm gan mạn do virút VGB Vì vậy flavonoid được chọn để tiếp tục nghiên cứu trên độc tính cấp và độc tính bán trường diễn

2.2 Nghiên cứu về hoá học của chế phẩm flavonoid:

-Đã xác định hàm lượng flavonoid toàn phần trong lá ban tròn thu hái tại Sapa (Lào cai): Đạt trung bình 5,92%

-Đã nghiên cứu chiết tách flavonoid toàn phần và các chất tinh khiết astilbin, quercitrin từ lá ban tròn phục vụ cho thử tác dụng dược lý

-Đã phân tích thành phần hoá học của flavonoid bằng SKLCA: Kết quả cho thấy trong chế phẩm có ít nhất 11 pic tương ứng với flavonoid Hàm lượng (%) astilbin và quercitrin trong chế phẩm flavonoid đạt từ 8,76-10,25% và từ 8,70 đến 9,70% tương ứng

3) Báo cáo kết quả thử độc tính của flavonoid ban tròn:

*Độc tính cấp: Kết quả thử độc tinh cấp cho thấy liều không có chuột chết LD0 = 5000mg bột flavonoid gấp 40 lần liều có tác dụng (125mg/kg) Điều này chứng tỏ bột Flavonoid

có độ an toàn cao khi sử dụng

*Độc tính bán trường diễn: Cho thỏ uống flavonoid với liều 5000mg/kg thể trọng thỏ

trong 30 ngày liên tục đã không gây ảnh hưởng đến chức năng gan; thận và chức năng tạo máu của thỏ thí nghiệm Kết quả nghiên cứu mô học gan thận cho thấy hình ảnh tế bào gan và thận của thỏ không bị tổn thương sau khi uống flavonoid 5000mg/kg x 30 ngày, không thấy sự khác biệt khi so sánh với hình ảnh tế bào gan và thận của thỏ lô đối chứng Như vậy có thể kết luận chế phẩm flavonoid ban tròn không gây độc đối với cấu trúc tế bào gan và thận

4) Quy trình chiết xuất flavonoid toàn phần từ lá ban tròn quy mô pilot:

- Dung môi chiết: nước

- Tỷ lệ nước - dược liệu: vừa đủ

- Nhiệt độ chiết: 90-950C

- Thời gian chiết: 1h x 3 lần

- Cô dịch chiết nước đến cao lỏng: tỷ lệ thích hợp

- Chiết flavonoid từ cao lỏng bằng EtOAc: Tỷ lệ thích hợp

- Cô dịch chiết EtOAc dưới áp suất giảm

- Sấy cao EtOAc ở 500C

Đã thực hiện chiết xuất trên dây truyền chiết xuất đa năng của hãng Tourner (Pháp) với mẻ chiết 10kg lá khô x 3 mẻ Kết quả: đạt hiệu suất chiết flavonoid trung bình 5,69%

so với dược liệu khô (tương đương hiệu suất 85,43% so với khối lượng flavonoid có trong dược liệu) Hàm lượng flavonoid toàn phần trong chế phẩm tính theo astilbin đạt trung bình 40,88% (xác định bằng phương pháp quang phổ tử ngoại)

Kết quả định lượng bằng phương pháp SKLCA cho thấy quy trình cho sản phẩm có hàm lượng astilbin và quercitrin trong chế phẩm flavonoid tương đối ổn định đạt từ 17,46

đến 19,95%

5) Nghiên cứu phương pháp bào chế và quy trình sản xuất thuốc mới:

Thuốc mới bào chế từ chế phẩm flavonoid ban tròn được đặt tên là Hypatin (xuất

phát từ tên khoa học của cây thuốc Hypericum patulum) Đã khảo sát 5 công thức với các

thành phần tá dược khác nhau, chọn được công thức 4 là công thức cho viên thuốc đạt các yêu cầu của DĐVN III

Thuốc được nghiên cứu dưới dạng viên nén bao phim có công thức sau:

Công thức cho điều chế 1 viên:

Cao ban tròn (Bột Hypatin) (Một trăm bẩy mươi miligam) 0,1700 g

Magiesi carbonat nhẹ (Ba mươi miligam) 0,0300 g

Bột talc (Ba một phần năm miligam) 0,0032 g

6) Nghiên cứu tiêu chuẩn hoá:

Đã nghiên cứu xây dựng 3 tiêu chuẩn:

- Tiêu chuẩn nguyên liệu - lá ban tròn 04TCI1-01-08

- Tiêu chuẩn bán thành phẩm - cao ban tròn (bột hypatin): 04TCI1-02-08

- Tiêu chuẩn thuốc - viên bao phim Hypatin: 04TCI1-03-08

7) Các bài báo:

1 Nghiên cứu phân lập và xác định cấu trúc hóa học của các chất từ quả ngũ

vị tử (Schisandra sphenanthera Rehder et Wils.) thu hái ở Kon Tum Tạp

chí Dược liệu số 3 + 4 năm 2007: 101-103

2 Anti –hepatitis and cirrhosis inhibitory effect of Hypericum patulum Thunb

ex Murray (bằng tiếng Anh) Tạp chí Dược liệu số 6/ 2007: 174-178

3 Quercitrin - flavon glycosid chiết tách từ cây Ban tròn (Hypericum patulum

Thunb ex Murray) có tác dụng bảo vệ gan tạp chí Dược học số 10 /2007: 40-41, 43, 48

4 Tham gia Hội nghị Quốc tế : “Anti –hepatitis and cirrhosis inhibitory effect

of Hypericum patulum Thunb ex Murray”.Book of Abstracts: International

Workshop on Herbal Medicinal plants and Traditional Herb Remedies,

20-21 September 2007, Hanoi, Vietnam., page 47-48

8) Đã bào chế 5.000 viên bao phim đạt yêu cầu DĐVN III

Kết luận: Đề tài đã hoàn thành các nhiệm vụ nghiên cứu

-Các sản phẩm khoa học có chất lượng cao, đáp ứng yêu cầu khoa học của đề tài cấp

Bộ

7.3 Về tiến độ thực hiện: Đề tài đã thực hiện các nội dung nghiên cứu theo tiến độ đã

dự kiến

8 Những đóng góp mới của đề tài:

-Đã xác định tác dụng bảo vệ gan của các vị thuốc rễ cốt khí và quả khúng khéng và 2 bài thuốc nêu ở trên (số 1 và số 2)

-Đề tài đã thu được những kết quả mới về các tác dụng chống viêm gan mạn, ức chế

xơ gan, chống oxy hóa, chống viêm mạn, lơi mật và độc tính của chế phẩm flavonoid toàn phần chiết xuất từ lá ban tròn (đã liêt kê ở trên)

-Quy trình chiết xuất flavonoid từ lá ban tròn quy mô pilot cũng là một đóng góp mới của đề tài

-Thuốc điều trị viêm gan mạn do siêu vi B Hypatin là một thuốc mới lần đầu tiên được nghiên cứu từ cây ban tròn

-Kết quả nghiên cứu về tác dụng bảo vệ gan, chống viêm gan mạn, ức chế xơ gan, chống oxy hóa, chống viêm mạn và lơi mật của lá muồng trâu

Hà Nội, ngày 24 tháng 12 năm 2008

Chủ nhiệm đề tài

PGS.TS Bùi Thị Bằng

ĐẶT VẤN ĐỀ

1 Tính cấp thiết của đề tài:

Viêm gan siêu vi B (viêm gan B) là bệnh nhiễm trùng gan nặng do virút viêm gan

B gây ra Bệnh viêm gan B (VGB) nằm trong danh mục 10 bệnh dịch gây tử vong cao nhất trên thế giới Theo ước tính của Tổ chức Y tế thế giới (WHO) hiện có khoảng 400 triệu người trên toàn cầu nhiễm virút viêm gan B, hơn nửa triệu người chết mỗi năm do ung thư gan nguyên phát thì có đến 80% là do VGB Viêm gan B mạn tính nếu không được điều trị có thể dẫn đến suy gan, xơ gan, ung thư gan và tử vong Suy gan và ung thư gan do VGB mạn tính làm chết nhiều người tại châu Á, từ 350.000-400.000 người/năm Tại VN các số liệu điều tra về dịch tễ học cũng cho biết có khoảng 15% dân số, tương đương 12 triệu người đang bị nhiễm virút VGB, cao gấp 40 đến 50 lần số người nhiễm HIV Theo Hội Ung thư toàn cầu, Việt Nam đang đứng thứ 2 về ung thư gan và 90% căn bệnh nguy hiểm này do viêm gan B gây ra, 20,5% mắc phải ở người lớn và tỷ

lệ nam thường cao hơn 5 lần phụ nữ [simci.org]

Theo hướng dẫn mới của Hiệp hội Nghiên cứu bệnh gan Mỹ (AASLD) được công

bố tại hội nghị APASL 2007 ở châu Á, mục tiêu cơ bản của điều trị VGB mạn là đạt được sự ức chế duy trì đối với sự sao chép của virút VGB và đẩy lùi bệnh gan Mục tiêu tối hậu là ngăn chặn xơ gan, suy gan và ung thư gan

Thuốc uống điều trị VGB mạn tính có 4 loại đã được cơ quan Dược và Thực phẩm Hoa Kỳ (FDA) cho sử dụng trong điều trị là Lamivudine, Adefovir, Entecavir và Telbivudine

Các thuốc tân dược thường có nhiều tác dụng phụ và giá thành đắt Vì vậy, các thuốc có nguồn gốc thảo mộc đang được khuyến khích nghiên cứu, đặc biệt là các vị thuốc Đông dược đã được dùng theo kinh nghiệm cổ truyền để chữa các bệnh về gan Số thuốc thảo mộc đưa vào sử dụng chưa nhiều nhưng bước đầu cho thấy có triển vọng tốt trong hỗ trợ điều trị VGB mạn nói chung và VGB mạn hoạt động (VGMHĐ) nói riêng Các thuốc thảo mộc thường có tác dụng bảo vệ tế bào gan, giảm viêm gan, phục hồi

lên của virút VGB, tăng sản xuất kháng thể chống lại kháng nguyên HBsAg của virút VGB Khi dùng phối hợp với các thuốc tân dược, các thuốc thảo mộc có tác dụng rút ngắn thời gian điều trị và giảm liều điều trị của thuốc tân dược

Theo kinh nghiệm dân gian và kết quả nghiên cứu của một số công trình nghiên cứu khoa học (NCKH) gần đây cho thấy có nhiều cây thuốc được dùng điều trị viêm gan

có tác dụng tốt, như: Diệp hạ châu, ngũ vị, dứa gai, cam thảo dây, hạ khô thảo nam, khúng khéng, muồng trâu, vọng cách, cốt khí, mã đề, dành dành, nọc sởi, ban tròn, trạch tả, nhó đông, cải trời, cà gai leo, cúc gai [11, 5, 33, 56, 13, 23, 41, 57] Trong đó,

mã đề, chi tử, hạ khô thảo nam đã được Bộ Y tế xếp vào Danh mục cây thuốc Nam điều trị VGB

Kế thừa và phát virút triển những kinh nghiệm sử dụng thảo dược để bào chế thuốc điều trị VGB mạn, chúng tôi đã được phép thực hiện đề tài: “Sàng lọc một số vị thuốc, bài thuốc nhằm điều chế thuốc điều trị viêm gan mạn do siêu vi B”

2 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu:

1 Sàng lọc một số vị thuốc, bài thuốc có tác dụng bảo vệ gan

2 Điều chế một loại thuốc điều trị viêm gan mạn do siêu vi B

1 Nghiên cứu sàng lọc tác dụng bảo vệ gan trên mô hình gây tổn thương gan bằng CCl4 các dịch chiết từ 2 bài thuốc và 10 cây thuốc Chọn 5 sản phẩm có tác dụng tốt nhất

2 Nghiên cứu thành phần hóa học của 5 dịch chiết Xác định hàm lượng các nhóm chất có tác dụng bảo vệ gan Chọn 3 sản phẩm có hàm lượng hoạt chất cao, nguyên liệu dễ khai thác hoặc dễ trồng để tiếp tục nghiên cứu tác dụng dược lý

3 So sánh các tác dụng lý sau đây của 3 sản phẩm chọn được: Tác dụng chống oxy hoá, ức chế xơ gan, giảm enzym GPT, GOT; tác dụng chống viêm mạn và tác dụng lợi mật

Chọn 1 sản phẩm có tác dụng tốt nhất để nghiên cứu độc tính:

i Thử độc tính cấp

ii Độc tính bán mạn

4 Nghiên cứu quy trình chiết xuất sản phẩm quy mô pilot

5 Nghiên cứu dạng bào chế và quy trình sản xuất thuốc trị VGM do siêu vi B

6 Xây dựng tiêu chuẩn dược liệu, bán sản phẩm và thuốc mới

I- TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Một số thông tin chung về 10 cây thuốc - đối tượng nghiên cứu của đề tài:

• Cây Ban tròn (Hypericum patulum Thunb ex Murr.):

Cây ban tròn (họ Ban -Hyperaceae) mọc rất phổ biến ở vùng thượng du miền Bắc và

miền Trung nước ta [24] Nghiên cứu trước đây của chúng tôi (thuộc Đề tài KC10-07) cho thấy cao nước của lá ban tròn có tác dụng bảo vệ gan, giảm enzym GPT, giảm bilirubin trên mô hình gây viêm gan cấp bằng CCl4 [13] Cao nước của lá ban tròn còn có tác dụng giảm hàm lượng colagen và malonyl dialdehyd (MDA) trong gan chuột bị gây viêm gan mạn bằng CCl4 [25, 26]

Vi phẫu lá ban tròn đã được nghiên cứu có những đặc điểm sau:

- Gân lá: Gân phía trên hơi lõm, phía dưới lồi nhiều Biểu bì trên là một hàng tế bào hình

chữ nhật có kích thước lớn hơn tế bào biểu bì dưới Mô dày nằm sát biểu bì, thường có

2-3 lớp tế bào có thành rất dày Mô mềm cấu tạo bởi các tế bào thành mỏng, hình đa giác,

có kích thước nhỏ hơn tế bào mô dày Bó libe gỗ -lớn, hình gần như tròn, với phần libe rất phát triển ở phía dưới bó gỗ Gỗ cấu tạo bởi các mạch gỗ xếp thành hàng có hình cung

-Phiến lá: Biểu bì trên là một hàng tế bào hình chữ nhật có kích thước lớn, xếp đều đặn,

tế bào biểu bì phía dưới có kích thước nhỏ hơn Mô dậu là một hàng tế bào hình chữ nhật dài xếp vuông góc với tế bào biểu bì trên Mô mềm khuyết là những tế bào có kích thước nhỏ, thành mỏng [26]

Bột lá Ban tròn có màu nâu sẫm, mùi thơm nhẹ, vị hơi chát Soi dưới kính hiển vi thấy: Mảnh biểu bì phiến lá là những tế bào hình ngũ giác hoặc đa giác xếp đều đặn, màu vàng nhạt hoặc lục nhạt Mảnh phiến lá có tế bào mô dậu hình chữ nhật hình que khá dài, xếp đều đặn thành một hàng Mảnh mạch xoắn có 3 đến 4 hàng xếp liền nhau với những

tế bào xếp đều đặn, màu vàng tươi Mảnh phiến lá màu lục xen vàng nhạt, mang tế bào lỗ khí hình tròn hoặc hạt đậu Mảnh biểu bì của cuống lá có những tế bào màu lục hoặc vàng sẫm xếp thành những hàng dài [26]

Gần đây ở Ấn Độ đã nghiên cứu tác dụng của cao methanol từ lá ban tròn trên khả năng tái tạo tế bào và làm lành vết thương trên chuột Cao methanol bào chế dưới dạng thuốc mỡ nồng độ 5 và 10 % đều thể hiện tác dụng làm lành vết thương có ý nghĩa thống

kê so với nhóm chứng Dịch chiết chloroform và dịch chiết methanol của lá và thân cây ban tròn có phổ kháng nấm khá rộng [58, 59]

Dịch chiết của lá cây ban tròn có tác dụng làm giảm có ý nghĩa thống kế thời gian ngủ do pentobarbitone gây ra [60]

Thử tác dụng kháng ung bướu của cao chiết methanol cây ban tròn cho thấy IC50 trên

tế bào ung thư gan HEP-2 là 1,71µg/ml, trên dòng RD là 1,53µg/ml và trên dòng Vero là 2,23µg/ml, Nếu thử với nồng độ 100 - 200 µg/ml thì cao methanol ức chế hoàn toàn dòng ung thư HEP-2 [60]

• Cam thảo dây (Abrus precatorius L.), Họ đậu (Fabaceae):

Cây mọc hoang ở vùng rừng núi, nhiều nhất ở vùng ven biển Bộ phận sử dụng: Rễ, dây, lá, thu hái vào mùa thu đông, tốt nhất khi cây mới ra hoa

Công dụng: Chữa ho, cảm sốt, hoàng đản do viêm gan siêu vi trùng, giải độc, vị ngọt

nên dùng trong các đơn thuốc cho dễ uống Ngày dùng 8-16g sắc uống [28]

Cam thảo dây còn chưa được nghiên cứu đối với bệnh viêm gan, chủ yếu được dùng theo kinh nghiệm của nhân dân

Tác dụng kháng khuẩn của dịch chiết từ lá cam thảo dây: kháng Staphylococcus

aureus với gía trị MIC of 8 ug/ml [30] Abruquinone có tác dụng kháng virut và độc tính

tế bào, abruquinone B có tác dụng kháng virut, kháng vi trùng lao và vi trùng sốt rét [50]

Thành phần hóa học của lá và dây cam thảo: Trong thành phần hóa học của lá cam thảo dây có các isoflavanquinone, abruquinone B, abruquinone G [50]; saponin triterpenoid [48] và các glycosid triterpenic abrusoside A - D - là các chất ngọt tương tự như glycyrrhizin có độ ngọt gấp 30 - 100 lần đường sucrose [36] Các saponin triterpenoid có tác dụng kháng viêm

• Diệp hạ châu (chó đẻ răng cưa) (Phyllanthus urinaria L.):

Nhân dân dùng cây diệp hạ châu để chữa bệnh gan từ lâu đời Kết quả nghiên cứu của một số tác giả cho rằng diệp hạ châu có tác dụng kháng sự nhân lên của nhiều loại

virut: Virut viêm gan B, Epstein-Bar virut, retrovirut, hespes simplex virut (HSV), cải thiện enzym gan, chuyển đổi các dấu ấn của virút VGB trên lâm sàng ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính [68]

Gần đây, các tác giả Hàn Quốc phát hiện ellagic acid chiết tách từ diệp hạ châu có tác dụng phóng bế virut VGB giải phóng HBeAg (kháng nguyên e) trong các tế bào gan (IC50 = 0,07 microg/ml) [64]

Thành phần hoạt chất của diệp hạ châu là các lignan (phyllanthin, hypophyllanthin, phyltetralin và niranthin) và các flavonoid ellagic acid, gallic acid, geraniin [73]

Ở Việt Nam diệp hạ châu thường được dùng phối hợp với các vị thuốc đông dược khác trong một số bài thuốc điều trị bệnh gan

• Dứa gai (Pandanus odoratissimus L.):

Nhân dân thường dùng quả để chữa bệnh gan, đầy bụng, khó tiêu, hoàng đản

Thành phần hoá học và tác dụng sinh học của quả dứa gai còn ít được nghiên cứu Năm 2002 trong khuôn khổ của đề tài cấp Viện Dược liệu (do TS Phạm Thanh Trúc làm chủ nhiệm) chúng tôi đã nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của cao lỏng quả dứa gai thu hái tại tỉnh Kiên Giang Kết quả cho thấy cao lỏng của quả dứa gai có tác dụng bảo vệ gan, chống oxy hoá trên chuột gây viêm gan cấp và mạn tính bằng CCl4

• Cốt khí (Polygonum cuspidatum Sieb et Zucc.):

Thành phần hoá học của rễ cốt khí: có stilbene glycoside, piceid (2.23%), resveratrol; anthranoid (emodin, chrysophanol, physcion); quinon; phenol

Người Dao thường dùng rễ cây cốt khí làm thuốc chữa bệnh gan

Gần đây ở Đài Loan đã công bố kết quả nghiên cứu tác dụng ức chế virut VGB của dịch chiết nước và dịch chiết cồn của cốt khí củ Dịch chiết cồn ức chế sự nhân lên của virút VGB với nồng độ tối thiểu 10 microg/ml ( P < 0,0001) Cao nước ức chế sự nhân lên của virút VGB với nồng độ cao hơn 30 microg/ml (P < 0,05) [34]

• Khúng khéng (Hovenia dulcis Thunb.):

Thành phần hoá học: có 8 hợp chất phenolic (1-8): vanillic acid (1), ferulic acid (2), 3,5-dihydroxystilbene (3), (+)-aromadendrin (4), methyl vanillate (5), (-)-catechin (6),

2,3,4-trihydrobenzoic acid (7), and (+)-afzelechin (8) [51]; flavonoid: dihydrokaempferol (I), quercetin (II), (+)-3,3',5',5,7-pentahydroflavanone (III) and (+)-dihydromyricetin Người dân ở Cao bằng, Lạng Sơn dùng quả cây khúng khéng chữa ngộ độc thức ăn, ngộ độc do rượu

Một số tài liệu của Trung Quốc thông báo về tác dụng bảo vệ gan trên mô hình gây tổn thương gan do CCl4/D-galactosamine gây ra [46]; ức chế xơ gan trên chuột gây xơ gan bằng CCl4 [52]; giải độc của rượu, thúc đẩy sự chuyển hoá của rượu ở gan [35]

• Muồng trâu (Cassia alata L.):

Ở Việt Nam cây muồng trâu mọc hoang và được trồng ở nhiều nơi, nhiều nhất ở

miền Nam, miền Trung và một số tỉnh miền Bắc (Thanh Hóa, Nghệ Tĩnh) [5, 20]

Thành phần hoá học: Lá chứa anthraglucosid (3-4%), acid chrysophanic, rhein Công dụng: Chữa táo bón, phù thũng, đau gan, vàng da: Lá dùng dưới dạng chè

Chữa hắc lào, bệnh tôkêlô, ecpét loang vòng, ghẻ, lở loét ở súc vật: Lá tươi giã nát xát, hoặc vắt nước bôi vào nơi bị bệnh Dùng nhuận tràng: Ngày 4 - 8g bột thân lá; tẩy: 15 - 20g sắc uống [9]

Nghiên cứu gần đây cho thấy lá muồng trâu có tác dụng kháng nấm và kháng khuẩn,

vì vậy có triển vọng làm thuốc điều trị nhiễm trùng cơ hội cho bênh nhân AIDS [39].

Cho đến nay chưa tìm thấy tài liệu nghiên cứu về tác dụng của lá muồng trâu đối với bệnh VGB trên thực nghiệm cũng như trên lâm sàng

• Ngũ vị Hoa Nam (Schisandra sphenanthera Rehder & E.H Wilson):

Ở Việt Nam cây ngũ vị hoa nam đã được TS Nguyễn Bá Hoạt và CS của VDL phát hiện tại vùng núi Ngọc Linh thuộc 2 tỉnh Kong Tum và Quảng Nam [12] Kết quả điều tra sơ bộ cho thấy trữ lượng quả khá cao tại 3 xã Ngọc Lây, Tê Xăng và Măng Ri : ~

4 – 5 tấn quả khô/năm Viện Dược liệu đã nghiên cứu thăm dò tác dụng bảo vệ gan của quả ngũ vị hoa nam thu hái taị núi Ngọc Linh so sánh với ngũ vị Trung Quốc Kết qủa cho thấy cao ngũ vị tử hoa nam với liều thử 67mg/kg có tác dụng giảm men gan, giảm

bằng CCl4 và bằng ethanol, so với lô chứng bệnh lý kết quả có ý nghĩa thống kê Cao ngũ

vị tử hoa nam còn làm gỉam thời gian ngủ của pentobarbital bị kéo dài do tiêm CCl4 Kết quả nghiên cứu thăm dò trên đây cho thấy quả ngũ vị hoa nam rất có triển vọng trong điều chế thuốc trị viêm gan mạn [Nguyễn Bá Hoạt, 2005]

• Nọc sởi (Hypericum japonicum Thunb.ex Murr.):

Cây nọc sởi, còn có tên là điền cơ hoàng, châm hương Bộ phận sử dụng: Toàn cây (thân, cành mang lá, hoa, rễ) Thành phần hoá học: Cây nọc sởi thu hái tại Việt Nam đã được phân tích sơ bộ thành phần hoá học bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (SKLM) Kết quả cho thấy trong phần trên mặt đất của cây có flavonoid, acid amin, acid hữu cơ [26]

Tại Nhật Bản các tác giả đã chứng minh trong cây nọc sởi có các dẫn xuất phloroglucinol: saroaspidin A, B và C; các sarothralen A, B, C và D; sarothralin và sarothralin G Gần đây các bisxanthones jacarelhyperol A và B đã được phân lập từ cây nọc sởi ở Nhật Bản

Cây nọc sởi còn là một vị thuốc dùng trong dân gian Tính chất: Theo Đông y cây nọc sởi có vị đắng, ngọt, tính bình, không độc vào 2 kinh can và tỳ Có tác dụng thanh thấp nhiệt, tiêu thũng trướng, khử tích tiêu thực (chữa tiêu hoá kem, đầy) dùng chữa cam tích, thấp nhiệt hoàng đản Dùng ngoài chữa rắn cắn, bị thương, sưng đau Chữa hoàng đản: cây nọc sởi khô: 40 – 60 g sắc uống [11, 20]

Theo kết quả nghiên cứu của các nước, cây nọc sởi có tác dụng kháng vi rút mạnh (HSV-II, HIV) và kháng khuẩn Tại Trung Quốc cây nọc sởi được dùng chữa viêm gan cấp hoặc mạn tính [5, 11] Gần đây cây nọc sởi được chứng minh có tác dụng chống ô xy hóa lipid mạnh Các tác giả cho rằng tác dụng này có liên quan đến tác dụng bảo vệ gan của dược liệu [33]

• Vọng cách (Premna corymbosa Rootl ex Willd.), họ Cỏ roi ngựa (Verbenaceae):

Cây vọng cách mọc hoang và được trồng ở đồng bằng và vùng núi để lấy lá làm gia

vị ăn gỏi cá Nhân dân thường dùng lá vọng cách làm thuốc chữa kiết lỵ, tiêu hoá kém, tiểu tiện khó, trị phù do gan, xơ gan [5, 11, 20] Người Mường Hoà Bình dùng lá vọng cách chữa bệnh gan Ngày dùng 8-12g lá

Thành phần hoá học của lá vọng cách: Lá có mùi thơm hắc Trong lá có verbacosid iridoid glucosid là bremcoryosid, alcaloid premnazol [5]

Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hóa học của lá vọng cách cho thấy trong lá vọng cách có các thành phần: alcaloid, flavonoid, coumarin, saponin và đường khử Đã xác định chỉ số bọt của saponin trong lá là 125, chỉ số phá huyết đối với máu dê là 400 Độc tính cấp: không xác định được LD50 khi cho chuột uống với liều ~ 50g dược liệu/kg chuột [21]

Tác dụng chống oxy hóa của cao lỏng lá vọng cách với liều tương đương ~10g dl./kg chuột có tác dụng làm giảm 7,86% hàm lượng MDA ở chuột bị gây tăng oxy hóa bằng CCl4 Cao lỏng còn có tác dụng giảm hoạt tính của GPT từ 154,95 xuống còn 119,11(U/l)

và giảm hàm lượng bilirubin từ 2,78 xuống 2,09 (µmol/l) trong huyết thanh chuột bị gây viêm gan cấp bằng CCl4 [21]

* Nhận xét chung:

-Những thông tin trên đây cho thấy 10 cây thuốc liệt kê ở trên là những cây thuốc đã được sử dụng trong điều trị một số bệnh về gan theo kinh nghiệm của nhân dân, trong đó một số cây đã được nghiên cứu sơ bộ ở trong và ngoài nước về tác dụng bảo vệ gan, ức chế xơ gan Vì vậy các dược liệu từ các cây thuốc này rất có triển vọng trong nghiên cứu sàng lọc để tìm các vị thuốc có tác dụng bảo vệ gan tốt nhất, làm cơ sở cho nghiên cứu bào chế một loại thuốc điều trị viêm gan B mạn

-Việc lựa chọn các cây thuốc này làm đối tượng nghiên cứu sàng lọc vị thuốc có tác dụng bảo vệ gan sẽ rút ngắn thời gian nghiên cứu và bảo đảm tính khả thi của đề tài

-Kết quả thử nghiệm đồng thời trên cùng một mô hình nghiên cứu sẽ cho phép lựa chọn sản phẩm chiết xuất có tác dụng bảo vệ gan tốt nhất để bào chế một loại thuốc điều trị viêm gan B mạn - là mục tiêu chính của đề tài

1.2 Một số bài thuốc điều trị viêm gan:

Trong nhân dân đã lưu truyền và đang được sử dụng một số bài thuốc trị các bệnh về gan, trong đó có VGB, xơ gan cổ chướng, hoàng đản, suy giảm chức năng gan…:

1) Bài thuốc chữa viêm gan siêu vi khuẩn thể cấp tính [27]: Hạ khô thảo (30 g), ý dĩ (20

g), gừng khô (3 lát), dành dành (12 g), Hoài sơn (20 g), thổ phục linh (12 g), sâm bố chính (20 g), mã đề (10 g), trần bì (6 g) Sắc uống ngày 1 thang

2) Bài thuốc chữa viêm gan siêu vi khuẩn thể mạn tính [ 27]: Hạ khô thảo (40 g); thổ

phục linh (12 g), nghệ vàng (10 g), mã đề (40 g), rau má (40 g) Sắc uống ngày 1 thang

3) Bài thuốc chữa viêm gan nhiễm trùng: bạch truật (9 g), Nhân trần (30 g), trạch tả (9 g),

dành dành (9 g), thổ phục linh (12 g), nước 450 ml sắc còn 200 ml chia 3 lần uống trong ngày

4) Bài thuốc chữa viêm gan siêu vi trùng (theo phương pháp chữa thanh nhiệt, lợi thấp)

[27]: Nhân trần (30 g), dành dành (12 g), vỏ đại (10 g) (hoặc chất chiết 8 g) Sắc uống ngày 1 thang, uống trong 5 – 7 ngày

5) Xirô nhân trần: Chữa vàng da, vằng mắt, viêm gan [20]: Nhân trần (24 g), chi tử (12

g), nước 600 ml, sắc còn 100 ml, thêm đường cho đủ thành xirô Chia 3 lần uống trong ngày

6) Bài thuốc LIV-94: Diệp hạ châu đắng, chua ngút, cỏ nhọ nồi Đây là bài thuốc nghiên

cứu trong khuôn khổ đề tài cấp thành phố : “Đánh giá tác dụng của thuốc LIV-94 làm giảm và sạch HBsAg trên bệnh nhân viêm gan mạn tính” do BS Nguyễn Bá Kinh(Giám đốc bệnh viện Thanh nhàn) làm chủ nhiệm kết hợp với Viện quân Y 103 Các vị thuốc trong bài thuốc này đều là các vị thuốc chỉ huyết lương, có tác dụng cầm máu, lợi mật, hạ men gan, làm giảm và sạch HBsAg- kháng nguyên bề mặt của viêm gan B Bệnh nhân bị viêm gan mạn tính sau khi dùng thuốc LIV-94 từ 50 đến 97% số bệnh nhân được phục hồi

men gan transaminase, từ 67 – 100% số bệnh nhân (tuỳ theo bệnh lý ban đầu) giảm bilirubin toàn phần trở về bình thường

7) Xirô Hebevera – bài thuốc gia truyền của Lương Y Trần Xuân Thiện: Bài thuốc gồm 3

vị: Diệp hạ châu đắng, xuyên tâm liên và chi tử Bài thuốc này đã được lương y Trần Xuân Thiện dùng điều trị cho nhiều thanh niên tình nguyện có HBsAg(+) sau thời gian điều trị có HBsAg (-) Kết qủa nghiên cứu đã được công bố Bài thuóc có 2 tác dụng: +Chuyển HBsAg (+) trở về âm tính HBsAg(-) là 26,5% (26/98 người)

+Tác động lên hệ miễn dịch, kích thích sản xuất ra kháng thể chống kháng nguyên HBsAg là 62% trường hợp (59/98 người)

+Thuốc không có tác dụng phụ

Sau này DS Trần Dũng Sỹ cùng PGS Hà Văn Ngạc (Viện Quân Y 103) tiếp tục nghiên cứu dưới dạng xirô Hebevera

8) Bài thuốc VG 99: Bài thuốc gồm 7 vị: Diệp hạ châu đắng, nhân trần, sa tiền, rau má,

ngũ vị tử, uất kim, đại hoàng Thuốc được bào chế dưới dạng cao lỏng chiết xuất theo quy trình của Khoa dược, Viện Y học cổ truyền (YHCT) Việt Nam Thuốc đã được dùng điều trị cho 18 bệnh nhân VGB tại Bệnh viện Đống đa và Viện YHCT với liều dùng 50 ml/ngày trong 2 tháng Kết quả thuốc VG 99 có tác dụng cải thiện tốt các triệu chứng lâm sàng, làm giảm trasaminase máu, giảm hoạt động viêm trên mô học ở bệnh nhân VGB mạn tính Tại Sơn La từ lâu bài thuốc này cũng được nhiều người sử dụng để chữa VGB

9) Bài thuốc bổ gan – thông mật: Thành phần có 3 vị: Cao actisô, cao khô biển súc (rau

đắng), bột hạt bìm bìm Bài thuốc này được một số công ty Dược trong nước sản xuất

10) Bài thuốc tiêu phong nhuận gan số 40: Là thuốc do Cơ sở Đông Nam Dược Ngọc liên

Mỹ tho, Cần thơ sản xuất Thành phần gồm 20 vị: Muồng trâu, rau má, xuyên tâm liên, rau đắng biển, dâu tằm, hoàng đằng, nghệ, dứa gai, bèo cái, actisô, lạc tiên, vông nem, cỏ mần trầu, cỏ mực, móp gai, ô rô, quau nước, chi tử, hương phụ và kim ngân hoa Thuốc

có tác dụng nhuận gan, lợi mật, kháng viêm, giải độc, nhuận tràng Trị viêm gan mạn, mệt mỏi, kém ăn, đầy bụng, đau vùng gan

Trên đây là một số trong số rất nhiều bài thuốc được sử dụng trong nhân dân để điều

bài thuốc đã được chứng minh trên lâm sàng Nhận xét chung: Các bài thuốc thường có ít nhất 3 vị , nhiều nhất đến 20 vị Một số dược liệu có tần suất sử dụng nhiều trong các bài thuốc là: Diệp hạ châu đắng, dành dành, mã đề, rau má, nhân trần, actisô, rau đắng Thành phần các bài thuốc thường gồm các vị thanh nhiệt, lương huyết Theo y học hiện đại các

vị thuốc có tác dụng chống ô xy hoá là có tác dụng bảo vệ gan, chống viêm gan do đó có tác dụng giảm các enzym gan và chống hoại tử tế bào gan Một số vị có tác dụng kích thích sản xuất kháng thể chống kháng nguyên HBsAg, ức chế sự nhân lên của vi rút VGB nhờ vậy làm chuyển HBsAg (+) về âm tính và giảm số lượng vi rút VGB

1.3 Một số hoạt chất có tác dụng trong điều trị viêm gan:

Việc tìm kiếm các chất bảo vệ gan thường được bắt đầu từ các cây thuốc đã được sử dụng theo kinh nghiệm cổ truyền để chữa các bệnh liên quan đến gan Trong số các cây

được chú ý nghiên cứu và sử dụng nhiều nhất có thể kể đến: cúc gai (Silybum marianum ), actisô (Cynara scolymus ), ngũ vị tử (Schizandra chinensis), diệp hạ châu (Phyllanthus

urinaria ), nghệ (Curcuma longa), sài hồ (Buplerum chinensis)… Nhiều chất đã được

phân lập và được chứng minh có tác dụng bảo vệ gan Các chất đó thuộc nhiều nhóm chất: nhóm hợp chất phenol (flavonolignan, flavonoid, lignan, coumarin, xanthon, tanin, acid phenolic…), terpenoid, alcaloid và các chất khác

Trong đó, các hợp chất flavonoid đã được nhiều công trình nghiên cứu chứng minh

có tác dụng bảo vệ gan thông qua các tác dụng: dập tắt gốc tự do, tác dụng chống oxy hoá, bảo vệ tế bào, chống lão hoá tế bào, tăng tiết dịch mật, giải độc gan, bảo vệ chức năng gan, lợi tiểu, chống viêm, giảm đau trên thực nghiệm Hoạt tính của flavonoid chủ yếu là nhờ trong cấu trúc hoá học của chúng có vòng thơm, hệ nối đôi liên hợp, nhóm carbonyl, nhóm OH phenol Có 49 chất thuộc nhóm flavonoid đã được chứng minh có tác dụng bảo vệ gan [15, 29, 38, 40, 44, 65 ]

Catechin (cyanidanol-3) là một bioflavonoid đã được nghiên cứu chứng minh tác dụng trên các mô hình gây viêm gan ở động vật và trên lâm sàng Biệt dược Catergen

chứa (+)-catechin đơn chất đã được đưa vào sử dụng trong điều trị viêm gan từ 1976,

[71] Hợp chất này thể hiện tác dụng kích thích miễn dịch, bảo vệ chức năng gan ở bệnh nhân viêm gan B Khi dùng phối hợp với alpha-interferon nó làm tăng tác dụng chống virút VGB của alpha-interferon Các dẫn chất của catechin như gallocatechin, epigallocatechin cũng có tác dụng bảo vệ gan trên các mô hình gây tổn thương gan bởi D-galactosamin và lipopolysaccharid ở chuột nhắt [70, 72] Các chất này có trong chè xanh

Camellia sinensis và thường gặp trong nhiều cây khác Các flavonoid: ellagic acid, gallic

acid, geraniin trong diệp hạ châu đã được chứng minh có tác dụng bảo vệ gan [73]

Tuy nhiên trong nhiều trường hợp các chất này chỉ là chất chỉ định được dùng để kiểm soát chất lượng của các thuốc thảo mộc Trên thực tế chúng chiếm một hàm lượng thấp trong nước sắc của các bài thuốc hoặc các dạng bào chế Đa số các bài thuốc có thành phần phức tạp cùng với sự phối chế tinh sảo của thiên nhiên làm nên những tổ hợp các chất trong các sản phảm chiết xuất từ dược liệu mà chúng ta chưa biết hết Vì vậy việc

dự đoán thành phần hoạt chất trong các bài thuốc chỉ là tương đối Điểm quan trọng là thuốc có tác dụng làm giảm các triệu chứng của bệnh và cải thiện các xét nghiệm enzym gan, bilirubin, giảm viêm, chuyển đảo huyết thanh, xuất hiện anti-HBeAg và làm giảm số lượng vi rút VGB, ức chế xơ gan

II- VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu:

Vật liệu nghiên cứu là 10 vị thuốc (bảng 2.1) và 2 bài thuốc điều trị viêm gan siêu vi cấp

và mạn tính

Bảng 2.1: Danh sách các vị thuốc nghiên cứu STT Tên vị thuốc Tên khoa học của cây

thuốc

Nơi thu hái mẫu

1 Quả cây ngũ vị tử hoa

nam

Schisandra sphenanthera

Rehder & E.H Wilson

Đắc Tô, Kon Tum

2 Lá cây ban tròn Hypericum patulum

Thunb ex Murray

Sapa, Lào Cai

Phyllanthus urinaria L Thanh Trì, Hà Nội

7 Cam thảo dây Abrus precatorius Thanh Trì, Hà Nội

8 Quả khúng khéng Hovenia dulcis Thunb Thị xã Cao Bằng

9 Lá muồng trâu Cassia elata L Thanh Trì, Hà Nội

10 Lá vọng cách Premna corymbosa Thanh Trì, Hà Nội

*Hai bài thuốc chữa viêm gan siêu vi mạn tính đã được nghiên cứu sàng lọc tác dụng bảo

vệ gan [27]:

-Bài số 1: Thành phần có: Hạ khô thảo (30g), ý dĩ (20 g), gừng khô (3 lát), dành dành (12

g), hoài sơn (20 g), thổ phục linh (12g), sâm bố chính (20g), mã đề (10g), trần bì (6g) Sắc uống ngày 1 thang dùng điều trị viêm gan siêu vi cấp tính

- Bài số 2: Thành phần có: Hạ khô thảo (40 g), mã đề (40 g), thổ phục linh (12 g), nghệ

vàng (10g) và rau má (40g) Sắc uống ngày 1 thang dùng điều trị viêm gan siêu vi mạn tính

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp nghiên cứu hoá học và chiết xuất:

2.2.1.1 Định tính các nhóm chất trong dược liệu: Các dược liệu chưa biết thành phần

hoá học được phân tích sơ bộ bằng các phản ứng hóa học

2.2.1.2 Phương pháp định lượng:

Hypatin bằng sắc ký lỏng cao áp (SKLCA) [26]

+ Hoá chất, dung môi:

- Acetonitril tinh khiết ( Merck)

- Acid acetic glacial tinh khiết ( Merck)

- Methanol tinh khiết ( Merck)

+ Mẫu đối chiếu:

Mẫu đối chiếu Astilbin: Viện Dược liệu điều chế, hàm lượng 92% (định lượng bằng

SKLCA)

Mẫu đối chiếu Quercitrin: của hãng Chromadex Inc, hàm lượng 98,6% (định lượng

bằng SKLCA - theo phiếu kiểm nghiệm của hãng Chromadex)

*Tiến hành:

* Dung dịch đối chiếu Astilbin: Cân chính xác khoảng 50mg Astilbin đối chiếu vào

bình định mức 100ml, thêm 70ml Methanol lắc siêu âm để hoà tan, sau thêm Methanol đến vạch, lắc đều Lọc qua màng lọc 0,45µm

*Dung dịch đối chiếu Quercitrin: Cân chính xác khoảng 50mg Quercitrin đối chiếu

vào bình định mức 100ml, thêm 70ml Methanol lắc siêu âm để hoà tan, sau thêm Methanol đến vạch, lắc đều Lọc qua màng lọc 0,45µm

*Dung dịch thử của viên Hypatin: Cân chính xác một lượng bột viên khoảng 490mg

vào bình định mức 50ml, thêm 40ml Methanol lắc siêu âm để hoà tan, sau thêm Methanol đến vạch, lắc đều Lọc qua màng lọc 0,45µm

*Dung dịch thử của bột Hypatin: Cân chính xác một lượng bột khoảng 280mg vào

bình định mức 50ml, thêm 40ml Methanol lắc siêu âm để hoà tan, sau thêm Methanol đến vạch, lắc đều Lọc qua màng lọc 0,45µm

Tiêm các dung của mẫu đối chiếu và mẫu thử của viên Hypatin vào hệ thống sắc ký, ghi sắc ký đồ Từ diện tích hoặc chiều cao của các píc Astilbin, Quercitrin đối chiếu và của dung thử tương ứng, lượng cân của mẫu đối chiếu và mẫu thử, độ pha loãng của mẫu đối chiếu và mẫu thử, khối lượng trung bình viên ta tính được hàm lương (mg) của Astilbin và Quercitrin trong viên

Tiêm các dung dịch đối chiếu và dung dịch thử của bột Hypatin vào hệ thống sắc

ký, ghi sắc ký đồ Từ diện tích hoặc chiều cao của các píc Astilbin, Quercitrin đối chiếu

và của dung dịch thử tương ứng, lượng cân của mẫu đối chiếu và mẫu thử, độ pha loãng của mẫu đối chiếu và mẫu thử ta tính được hàm lương (%) của Astilbin và Quercitrin trong bột Hypatin

Thời gian lưu của pic Astilbin đối chiếu : 5,782 phút

Thời gian lưu của pic Quercitrin đối chiếu : 7,856 phút

• Định lượng flavonoid toàn phần trong lá ban tròn và quả dứa gai:

Cân chính xác khoảng 4 g dược liệu lá Ban tròn đã xay nhỏ Tiến hành chiết siêu âm với 200 ml methanol trong 30 phút Cân trọng lượng bình cùng dung môi trước và sau khi chiết Bổ sung dung môi cho đến trọng lượng ban đầu Lọc lấy 100 ml dịch lọc (tương đương 2 g dược liệu) Cô cạn trên bếp cách thủy đến cắn Hòa cắn trong 20 ml nước nóng, lọc qua giấy lọc, tráng giấy lọc bằng 5 ml nước nóng x 2 lần, gộp vào dịch lọc

Chuyển dịch lọc vào bình lắng gạn Tráng bình bằng 30 ml ethyl acetat Chuyển dịch ethyl acetat vào bình lắng gạn Lắc hỗn hợp trong 5 phút, để tách lớp Gạn lớp ethyl acetat vào cốc đã sấy đến trọng lượng không đổi Tiếp tục làm như vậy đến khi dịch ethyl acetat không màu Cô dịch ethyl acetat trên bếp cách thủy đến cắn Sấy cốc cùng cắn trong tủ sấy ở 1050C trong 3 giờ Để cốc trong bình hút ẩm 30 phút và cân nhanh Tính trọng lượng của cắn (a gam)

Hàm lượng (%) flavonoid toàn phần tính theo hàm lượng chất chiết được bằng ethyl acetat được tính theo công thức:

a x 100 x 100 X(%) = -

P (100 - B)

Trong đó: X : Hàm lượng flavonoid toàn phần trong dược liệu (%)

P : Khối lượng bột dược liệu đã cân để định lượng (g)

a : Trọng lượng của cắn (g)

B : Độ ẩm của dược liệu (%)

bằng phương pháp quang phổ tử ngoại:

Hàm lượng flavonoid toàn phần trong các chế phẩm chiết xuất từ lá ban tròn được

tính theo astilbin

-Mẫu thử: Cân chính xác khoảng 0,05g chế phẩm cho vào bình định mức 50ml, thêm

30ml methanol Siêu âm 15 phút cho tan hoàn toàn, thêm methanol vừa đủ Lắc đều Lọc qua giấy lọc, lấy chính xác 1ml dịch lọc cho vào bình định mức 50ml thêm methanol vừa

đủ được dung dịch thử

-Mẫu đối chiếu: Cân chính xác 10mg Astilbin, hoà tan với methanol trong bình định mức

dung tích 100ml Lắc đều, được dung dịch A Lấy chính xác 1ml dung dịch A vào bình định mức dung tích 10ml Thêm methanol đến vạch, lắc đều, được mẫu đối chiếu có nồng

độ 10µg/ml

Đo độ hấp thụ của mẫu thử và mẫu đối chiếu ở bước sóng 290nm

Hàm lượng (%) flavonoid toàn phần tính theo astilbin được tính theo công thức:

Dx x 10 x 2500 x 100X% = -

Dc x 104 x m

Trong đó: Dc- Mật độ quang của mẫu đối chiếu

Dx- Mật quang của mẫu thử

m-Khối lượng mẫu thử đã cân (g)

Hàm lượng saponin toàn phần trong các dược liệu được định lượng bằng phương pháp cân [9]

Cân chính xác khoảng 10 g bột dược liệu (đã xác định độ ẩm) Cho vào túi lọc rồi chiết soxhlet với 300 ml methanol cho tới khi dịch chiết trong suốt và không cho phản ứng với

H2SO4 đặc Dịch chiết methanol được thu hồi dung môi dưới áp suất giảm bằng máy cất quay cho tới khi còn khoảng 40 ml Để nguội, lọc qua giấy lọc Tráng giấy lọc bằng 10 ml methanol Cô còn khoảng 30 ml Rót từ từ vào 300 ml aceton Để cốc phản ứng vào tủ lạnh qua đêm Gạn lấy tủa Tủa được để ngoài không khí cho bay hết hơi aceton, hoà lại trong 20 ml methanol, đun cách thuỷ Để nguội, lọc, tráng giấy lọc bằng 10 ml methanol Rót từ từ vào 300 ml aceton, để lạnh qua đêm Gạn lấy tủa Tủa Saponin toàn phần được sấy trong tủ sấy chân không ở nhiệt độ 600C dến khối lượng không đổi Cân và tính hàm lượng saponin toàn phần

Hàm lượng saponin toàn phần được tính theo công thức:

a x 100 x 100 X(%) = -

P (100 - B) Trong đó: a: Khối lượng cắn khô saponin toàn phần (g)

P: Khối lượng dược liệu đem định lượng (g)

B: Độ ẩm của dược liệu (%)

• Định lượng lignan toàn phần trong quả ngũ vị:

Phương pháp: Kỹ thuật sắc ký lớp mỏng kết hợp với phương pháp đo quang Hàm lượng

lignan toàn phần được tính theo chất chuẩn Gomisin C

Tiến hành:

- Chuẩn bị mẫu: 1g bột dược liệu được chiết với 25 ml MeOH theo tỷ lệ 1 : 25 (10

x 10 x 5ml) bằng siêu âm ở 400C, lọc, cô dịch chiết đến cắn trên bếp cách thủy ở 600C, hòa tan cắn bằng CHCl3 và định mức chính xác 20 ml Hút 0,2 ml dịch CHCl3 tiến hành sắc ký lớp mỏng chế hóa (bản silicagel tráng sẵn GF254) với hệ dung môi hexan - aceton (65:53), phát hiện bằng cách soi UV 254nm, cạo vùng hấp thu tương ứng với nhóm hợp chất lignan và dùng MeOH giải hấp phụ Cô dịch MeOH đến cắn trên bếp cách thủy ở

600C Hòa tan cắn bằng CHCl3, lọc và quy vào bình định mức 50 ml, tiến hành đo mật độ quang

- Đo độ hấp thụ: dịch CHCl3 được đo bằng cuvette thạch anh 1cm, bước sóng 242

nm Tiến hành định lượng 3 lần Trị số OD thu được đối chiếu với đường chuẩn Gomisin

C và suy ra hàm lượng lignan toàn phần có trong mẫu

ghi trong DĐVN III, chuyên luận “Muồng trâu”: Hàm lượng anthranoid được xác định bằng phương pháp quang phổ tử ngoại tính theo anthraquinon [9]

2.2.1.3- Phương pháp điều chế các mẫu cao toàn phần và chiết tách các chất tinh khiết cho thử sàng lọc tác dụng bảo vệ gan:

*Điều chế cao toàn phần: Các vị thuốc được chiết với 3 dung môi khác nhau: n-hexan,

ethanol 80% và nước trên bếp cách thuỷ có ống sinh hàn ngược đến hết màu của dịch chiết Lọc các dịch chiết Cô thu hồi dung môi dưới áp suất giảm đến cao đặc dùng để nghiên cứu

*Chiết tách các chất tinh khiết Astilbin và quercitrin từ lá ban tròn: Các chất tinh khiết

được tách từ hỗn hợp flavonoid của lá ban tròn bằng phương pháp sắc ký cột pha thường

và pha đảo với các hệ dung môi rửa giải thích hợp, kết tinh nhiều lần, thu được các chất tinh khiết Kiểm tra độ tinh khiết bằng SKLCA và SKLM

*Chiết tách và nhận dạng các chất tinh khiết từ quả ngũ vị: Bột quả NVT (100 g) khô

được chiết với methanol bằng thiết bị siêu âm ở nhiệt độ 500C Sau khi thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được 8 gam cao đặc

Bổ sung 700 ml nước cất vào cao đặc, lắc đều, sau đó chiết lần lượt bằng n-hexan, cloroform, ethyl acetat và n-butanol Bốc hơi dung môi, thu được các phân đoạn n-hexan (1,2g), cloroform (4,1g), ethyl acetat (0,7g) và n-butanol (0,6g)

4,1 g cao cloroform được tiến hành phân lập bằng các phương pháp sắc ký cột với các dung môi rửa giải khác nhau Các phân đoạn thu được tiếp tục tinh chế bằng sắc ký lớp mỏng (SKLM) điều chế Kết tinh trong các dung môi thích hợp, thu được 6 chất tinh khiết ký hiệu: NVT1A1, NVT1A2, NVT1A3, NVT1A4, NVT1A6 và NVT1A7 Cấu trúc hóa học được xác định dựa trên các đặc trưng lý, hóa học và các dữ liệu phổ cộng hưởng

từ hạt nhân 13C-NMR, 1H-NMR, phổ DEPT

2.2.1.4- Phương pháp nghiên cứu quy trình chiết xuất bán thành phẩm (bột Hypatin):

Thiết kế nghiên cứu phòng thí nghiệm:

Xác định hàm lượng flavonoid trong dược liệu ban tròn

Khảo sát các yếu tô ảnh hưởng đến hiệu suất và chất lượng sản phẩm:

Các điều kiện đã được khảo sát gồm:

- Dung môi chiết xuất: Ethanol 70%, 80% và nước

- Nhiệt độ chiết xuất: nhiệt độ phòng; nhiệt độ 80 - 950C (tùy theo dung môi)

- Tỷ lệ dược liệu/ dung môi: 1/10

- Thời gian chiết: ở nhiệt độ phòng: ngâm trong 48 giờ, lọc dịch chiết; ngâm tiếp 24 giờ x 3 lần Chiết ở 80-950C: Chiết hồi lưu trên cách thủy: 1,5 giờ x 3-4 lần

- Kích thước nguyên liệu: xay nhỏ qua rây 1 mm để chiết bằng ethanol; xay thô để chiết với nước

-Các dịch chiết nước được cô, dịch chiết cồn được thu hồi cồn đến cao lỏng, chiết tách flavonoid toàn phần từ cao lỏng bằng EtOAc, sau đó sấy trong tủ sấy chân không đến khô và cân

-Đánh giá phương pháp chiết xuất thông qua: Hiệu suất chiết flavonoid và hàm lượng flavonoid toàn phần trong chế phẩm

Áp dụng các điều kiện chiết xuất tối ưu đã chọn được cho quy trình chiết xuất phòng thí nghiệm để xây dựng quy trình chiết xuất quy mô pilot Thiết bị chiết xuất là máy chiết đa năng của hãng Tourner, lắp đặt tại khoa Công nghệ chiết xuất - VDL

*Dây chuyền thiết bị chiết xuất cao dược liệu ở quy mô pilot bao gồm:

1 Thiết bị chiết 2 vỏ 250lít gia nhiệt bằng hơi nước bão hòa

- Vật liệu chế tạo: Inox SUS 306

- Nước SX: Pháp

- Bơm dung môi 500w

2 Thiết bị cô áp suất giảm 2 vỏ 250lít gia nhiệt bằng hơi nước bão hòa

-Vật liệu chế tạo: Inox SUS 306

- Nước SX : Pháp

-Bơm chân không vòng nước 2,2kw

3 Thiết bị sấy áp suất giảm 2m3

- Vật liệu chế tạo: Inox SUS 306

- Nước SX: Pháp

-Bơm chân không vòng nước 2,2kw

4 Thùng lọc áp suất giảm 50lít

-Vật liệu chế tạo Inox SUS 304

*Mô tả qui trình chiết xuất:

-Dược liệu xay thô (1 -1,5cm) nhằm mục đích cho dung môi thấm nhanh, đều và sử dụng lượng dung môi tối thiểu, có thể tích rỗng nhỏ nâng cao công suất thiết bị chiết nhưng không bị quá nát trong khi chiết xuất, dễ dàng lọc dịch chiết

-Nạp dược liệu vào nồi chiết, sau khi đã nạp đủ dược liệu, đóng nắp kiểm tra độ kín của thiết bị

- Bơm dung môi chiết theo tỉ lệ 1 dược liệu : 10 dung môi

-Gia nhiệt đến nhiệt độ 85-900C Duy trì nhiệt độ trong suốt thời gian chiết

-Kết thúc quá trình chiết xuất dịch chiết được rút ra, lọc bằng thiết bị lọc chân không và chuyển vào thiết bị cô áp suất giảm

- Kiểm tra độ kín của nồi cô, rồi cho các thiết bị trao đổi nhiệt hoạt động, sau đó mở van cấp hơi từ từ, kiểm tra nhiệt độ ra của dung môi và điều chỉnh van cấp hơi,van chân không và van cấp tác nhân lạnh trung gian cho các thiết bị trao đổi nhiệt hoạt động thích hợp

- Dịch chiết được thu hồi áp suất giảm đến cao lỏng (1 : 1)

-Khóa van cấp hơi, mở chân không, mở van đáy thu hồi dịch chiết đặc (cao lỏng)

*Chiết tách và tinh chế flavonoid:

-Để nguội cao lỏng Lắc cao lỏng với Ethyl acetat trong thiết bị có cánh khuấy trong vòng

30 phút, để yên tách lớp 30 phút Rút lớp Ethyl acetat ra thùng có nắp Cho tiếp Ethyl acetat để lắc lần 2 Gộp 2 dịch Ethylacetat vào, cất chân không

-Cô chân không đến cạn còn 1L Tháo cao lỏng ethylacetat ra Tráng thiết bị bằng 0,5l nước Gộp vào đem sấy chân không đến khô

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu tác dụng dược lý và độc tính

2.2.2.1-Thử tác dụng bảo vệ gan:

-Nguyên liệu nghiên cứu

Các mẫu cao chiết xuất bằng n-hexan, cồn 80% và nước từ 10 vị thuốc, cao chiết bằng nước từ 2 bài thuốc và một số chế phẩm khác từ lá ban tròn (flavonoid toàn phần, astilbin, quercitrin) đã được thử tác dụng bảo vệ gan trên mô hình gây viêm gan cấp bằng CCl4

-Súc vật nghiên cứu

Chuột nhắt trắng đực (chủng Swiss albino, 5-6 tuần tuổi, trọng lượng trung bình 23 g ± 2 g) được cung cấp bởi Viện Pasteur Tp HCM và được để ổn định ít nhất 1 tuần trước khi thử nghiệm Thể tích cho uống hoặc tiêm phúc mô là 10 ml/kg thể trọng

-Phương pháp nghiên cứu

+ Thực nghiệm gây tổn thương gan chuột nhắt trắng bằng CCl4:

Các mẫu thử nghiệm được cho uống trong 8 ngày CCl4 được hòa trong dầu oliu và được tiêm phúc mô ở liều 1 g/kg một giờ sau khi uống mẫu thử nghiệm vào ngày thứ 1, thứ 3

và ngày thứ 5 của thực nghiệm Một giờ sau lần cho uống thứ 8, tiến hành lấy máu đuôI chuột, ly tâm trích huyết thanh và định lượng transaminase GPT và bilirubin tòan phần Các lô thử nghiệm được bố trí như sau:

- Lô 1: uống nước cất, không tiêm CCl4 (-) (lô chứng sinh học)

- Lô 2: uống nước cất và tiêm phúc mô tetraclorua carbon liều 1 g/kg (lô chứng bệnh lý)

- Lô 3: uống thuốc tham chiếu silymarin (liều 0,1 g/kg x 8 ngày) và tiêm phúc mô CCl4 liều 1 g/kg

- Các lô thử: uống mẫu cao thử (liều tương đương với 10 g dược liệu/kg thể trọng x

8 ngày) và tiêm phúc mô CCl4 liều 1 g/kg

+ Định lượng transaminase GPT (ALT) trong huyết thanh [65]

Nguyên tắc:

2-oxoglutarate + L-alanine ⇔ L-glutamate + pyruvate

pyruvate + NADH + H+ ⇔ L-lactate + NAD+

Tiến trình: Mẫu: Huyết thanh chuột

Đo đối chiếu với nước cất Bước sóng 340 nm (334-365 nm) Nhiệt độ 300C hoặc 370C

Thuốc thử: Bộ kit định lượng của Human Co (Germany), gồm:

R1: Tris buffer pH 7,5: 150 mmol/l

Sulphanilic acid + sodium nitrite → DSA (diazotised sulphanilic acid)

Bilirubin + DSA + accelerator (caffeine) → total azobilirubin

Tiến trình: Mẫu: Huyết thanh chuột

Đo đối chiếu với mẫu trắng Bước sóng 546 nm

Nhiệt độ 250C Thuốc thử: Bộ kit định lượng của Human Co (Germany), gồm:

TBR: Sulphanilic acid: 14 mmol/l

Hydrochloric acid: 300 mmol/l

Caffeine (accelerator): 200 mmol/l

Sodium benzoate: 420 mmol/l

TNR: Sodium nitrite: 390 mmol/l

2.2.2.2- Thử tác dụng chống viêm gan mạn

+ Nguyên vật liệu: Các chế phẩm flavonoid từ lá ban tròn, cao nước lá muồng trâu và cao

nước bài thuốc số 2

+ Động vật thí nghiệm: Chuột cống trắng, trọng lượng từ 80 - 100g, sử dụng cả chuột đực

và chuột cái, là những chuột khoẻ mạnh, đạt tiêu chuẩn thí nghiệm

+ Kit định lượng GOT; GPT; Bilirubin do hãng Human cung cấp

+ Các hoá chất:

- Dung dịch Tris 0.2M

- Dung dịch đệm tris (pH8.5): 12.5 mlTrrí 0.2M và 20ml HCL 0.1N

- Dung dịch Acid tricloracetic 30%

- Dung dịch Acid thiobarbituric 0.8%

-Máy định lượng sinh hoá bán tự động Scout

-Máy nghiền đồng thể IKA

-Máy quang kế UV- VIS - Spectrophotometer 1240 - Shimadzu

-Định lượng colagen trong gan theo phương pháp Neuman và Logan

-Định lượng MDA: theo phương pháp Yoshika và CS

-Mô tả phương pháp thí nghiệm:

Chuột thí nghiệm mua về được nuôi tại nhà chăn nuôi vài ngày trước khi thí nghiệm Chia chuột 1 cách ngẫu nhiên thành 4 lô thí nghiệm: 1 lô chứng sinh lý, 1 lô chứng gây xơ gan và 2 lô thử thuốc

+ Tháng thứ 1: gây xơ cho tất cả chuột thí nghiệm bằng cách tiêm tiêm phúc mạc, tiêm 2 lần/1 tuần với liều 0,2 ml dung dịch CCl4 30% trong dầu olive/100g chuột Lô chứng sinh

lý tiêm dung dịch dầu olive với liều 0,2ml dầu/100g chuột, cũng với 2 lần/1 tuần

+ Tháng thứ 2 và thứ 3: Các lô thí nghiệm vẫn tiêm như trên đồng thời bắt đầu cho các lô thử thuốc uống các chế phẩm thuốc thử; các lô chứng uống nước với cùng thể tích uống của các lô thử thuốc

+ Hết tháng thứ 3: Cắt động mạch cổ lấy máu định lượng các enzym GOT; GPT; Bilirubin trong huyết thanh và lấy gan định lượng MDA và colagen

2.2.2.3-Tác dụng lợi mật

+Nguyên vật liệu: Các chế phẩm flavonoid từ lá ban tròn, cao nước lá muồng trâu và cao

nước bài thuốc số 2

+Động vật thí nghiệm: Chuột nhắt trắng trưởng thành, khoẻ mạnh, đạt tiêu chuẩn thí

nghiệm, trọng lượng 22 - 25 g, do Viện vệ sinh dịch tễ cung cấp, sử dụng cả chuột đực và chuột cái

+ Ether gây mê

+ Kim, chỉ khâu vô trùng

+ Bộ đồ mổ vô trùng

+ Cân phân tích có độ chính xác 10-4

+Phương pháp: Áp dụng phương pháp của Rudi (1977) [63]

Phương pháp này dùng để xác định khối lượng mật sinh ra được giữ lại trong túi mật trong 1 thời gian nhất định Nếu lượng mật của lô thử thuốc lớn hơn lượng mật của lô đối chứng thì thuốc thử được đánh giá là có tác dụng tăng sinh mật

Mô tả phương pháp:

Chuột mới mua về, được nuôi tại nhà chăn nuôi 3 ngày trước khi thí nghiệm Chia chuột một cách ngẫu nhiên thành 4 lô: 1 lô đối chứng và 3 lô thử thuốc với 3 mẫu thử khác nhau Ngày thứ 1 và 2: Cho chuột lô thuốc uống thuốc với liều tương ứng và chuột lô chứng uống nước với thể tích tương đương lô thuốc

Ngày thứ 3: Cho chuột lô thuốc uống thuốc và chuột lô chứng uống nước Sau 30 phút uống, gây mê nhẹ cho từng chuột của các lô bằng ether Khi chuột đã mê, mổ bụng, thắt ống mật chủ để mật sinh ra không đổ vào tá tràng mà chỉ được giữ lại trong túi mật và khâu đóng vết mổ Sau 30 phút thắt ống mật chủ, giết chuột bằng cloroform, mổ bụng, bóc tách túi mật và cân tươi ngay từng túi mật sẽ được trọng lượng toàn túi m1 (mg), rạch túi mật thấm tất cả dịch mật trong túi mật trên giấy lọc, cân ngay lại vỏ túi mật m2 (mg) Khối lượng mật trong từng túi mật sẽ là m (mg) = m1 (mg) - m2 (mg)

Quy lượng mật cho 100 g trọng lượng chuột

So sánh khối lượng mật trung bình của lô chứng với lô thử thuốc Kết quả thí nghiệm được sử lý theo phương pháp thống kê dùng trong sinh học t - Studen Sử dụng phần mềm Microsoft - Excel [17]

2.2.2.4- Phương pháp thử tác dụng chống viêm mạn [42]

+ Nguyên vật liệu: Các chế phẩm flavonoid từ lá ban tròn, cao nước lá muồng trâu và cao

nước bài thuốc số 2

+ Thuốc tham chiếu: Viên prednisolon của Đức sản xuất, hàm lượng 5mg/viên, liều uống

trên chuột là 5mg/kg

+ Động vật thí nghiệm: Chuột cống trắng trưởng thành, khoẻ mạnh đạt tiêu chuẩn thí

nghiệm, trọng lượng 100 – 120 g, cả chuột đực và chuột cái

+ Ether gây mê, cloroform dược dụng

+ Amian tiệt trùng

+ Cân phân tích, độ chính xác 10-4

+ Dụng cụ mổ

+ Bơm tiêm đầu tù v.v

+ Phương pháp thí ghiệm: Áp dụng phương pháp của Flandre và cộng sự Gây ổ viêm

thực nghiệm bằng cách cấy hạt Amian đã tiệt trùng dưới da lưng của chuột

+Mô tả phương pháp thí nghiệm :

Chuột thí nghiệm được chia ngẫu nhiên thành 5 lô: 1 lô đối chứng; 1 lô tham chiếu và 3 lô thử thuốc với 3 mẫu thử khác nhau

Ngày thứ 1: Gây viêm cho tất cả chuột bằng cách gây mê nhẹ cho chuột bằng ether, khi chuột đã mê, cấy viên amian đã được vê tròn và chặt vào dưới da lưng chuột Mỗi viên có trọng lượng 30 mg và đã được sấy tiệt trùng ở 1200C/ 2 giờ Phẫu thuật được tiến hành trong điều kiện bán vô trùng Ngay sau khi gây viêm, chuột thí nghiệm được uống thuốc (các lô thử thuốc) và uống nước (lô chứng), đồng thời lô tham chiếu uống prednisolon, tất

cả chuột thí nghiệm được uống liền trong 5 ngày Chiều ngày thứ 5 làm chết chuột bằng Cloroform, bóc tách ổ viêm và cân từng ổ viêm khi còn tươi

So sánh trọng lượng trung bình ổ viêm giữa lô đối chứng và các lô thử thuốc Nếu thuốc

có tác dụng chống viêm mạn thì trọng lượng ổ viêm của các lô thử thuốc sẽ nhỏ hơn lô đối chứng gây viêm

2.2.3- Phương pháp thử độc tính:

2.2.3.1- Thử độc tính cấp và xác định LD 50 của chế phẩm flavonoid ban tròn

* Nguyên vật liệu thí nghiệm:

- Mẫu thử: Chế phẩm flavonoid ban tròn (Bột Hypatin)

- Động vật thí nghiệm: Chuột nhắt trắng có trọng lượng 20-22 g, đạt tiêu chuẩn thí nghiệm do Viện Vệ sinh dịch tễ cung cấp

* Phương pháp thí nghiệm:

-Phương pháp nghiên cứu: Thử theo hướng dẫn khảo sát độc tính cấp (ban hành kèm theo Quyết định 371 BYT/QĐ ngày 12/3/1996) của Bộ Y tế và các tài liệu về phương pháp thử độc tính cấp của thuốc [8, 16, 22]

-Tiến hành thí nghiệm:

Trước khi thí nghiệm, chuột đã được nhịn đói 12 giờ và được uống nước tuỳ thích

Đường dùng thuốc: Đường uống, cho chuột uống bằng cách dùng bơm tiêm có kim cong đầu tù để đưa thuốc thử một cách nhẹ nhàng vào dạ dày chuột

Chế phẩm flavonoid được pha trong nước với nồng độ thích hợp để có thể bơm trực tiếp vào dạ dày chuột