Xác định gen mã hóa các loại độc tố của vi khuẩn clostridium perfringens bằng phản ứng multiplex PCR

i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành Đồ án này Trước hết tôi xin gửi tới Ban Giám Hiệu Trường Đại học Nha Trang, Ban Giám đốc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường, Phòng Đào tạo Đại học và Sau đại học niềm kính trọng, sự tự hào được học tập tại trường trong những năm qua. Sự biết ơn sâu sắc nhất tôi xin được giành cho thầy: TS. Vũ Ngọc Bội - Phó Giám đốc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường - Trường Đại học Nha Trang, TS. Lê Lập - Trưởng Bộ môn Nghiên cứu Vi Trùng - Phân Viện Thú y Miền Trung đã tận tình hướng dẫn và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện đồ án tốt nghiệp này. Xin cám ơn: PGS. TS. Ngô Đăng Nghĩa - Giám đốc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường, ThS. Khúc Thị An - Quyền Trưởng Bộ môn Công nghệ Sinh học và các thầy cô phản biện đã cho tôi những lời khuyên quí báu để công trình nghiên cứu được hoàn thành có chất lượng. Đặc biệt xin được ghi nhớ tình cảm, sự giúp đỡ của: các thầy cô giáo trong Bộ môn Công nghệ Sinh học - Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường - Trường Đại học Nha Trang, Ban lãnh đạo Phân viện Thú y miền Trung, các cán bộ - Bộ môn Nghiên cứu Vi Trùng và tập thể cán bộ công nhân viên - Phân viện Thú y miền Trung đã giúp đỡ nhiệt tình và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian tôi thực hiện đồ án này. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, người thân và các bạn bè đã tạo điều kiện, động viên khích lệ để tôi vượt qua mọi khó khăn trong quá trình học tập vừa qua. ii MỤC LỤC Lời cảm ơn Mục lục Danh mục các bảng Danh mục các hình ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1.1. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 4 1.1.1. Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài 4 1.1.2. Tình hình nghiên cứu trong nước 6 1.2. Đặc tính của vi khuẩn C.perfringens 7 1.2.1. Đặt điểm hình thái và tính bắt màu 8 1.2.2. Đặt tính nuôi cấy 8 1.2.3. Đặt tính sinh vật, hóa học 9 1.2.4. Đặt tính di truyền 10 1.3. Các loại độc tố của vi khuẩn C.perfringens 11 1.3.1. Alpha toxin (CPA) 11 1.3.2. Beta toxin (CPB) 12 1.3.3. Epsilon toxin (ETX) 12 1.3.4. Iota toxin (CPI) 13 1.3.5. Enterotoxin (CPE) 13 1.3.6. Delta toxin 13 1.3.7. Theta toxin 13 1.4. Các type độc tố của vi khuẩn C.perfringens và khả năng gây bệnh 14 1.4.1 Type A 15 1.4.2. Type B 15 1.4.3. Type C 16 1.4.4. Type D 17 1.4.5. Type E 17 1.5. Phản ứng PCR 18 1.5.1. Nguyên tắc thực hiện 18 iii 1.5.2. Các thành phần cơ bản tham gia phản ứng PCR 19 1.5.3. Các bước tiến hành 21 1.5.4. Phân tích kết quả 22 1.5.5. Các yếu tố ảnh hưởng 23 1.5.6. Phản ứng Multiplex PCR 26 1.5.7. Những lợi ích của phản ứng PCR 26 1.5.8. Các loại PCR 27 1.5.9. Giải pháp tối ưu hóa PCR 28 CHƯƠNG II. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU 30 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 2.2.1. Kiểm tra đặt tính sinh học, hóa học 30 2.2.2. Xác định gen mã hóa độc tố bằng phản ứng Multiplex PCR 32 2.2.3. Phương pháp thử độc lực 35 2.3. TRANG THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ THÍ NGHIỆM 37 2.4. ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 37 2.5. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 37 PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38 3.1. GIÁM ĐỊNH CÁC ĐẶC TÍNH SINH VẬT, HÓA HỌC CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN CLOSTRIDIUM PERFRINGENS 38 3.2. Xác định gen mã hóa các loại độc tố bằng phản ứng Multiplex PCR 42 3.2.1. Xác định type độc tố 42 3.2.2. Kiểm tra gen mã hóa độc tố đương ruột và beta2 44 3.3. XÁC ĐỊNH ĐỘC LỰC TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG 46 3.3.1. Độc lực của canh khuẩn trên chuột nhắt trắng 46 3.3.2. Độc lực của độc tố trên chuột nhắt trắng 47 3.4. Xác định MLD của độc tố vi khuẩn 48 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 50 1. KẾT LUẬN 50 2. ĐỀ NGHỊ 50 PHỤ LỤC iv DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1: Vị trí gen mã hóa các loại độc tố của vi khuẩn C. perfringens 11 Bảng 2.2 : Các type vi khuẩn C. perfringens và độc tố chính 14 Bảng 2.3: Các bệnh gây ra bởi các type độc tố của vi khuẩn C. perfringens 14 Bảng 2.1: Trình tự các mồi (primer) được sử dụng trong Mutiplex – PCR 33 Bảng 2.2: Các thành phần của phản ứng Multiplex – PCR 34 Bảng 2.3: Chu trình nhiệt trong phản ứng Multiplex –PCR 35 Bảng 3.1: Kết quả kiểm tra đặc tính sinh học, hóa học 39 Bảng 3.2: Kết quả xác định type loại độc tố của vi khuẩn C. perfringens 43 Bảng 3.3: Kết quả xác định gen mã hóa độc tố Beta2 toxin và Enterotoxin 44 Bảng 3.5: Kết quả kiểm tra độc lực bằng phương pháp tiêm độc tố type A 47 Bảng 3.6: Kết quả kiểm tra độc lực bằng phương pháp tiêm độc tố type D 47 Bảng 3.7: Kết quả xác định MLD của độc tố trên chuột 48 v DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 2.1. Vi khuẩn C. perfringens 7 Hình 2.2. Hiện tượng dung huyết beta 8 Hình 2.3. Phản ứng PCR 17 Hình 2.4. Chu trình nhiệt PCR 18 Hình 3.1. Phương pháp tiêm canh khuẩn vào xoang phúc mạc 34 Hình 3.2. Phương pháp tiêm độc tố vào tĩnh mạch đuôi chuột 35 Hình 4.1.Hình thái vi khuẩn, trực khuẩn Gram dương 38 Hình 4.2. Hình thái vi khuẩn, phương pháp soi tươi 38 Hình 4.3. Dung huyết beta trên môi trường thác máu 39 Hình 4.4. Hình thái khuẩn lạc trên môi trường SPS 39 Hình 4.5. Trên môi trường Egg yolk 39 Hình 4.6. Trên Litmus 39 Hình 4.7. Môi trường đường chưa nuôi cấy 39 Hình 4.8. Manitol - , Glucose + , Lactose + , Maltose + , Sucrose + 39 Hình 4.9. Phản ứng CAMP 40 Hình 4.10. Phản ứng O-F 40 Hình 4.11.Kết quả xác định gen mã hóa các loại độc tố bắng phản ứng multiplex PCR … 43 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Trong những năm qua, nhờ chính sách đầu tư phát triển Nông nghiệp, xóa đói giảm nghèo của Chính phủ đã thúc đẩy nghề chăn nuôi nói chung và chăn nuôi dê, cừu nói riêng phát triển mạnh mẽ cả về số lượng và chất lượng. Tổng đàn dê, cừu cả nước tăng từ 572.448 con năm 2001 lên đến 1.777.600 con năm 2007, trong đó 3 tỉnh duyên hải Nam Trung bộ (Khánh Hòa, Ninh Thuận, Bình Thuận) chiếm 15,87% (khoảng 282.125 con). Tuy nhiên, việc thực hiện các quy trình kỹ thuật như quản lý giống, chuồng trại, thú y, chăm sóc nuôi dưỡng của các địa phương còn nhiều hạn chế, trình độ kỹ thuật và quản lý còn yếu kém. Bên cạnh đó việc nghiên cứu về thức ăn, chăm sóc nuôi dưỡng, phòng trị bệnh tật cho động vật nuôi cũng chưa tương xứng với nhu cầu và tốc độ tăng trưởng của nghề chăn nuôi dê, cừu. Dịch bệnh gia súc là một trong những nguyên nhân hạn chế sự phát triển của chăn nuôi. Vì vậy, trong thời gian tới ngành Nông nghiệp đã xác định nhiệm vụ trước hết là khống chế các bệnh truyền nhiễm nguy hiểm, sau đó từng bước khống chế các bệnh truyền nhiễm mãn tính, các bệnh do ký sinh trùng, các bệnh nội khoa, Một số bệnh thường gặp ở dê, cừu như bệnh tụ huyết trùng, bệnh đậu, bệnh viêm lở miệng,… trong đó, bệnh viêm ruột tiêu chảy do vi khuẩn Clostridium perfringens gây ra đã làm tổn thất lớn cho người chăn nuôi. Vi khuẩn C.perfringens phân bố rộng rãi trong thiên nhiên, thường thấy ở trong đất, chất hữu cơ. Vi khuẩn C.perfringens thường có mặt trong dạ cỏ và ruột của dê, cừu khỏe mạnh, bình thường chúng không gây bệnh nhưng do một số yếu tố tiền đề như: thay đổi khẩu phần ăn đột ngột, stress vận chuyển, sức đề kháng giảm tạo điều kiện cho vi khuẩn sinh sôi, phát triển và sinh độc tố gây bệnh. Các độc tố của vi khuẩn được giải phóng ra rất nhanh và được hấp thu vào máu, khi đó thì các triệu chứng của bệnh sẽ xuất hiện như: tiêu chảy, phân có lẫn máu và niêm mạc, đặc biệt có mùi thối khắm, co giật toàn thân, nghiến răng, chảy nước giải và chết sau vài giờ. Trong quá trình sinh trưởng, vi khuẩn C.perfringens sản sinh hơn 17 loại độc tố khác nhau như: độc tố Alpha (α), Beta (β), Epsilon (ε), Iota (i), Beta2, 2 Enterotoxin, Theta, vv…. Dựa vào khả năng sản sinh 4 loại độc tố chính (alpha, beta, epsilon, iota) người ta phân chia vi khuẩn C.perfringens thành 5 type độc tố (toxinotype) khác nhau (A, B, C, D, E). Trong đó type A sản sinh độc tố Alpha; type B sản sinh độc tố Alpha, Beta, Epsilon; type C sản sinh độc tố Alpha, Beta; type D sản sinh độc tố Alpha, Epsilon; và type E sản sinh độc tố Alpha và Iota. Trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu về vai trò của C.perfringens gây bệnh đường tiêu hóa ở gia súc như bệnh viêm ruột họai tử, viêm dạ múi khế ở loài nhai lại, hội chứng tiêu chảy ở bò, dê, lợn (Mainil và cộng sự, 2006). Ở Việt Nam cũng đã có một số công trình nghiên cứu về vai trò gây bệnh của vi khuẩn C.perfringens (Nguyễn Ngọc Nhiên và cộng sự, 1995; Nguyễn Bá Hiên và cộng sự, 1999; Nguyễn Văn Sửu và cộng sự, 2003; Lê Lập và cộng sự, 2007). Tuy nhiên, hiện chưa có công trình nghiên cứu về vai trò của vi khuẩn C.perfringens trong bệnh viêm ruột tiêu chảy ở dê, cừu nuôi tại khu vực miền Trung một cách đầy đủ và hệ thống. Có nhiều phương pháp phát hiện độc tố của vi khuẩn C.perfringens như phản ứng trung hòa độc tố trên chuột, phản ứng ELISA, PCR. Trước đây phản ứng trung hòa độc tố trên chuột thường được sử dụng phổ biến, tuy nhiên phương pháp này cồng kềnh, tốn tiền, mất nhiều thời gian. Hiện nay phương pháp PCR được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu, đặc biệt để phát hiện các gen quy định các yếu tố gây bệnh của các loài vi sinh vật. Ưu điểm của phản ứng là có độ nhạy, độ đặc hiệu cao, tiết kiệm thời gian, có thể thực hiện với số lượng mẫu lớn và cho kết quả trong một thời gian ngắn. Vì thế, chúng tôi đặc vấn đề nghiên cứu: “Xác định gen mã hóa các loại độc tố của vi khuẩn Clostridium perfringens bằng phản ứng Multiplex PCR”. Mục đích của đề tài: góp phần cung cấp thông tin về chủng C.perfringens đang tồn tại và gây bệnh viêm ruột tiêu chảy ở dê, cừu trong những năm gần đây, giúp đề xuất biện pháp phòng trị bệnh có hiệu quả để giảm thiểu tối đa những thiệt hại do vi khuẩn C.perfringens gây ra. 3 Nội dung của đề tài: 1) Giám định các đặc tính sinh vật, hóa học của các chủng vi khuẩn Clostridium perfringens được phân lập từ dê, cừu mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy tại 3 tỉnh Khánh Hòa, Ninh Thuận và Bình Thuận; 2) Xác định gen mã hóa các loại độc tố bằng phản ứng Multiplex PCR; 3) Đánh giá độc lực của các chủng vi khuẩn C. perfringens đã phân lập. Do thời gian nghiên cứu có hạn nên báo cáo không thể tránh được các hạn chế. Em rất mong nhận được các ý kiến góp ý của những ai quan tâm đến vấn đề này, để cho báo cáo thêm hoàn thiện. Em xin chân thành cám ơn. 4 CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 1.1.1. Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài Dựa trên phản ứng trung hòa trên chuột, Wilsdon (1931) đã phân C.perfringens thành 4 type độc tố: từ type A đến D. Wilsdon nhận thấy kháng huyết thanh của type A chỉ trung hòa được type A, type B trung hòa được tất cả các type còn lại, type C trung hòa được tất cả ngoại trừ type D, type D trung hòa được cả type A và B. Ông nhận thấy rằng các kháng thể có trong huyết thanh làm mất tác dụng của tất cả các loại kháng nguyên. Các kháng nguyên sau này được mô tả: alpha có ở tất cả các type, beta có ở type B và C, epsilon có ở type B và D. Bosworth (1943) đã phát hiện thêm type E, type này chỉ trung hòa được chính nó và type A. Ông cho rằng có một độc tố chưa được phát hiện, sau này mô tả là độc tố iota [18]. Uzal và cộng sự (1997) đã sử dụng kỹ thuật PCR với các cặp mồi: alpha (Titbal et al 1989), beta (Hunter, 1992), epsilon (Havard, 1992), iota (Perelle 1993). Theo ông thì các gen độc tố có kích thước như sau: alpha: 247 bp; beta 1025 bp; epsilon: 403 bp; iota: 298 bp. Kết quả này gen độc tố: alpha: 242 bp; beta: 980 bp; epsilon: 404 bp [43]. Han Sang Yoo và cộng sự (1997) đã sử dụng kỹ thuật Multiplex PCR để định type độc tố của vi khuẩn C.perfringens trên các đối tượng trâu, bò, lợn và gia cầm ở Hàn Quốc. Kết quả thu được đoạn khuếch đại gen có kích thước như sau: Độc tố alpha: 402 bp; beta: 236 bp; epsilon: 541 bp; iota: 317 bp [27]. Petrillo và cộng sự (2000) đã sử dụng kỹ thuật Multiplex PCR để xét nghiệm các mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân nam 12 tuổi sau khi ăn ruột lợn bị nhiễm C.perfringens. Kết quả cho thấy kích thước của các gen mã hóa loại độc tố được khuếch đại như sau: alpha: 324 bp, beta:196 bp và epsilon: 655 bp (epsilon primers), iota: 446 bp (iota primers), cpb2: 567 bp (beta 2 primers) [42]. Augustynowicz và cộng sự (2002) đã thực hiện phản ứng PCR với việc dùng cặp mồi PL3/PL7 cho đoạn pcl (gen mã hóa cho C.perfringens phospholipase C) và 5 cặp mồi PL145/PL146 cho cpe (mã hóa cho C.perfringens Enterotoxin). Kết quả thu được 70% mẫu lấy từ các ca ngộ độc thực phẩm là type A, 66% mẫu có mang gene cpe. Trong tổng số 63 mẫu đem phân tích có 21 mẫu (33%) pcl+, cpe-, CPE - ; 26 mẫu (41%) pcl+, cpe+, CPE+; 16 mẫu (25%) pcl+, cpe+, CPE Chỉ có C.perfringens type A mới mang gene cpe [24]. Bueschel D. M. và cộng sự (2002) đã xác định tỷ lệ gene cpb2 tìm thấy ở các type vi khuẩn C. perfringens bằng việc cải tiến kỹ thuật Multiplex PCR (Meer và Songer, 1996) bằng việc kết hợp thêm cặp mồi đặc hiệu cpb2 (Garmory và cộng sự năm 2000) vào trong phản ứng. Tác giả đã sử dụng 3270 chủng C.perfringens phân lập được từ động vật mắc bệnh viêm ruột và động vật khỏe. Kết quả cho thấy: Phần lớn các trường hợp động vật bị bệnh đều định được type vi khuẩn (85,5%), trong đó chủ yếu là type A chiếm 92,4%. Tỷ lệ cpb2 xác định được 37,2% trong tổng số mẫu phân lập. Tỷ lệ cpb2 tìm thấy có sự khác nhau giữa các loài. Ở lợn bị bệnh viêm ruột tỷ lệ dương tính với cpb2 là 85,8% (n = 1132), có sự tương quan giữa lợn sơ sinh mắc bệnh viêm ruột hoặc tiêu chảy với tỷ lệ cpb2 (91,8% với n = 256) và phần lớn là type A, do đó type A là nguyên nhân chính gây bệnh ở lợn sơ sinh. Tỷ lệ cpb2 tìm thấy ở bò là 12,8%(n = 1537), trong đó bò bị bệnh viêm ruột, nhiễm độc máu, đột tử là 21,4% (n = 336), và ở bê bị viêm ruột và dạ múi khế là 47,3% (n = 93 ). Tỷ lệ cpb2 ở dê là 11,7% (n = 34), cừu là 19,2% (n = 52) [19]. Sipos và cộng sự (2003) đã sử dụng kỹ thuật Mutiplex PCR định type độc tố vi khuẩn C.perfringens trên các loại động vật khác nhau. Kết quả: Ở cừu: 8/10 chủng thuộc type A và 2/10 chủng thuộc type D (chủ yếu tìm được ở cừu non dưới 3 tuần tuổi). Ở lợn: 47/52 chủng thuộc type A (chủ yếu ở lợn con theo mẹ), 5/52 chủng thuộc type C. Còn ở dê: 18/26 mẫu thuộc type D, 6/26 mẫu thuộc type A và 2/26 mẫu thuộc type E [38]. Wen và cộng sự (2004) đã nghiên cứu và thấy rằng nguyên nhân gây ngộ độc do vi khuẩn C.perfringens chủ yếu là do type A sản sinh độc tố Enterotoxin. Gene mã hóa độc tố này nằm trên nhiễm sắc thể. Nha bào của những chủng này đều có khả năng chịu được nhiệt độ cao [35]. [...]... cộng gộp với nhau mà có sự tác động riêng rẽ Các nghiên cứu cũng cho thấy rằng độc tố alpha là loại độc tố được tất cả các type vi khuẩn C .perfringens sản sinh ra Gene mã hóa các loại độc tố ở vi khuẩn này không chỉ nằm trên nhiễm sắc thể mà còn có trên plasmid 11 Bảng 1.1 Vị trí gen mã hóa các loại độc tố của vi khuẩn C .perfringens Độc tố Gen Vị trí của gen Alpha Cpa Nhiễm sắc thể Beta Cpb Plasmid... sắc thể/ Plasmid 1.3 Các loại độc tố của vi khuẩn C .perfringens 1.3.1 Alpha toxin (CPA) Tất cả các type của vi khuẩn C .perfringens đều có khả năng sản sinh độc tố này Gene mã hóa cho độc tố alpha là cpa Cpa nằm trên nhiễm sắc thể của vi khuẩn Trọng lượng phân tử của gen khoảng 43kDa, gồm 1.197 nucleotid mã hóa cho 399 axit amin Hàm lượng G + C thấp, chỉ khoảng 34% tổng Nu trong bộ gen cpa Điểm đẳng điện... oxi Gene mã hóa của Theta nằm trên nhiễm sắc thể của vi khuẩn [39] Thời gian gần đây nhiều tác giả còn đề cập đến beta 2 toxin (Beta2) 14 Gen mã hóa độc tố Beta2 nằm trên plasmid Độc tố thường gây triệu chứng tiêu chảy có liên quan đến kháng sinh và tiêu chảy tự nhiên 1.4 Các type độc tố của vi khuẩn C .perfringens và khả năng gây bệnh C .perfringens sản sinh ra hơn 17 loại độc tố khác nhau Dựa vào 4 loại. .. thấy các chủng vi khuẩn phân lập mang đầy đủ các đặc tính sinh học của loài, có độc tố gây chết chuột Kết quả định typ bằng kỹ thuật multiplex PCR cho thấy: các chủng C .perfringens phân lập từ bò thuộc typ A (48,1%) và typ D (51,9%); các chủng phân lập từ lợn thuộc typ A, mang độc tố ruột (37,8%) và độc tố beta2 (18,9%) [2] 1.2 Đặc tính của vi khuẩn C .perfringens Feser (1865) lần đầu tiên phát hiện C .perfringens, ... loài vi khuẩn có khả năng dung huyết khác đã được phân loại trước đó, do giữa chúng có sự tương đồng với nhau Hai type có gene qui định protein liên kết với fibronectin được xác định là tương tự gene của Listeria monocytogenes và Bacillus subtilis Từ đó cho thấy các tác nhân gây độc có mối liên quan đến nhau [16] Vi c xác định trình tự bộ gene của vi khuẩn C .perfringens cho thấy các gene gây độc không... C .perfringens với hệ gene của những loài vi khuẩn không có khả năng gây bệnh như C.acetabutylicum thì ta thấy rằng sự khác biệt chính giữa hai bộ gene của hai loài này chủ yếu là do những gene có khả năng sinh độc tố của C .perfringens [16] Ngoài những gene đã biết, Shimuzu cũng tìm thấy nhiều gene gây độc khác có trong hệ gene của C .perfringens 5 gene có khả năng gây dung huyết được xác định dựa vào các. .. Thiết bị cần đáp ứng yêu cầu thay đổi được nhiệt độ nhanh và chính xác Tránh tối đa sự bốc hơi nước trong quá trình phản ứng Tuy nhiên, ứng với mỗi phản ứng cụ thể có các thiết bị và dụng cu khuyếch đại riêng 26 1.5.6 Phản ứng Multiplex PCR Phản ứng multiplex PCR là một dạng cải tiến của phản ứng PCR thông thường Là PCR sử dụng nhiều cặp mồi đặc hiệu cho các đoạn DNA đích đặc hiệu từ nhiều vi sinh vật... vi khuẩn phân lập được có khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường thạch máu cừu (trơn, nhẵn, xám, lồi) với hai vòng dung huyết Soi trên kính hiển vi điện tử chúng là các trực khuẩn Gram dương và không di động Xác định type độc tố vi khuẩn phân lập được bằng kỹ thuật Multiplex – PCR với 4 cặp mồi đặc hiệu cho 4 gene quy định sản sinh độc tố alpha, beta, epsilon, iota của vi khuẩn Kết quả là type A với độc. .. 7,1 Độc tố Delta là chất gây nên hiện tượng tiêu máu ở cừu, dê, và heo Tuy nhiên, độc tố này lại bị ức chế bởi các hạch bào có ở người, ngựa, chuột và các loại động vật có vú khác [22] 1.3.7 Theta toxin Được tạo ra bởi tất cả các type của vi khuẩn C .perfringens Là yếu tố tạo nên một trong hai vòng dung huyết của khuẩn lạc vi khuẩn C .perfringens, khi nuôi cấy chúng trên môi trường thạch máu Độc tố này... Type D và không phát hiện gene mã hóa độc tố enterotoxin từ các chủng phân lập được Từ kết quả đó cho thấy độc tố enterotoxin của C .perfringens không đóng vai trò quan trọng trong vi c gây bệnh vi m ruột hoại tử trên cừu [30] Effat và cộng sự (2007) đã phân lập được vi khuẩn C .perfringens từ các mẫu gà bị bệnh tại các trang trại gà ở Cario - Ai Cập tại các trang gà bị bệnh vi m ruột hoại tử Kết quả . GIÁM ĐỊNH CÁC ĐẶC TÍNH SINH VẬT, HÓA HỌC CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN CLOSTRIDIUM PERFRINGENS 38 3.2. Xác định gen mã hóa các loại độc tố bằng phản ứng Multiplex PCR 42 3.2.1. Xác định type độc tố. nghiên cứu: Xác định gen mã hóa các loại độc tố của vi khuẩn Clostridium perfringens bằng phản ứng Multiplex PCR . Mục đích của đề tài: góp phần cung cấp thông tin về chủng C .perfringens đang. Plasmid 1.3. Các loại độc tố của vi khuẩn C .perfringens 1.3.1. Alpha toxin (CPA) Tất cả các type của vi khuẩn C .perfringens đều có khả năng sản sinh độc tố này. Gene mã hóa cho độc tố alpha là