Do PCR rất nhạy, nên phải tránh ô nhiễm các DNA khác có trong phòng thí nghiệm (vi khuẩn, virus, DNA, ...). Vì vậy các mẫu DNA, hỗn hợp phản ứng và quy trình DNA, ngoài ra còn có phản ứng phân tích sản phẩm, nên được thực hiện trong một khu vực riêng biệt. Ở giai đoạn chuẩn bị hỗn hợp phản ứng, phải chuẩn bị phòng riêng biệt với đèn UV. Phải sử dụng găng tay sạch cho mỗi bước PCR cũng như thay thế các pipet. Thuốc thử dùng trong PCR phải được chuẩn bị riêng biệt và chỉ được dùng cho mục đích này. Các mẫu phải được giữ riêng biệt với các mẫu DNA khác. Phản ứng có kiểm soát (kiểm soát bên trong), ngoại trừ DNA khuôn mẫu, phải luôn được thực hiện, để kiểm tra sự nhiễm bẩn.
* Không có sản phẩm hoặc lượng thấp
- Lặp lại thí nghiệm đề phòng lỗi thao tác.
- Sử dụng ống dNTP mới, có chất lượng đảm bảo.
- Tăng lượng DNA template, điện di kiểm tra lại nồng độ DNA template.
- Tinh sạch DNA template bằng chiết phenol, tủa cồn hoặc kit tinh sạch hoặc thôi gel. Nếu có thể cần tiến hành tách chiết mới DNA template bằng các phương pháp tách chiết khác nhau.
- Tăng thời gian kéo dài đối với các sản phẩm PCR trên 0,5 kb. - Tăng số chu kỳ PCR lên 35, 40.
- Hạ thấp nhiệt độ bắt mồi xuống 1 đến 2°C. Hoặc sử dụng touchdown PCR. - Dùng PCR đánh bắt với nhiệt độ bắt mồi khá thấp (~45°C) trong 10 chu kỳ đầu và nâng cao nhiệt độ đến Tm thấp nhất ở 20 chu kỳ tiếp theo.
- Tăng nhiệt độ biến tính (tối đa 98°C) và điều chỉnh thời gian biến tính DNA đối với các mẫu DNA của genome lớn hoặc khi khuyếch đại các đoạn lặp SSR.
- Kiểm tra các điều kiện của primer, thiết kế cặp primer mới để chạy nestPCR - Tăng nồng độ enzyme DNA polymerase.
* Vệt smear kích thước lớn hơn sản phẩm mong muốn
- Giảm nồng độ enzyme DNA polymerase. - Rút ngắn thời gian kéo dài.
- Giảm số chu kỳ nhiệt PCR xuống tối đa 25.
- Tăng nhiệt độ bắt mồi lên 2°C hoặc thử với PCR 2 giai đoạn hoặc nestPCR. - Thay đổi nhiệt độ biến tính.
- Thử chạy gradien nồng độ Mg2+ . - Hạ thấp nồng độ primer.
* Băng sản phẩm phụ rõ nét với kích thước thấp hơn sản phẩm mong
muốn
- Tăng nhiệt độ bắt mồi 2°C và/hoặc tăng thời gian bắt mồi. - Tăng thời gian kéo dài thêm 30s.
- Giảm nồng độ DNA polymerase. - Tối ưu hóa nồng độ Mg2+.
- Tinh sạch DNA template bằng thôi gel. Hoặc thủy phân DNA bằng một số RE trước khi dùng làm template (hiệu quả khi băng sản phẩm phụ kích thước khá lớn 1kb).
- Giảm nồng độ primer. - Thiết kế cặp primer mới.
CHƯƠNG II. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU