4. Kết quả xây dựng quy trình realtime PCR
4.2. Kết quả chạy multiplex realtime PCR với tỷ lệ mỗi primer/probe là 1:1:1:1:1
1:1:1:1:1
Sau khi khảo sát hoạt động của hệ primer và probe của fimA và 16S rRNA chúng tôi thấy các primer và probe hoạt động tốt nên tiếp tục chạy multiplex realtime PCR với tỷ lệ mỗi primer/probe là 1:1:1:1
Chứng dƣơng
Chúng tôi thực hiện trên 2 phản ứng: Phản ứng 1:
12.5µl Master mix
0,5 µl primer 16S rRNA (16SF và 16SR) 0,5µl 16SP
0,5µl primer fimA (fimAF, fimAR1 và fimAR2) 0,5µl fimAP (10pmol mỗi primer và probe) 5.0 µl DNA 5,5µl nƣớc cất 2 lần (đủ 25µl ). Phản ứng 2: 12.5µl Master mix 0,5 µl primer 16S rRNA (16SF và 16SP) 0,5µl fimAP
0,5µl primer fimA (fimAF, fimAR1 và fimAR2) 0,5µl fimAP (10pmol mỗi primer và probe) 5.0 µl nƣớc cất
5,5µl nƣớc cất 2 lần (đủ 25µl ).
Sau khi chạy real time PCR ta có kết quả:
Hình 26 : Kết quả chạy multiplex realtime PCR với tỷ lệ mỗi primer/probe là 1:1:1:1:1
16S rRNA fimA
Hệ primer và probe Chất phát huỳnh quang Ct 16S rRNA HEX 22,05 fimA FAM 22,05
Bảng 7: Kết quả chạy multiplex realtime PCR với tỷ lệ mỗi primer/probe là 1:1:1:1:1
Theo kết quả cho thấy cả 2 đƣờng nền của fimA và 16S đều cho tín hiệu trên đƣờng nền ở chu kỳ 22,05 < 31,5 (chu kỳ khi chạy đơn primer/probe). Nhƣ vậy phản ứng multiplex real time PCR với tỷ lệ primer/probe nhƣ trên cho kết quả tốt nên có thể sử dụng luôn tỷ lệ này trong các khảo sát tiếp theo mà không cần khảo sát tỷ lệ khác.
4.3. Kết quả khảo sát nhiệt độ lai tối ƣu
55oC – 65oC.
Ở đây chúng tôi thực hiện trên 9 phản ứng với: 8 phản ứng (phản ứng 1 tới phản ứng 8):
12.5µl Master mix
0,5 µl primer 16S rRNA (16SF và 16SR) 0,5µl 16SP
0,5µl primer fimA (fimAF, fimAR1 và fimAR2) 0,5µl fimAP (10pmol mỗi primer và probe) 5.0 µl DNA 5,5µl nƣớc cất 2 lần (đủ 25µl ). 1 chứng âm: 12.5µl Master mix 0,5 µl primer 16S rRNA (16SF và 16SR) 0,5µl 16SP
0,5µl primer fimA (fimAF, fimAR1 và fimAR2) 0,5µl fimAP (10pmol mỗi primer và probe) 5.0 µl nƣớc cất
5,5µl nƣớc cất 2 lần (đủ 25µl ).
Trong đó, các phản ứng từ 1-8 tƣơng ứng với khoảng nhiệt độ 55- 650C, mẫu chứng âm tƣơng ứng với nhiệt độ 550C.
Sau khi chạy phản ứng chúng tôi có kết quả sau:
Hình 27: Kết quả khảo sát nhiệt độ lai tối ưu của hệ primer và probe.
Phản ứng Ct Nhiệt độ(0 C) 1 26,2 65,0 2 26,2 64,0 3 25,8 63,0 4 26,1 61,0 5 24,9 60,0 6 25,4 57,0 7 27,6 56,0 8 25,9 55,0 (-) no Ct 55,0
Bảng 8: Kết quả khảo sát nhiệt độ lai tối ưu của hệ primer và probe.
Chúng tôi nhận thấy primer/ probe ở các mẫu cho kết quả dƣơng tính và máy có thể ghi nhận đƣợc tín hiệu huỳnh quang vƣợt quá tín hiệu nền, tuy nhiên tại nhiệt
Chứng dƣơng
độ 60 0C của mẫu E02 cho tín hiệu huỳnh quang sớm và mạnh nhất (Ct : 28,86). Do đó tại nhiệt độ 600C là nhiệt độ lai tối ƣu của hệ primer và probe.
Từ đó chúng tôi có chu trình nhiệt real time PCR: