4. Kết quả xây dựng quy trình realtime PCR
4.6. Kết quả ứng dụng quy trình trên mẫu bệnh phẩm
Với quy trình và các điều kiện tối ƣu đã khảo sát ở trên, chúng tôi tiến hành kiểm tra trên 30 mẫu bệnh phẩm và thu đƣợc kết quả nhƣ sau:
Mẫu Nơi lấy Ct
16S
Ct fimA
Kết luận
1 Bệnh viện RHM trung ƣơng 29,47 No Ct Mẫu tồn tại vi khuẩn P.giggivalis
nhƣng không có gene fimA.
2 Bệnh viện RHM trung ƣơng 24,47 25,19 Mẫu tồn tại cả 2 gene 16S rRNA và fimA của vi khuẩn P.gingivalis.
3 Bệnh viện RHM trung ƣơng 20,45 17,94 Mẫu tồn tại cả 2 gene 16S rRNA và fimA của vi khuẩn P.gingivalis.
4 Bệnh viện RHM trung ƣơng 21,66 19,53 Mẫu tồn tại cả 2 gene 16S rRNA và fimA của vi khuẩn P.gingivalis.
5 Bệnh viện RHM trung ƣơng 21,09 19,53 Mẫu tồn tại cả 2 gene 16S rRNA và fimA của vi khuẩn P.gingivalis.
6 Bệnh viện RHM trung ƣơng 29,49 36,38 Mẫu tồn tại cả 2 gene 16S rRNA và fimA của vi khuẩn P.gingivalis.
7 Bệnh viện RHM trung ƣơng 27,65 No Ct Mẫu tồn tại vi khuẩn P.giggivalis
nhƣng không có gene fimA.
8 Bệnh viện RHM trung ƣơng 25,29 No Ct Mẫu tồn tại vi khuẩn P.giggivalis
nhƣng không có gene fimA.
9 Bệnh viện RHM trung ƣơng 28,71 27,62 Mẫu tồn tại cả 2 gene 16S rRNA và fimA của vi khuẩn P.gingivalis.
10 Bệnh viện RHM trung ƣơng 21,73 18,77 Mẫu tồn tại cả 2 gene 16S rRNA và fimA của vi khuẩn P.gingivalis.
11 Bệnh viện RHM trung ƣơng 21,01 18,91 Mẫu tồn tại cả 2 gene 16S rRNA và fimA của vi khuẩn P.gingivalis.
12 ĐH Y Dƣợc TP.HCM 30,51 29,21 Mẫu tồn tại cả 2 gene 16S rRNA và fimA của vi khuẩn P.gingivalis.
13 Bệnh viện RHM trung ƣơng 23,98 21,83 Mẫu tồn tại cả 2 gene 16S rRNA và fimA của vi khuẩn P.gingivalis.
14 Bệnh viện RHM trung ƣơng 21,91 29,48 Mẫu tồn tại cả 2 gene 16S rRNA và fimA của vi khuẩn P.gingivalis.
15 Bệnh viện RHM trung ƣơng 27,67 26,34 Mẫu tồn tại cả 2 gene 16S rRNA và fimA của vi khuẩn P.gingivalis.
16 Bệnh viện RHM trung ƣơng No Ct No Ct Mẫu bệnh phẩm không có P.gingivalis và fimA.
17 Bệnh viện RHM trung ƣơng 25,51 24,21 Mẫu tồn tại cả 2 gene 16S rRNA và fimA của vi khuẩn P.gingivalis.
18 Bệnh viện RHM trung ƣơng 21,76 No Ct Mẫu tồn tại vi khuẩn P.giggivalis
nhƣng không có gene fimA.
19 Bệnh viện RHM trung ƣơng 23,45 22,25 Mẫu tồn tại cả 2 gene 16S rRNA và fimA của vi khuẩn P.gingivalis.
20 Bệnh viện RHM trung ƣơng 37,47 25,77 Mẫu tồn tại cả 2 gene 16S rRNA và fimA của vi khuẩn P.gingivalis.
21 Bệnh viện RHM trung ƣơng No Ct No Ct Mẫu bệnh phẩm không có
P.gingivalis và fimA.
22 Bệnh viện RHM trung ƣơng No Ct No Ct Mẫu bệnh phẩm không có
P.gingivalis và fimA.
23 Bệnh viện RHM trung ƣơng No Ct No Ct Mẫu bệnh phẩm không có
P.gingivalis và fimA.
24 Bệnh viện RHM trung ƣơng No Ct No Ct Mẫu bệnh phẩm không có
P.gingivalis và fimA.
25 Bệnh viện RHM trung ƣơng No Ct 31,18 Mẫu bệnh phẩm không có vi khuẩn
P.gingivalis nhƣng có gene fimA. 26 Bệnh viện RHM trung ƣơng 28,45 31,21 Mẫu tồn tại cả 2 gene 16S rRNA và
fimA của vi khuẩn P.gingivalis.
27 Bệnh viện RHM trung ƣơng 27,13 25,57 Mẫu tồn tại cả 2 gene 16S rRNA và fimA của vi khuẩn P.gingivalis.
28 Bệnh viện RHM trung ƣơng No Ct No Ct Mẫu bệnh phẩm không có
P.gingivalis và fimA.
29 Bệnh viện RHM trung ƣơng No Ct No Ct Mẫu bệnh phẩm không có
P.gingivalis và fimA.
30 Bệnh viện RHM trung ƣơng No Ct 36,62 Mẫu bệnh phẩm không có vi khuẩn
P.gingivalis nhƣng có gene fimA. (+) Mẫu chứng dƣơng 25,74 22,26 Mẫu tồn tại cả 2 gene 16S rRNA và
fimA của vi khuẩn P.gingivalis.
(-) Nƣớc cất No Ct No Ct Mẫu không có tín hiệu nên quy trình không có sự ngoại nhiễm.
Bảng13: Kết quả phát hiện gene fimA và 16S rRNA các mẫu bệnh phẩm viêm nha chu của Porphyromonas gingivalis.
Vậy sau khi chạy multiplex real time PCR trên 30 mẫu bệnh phẩm chúng tôi thấy có 18 mẫu cho kết quả dƣơng tính với primer và probe của fimA và 16S rRNA.
4 mẫu cho kết quả dƣơng tính với primer và probe của gene 16S rRNA
P.gingivalis nhƣng cho kết quả âm tính với primer và probe của gene fimA. Một số chủng Porphyromonas gingivalis không có gene fimA nên khi khảo sát mẫu bệnh phẩm cho ta kết quả dƣơng tính với primer, probe 16S rRNA và cho kết quả âm tính với primer, probe fimA.
2 mẫu cho kết quả dƣơng tính với primer, probe fimA nhƣng cho kết quả âm tính với primer, probe của gene 16S rRNA. Do trong miệng tồn tại một số loại vi khuẩn có gene fimA nhƣng không phải P.gingivalis (P. gulae ) nên khi khảo sát mẫu bệnh có các loại vi khuẩn này sẽ cho kết quả dƣơng tính với primer, probe fimA và cho kết quả âm tính với primer, probe 16S rRNA.
6 mẫu cho kết quả âm tính với cả primer và probe của gene 16S rRNA và fimA. Nhƣ vậy, bệnh nhân bị mắc bệnh viêm nha chu có thể do các loại vi khuẩn khác gây nên nhƣ Actinobacillus actinomycetemcomitan và một số loại vi khuẩn khác.
Nhƣ vậy, trong tổng số 30 mẫu khảo sát có 18 mẫu có vi khuẩn P.gingivalis
và gene fimA, đạt tỷ lệ 60%. Do không có điều kiện, lƣợng mẫu khảo sát chỉ dừng lại ở 30 mẫu nên độ tin cậy chƣa cao.
Kết quả chạy multiplex real time PCR trên 30 mẫu:
Hình 32: Kết quả real time PCR mẫu 1-6, với primer/probe của 16S rRNA.
Hình 34: Kết quả real time PCR mẫu 7-12, với primer/probe của 16S rRNA.
Hình 36: Kết quả real time PCR mẫu 13-18, với primer/probe của 16S rRNA.
Hình 38: Kết quả real time PCR mẫu 19-24, với primer/probe của 16S rRNA.
Hình 40: Kết quả real time PCR mẫu 25-30, với primer/probe của 16S rRNA.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 1. KẾT LUẬN
Trong thời gian thực hiện đề tài, chúng tôi đã cơ bản hoàn thành xong quy trình Phát hiện nhân tố gây bệnh (gene fimA) của vi khuẩn P.gingivalis bằng phƣơng pháp real time PCR với độ nhạy là 102 copies/ml. Qui trình cũng đã đƣợc ứng dụng để khảo sát trên 30 mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân viêm nha chu và đã cho kết quả tốt.