Chủng C.perfringens bảo quản ở nhiệt độ - 80°C được tiến hành rã đông ở nhiệt độ thường. Sau đó cấy tăng sinh trên môi trường Fluid thioglycolate, ủ trong 24 - 28 giờ trong điều kiện yếm khí. Kiểm tra các đặc tính sinh vật, hóa học của vi khuẩn theo phương pháp của Quinn và cộng sự (1994) [36].
* Kiểm tra khả năng di động bằng phương pháp soi tươi
Làm tiêu bản giọt treo: cho một giọt canh khuẩn từ môi trường Fluid thioglycolate lên giữa la-men. Rồi đặt la men lên phần lõm của phiến kính lõm (không để giọt canh khuẩn lan rộng hay chạm vào phần đáy của phần lõm). Quan sát tiêu bản trên kính hiển vi ở vật kính dầu (X100).
* Phương pháp kiểm tra hình thái
Để kiểm tra hình thái của vi khuẩn, chúng tôi sử dụng phương pháp nhuộm Gram. Dùng que cấy vòng lấy một ít canh khuẩn dàn đều lên bề mặt lam kính. Cố định tiêu bản bằng cách hơ lam kính 2-3 lần qua ngọn lửa đèn cồn. Sau đó tiến hành nhuộm:
- Phủ lên tiêu bản dung dịch Crystal Violet trong 1 phút. Sau đó rửa nhẹ bằng nước.
- Phủ lên tiêu bản dung dịch Lugol trong 1 phút. Sau đó rửa nhẹ bằng nước. - Dùng cồn 95% nhỏ từ từ lên tiêu bản rồi nhanh chóng rửa lại bằng nước ( thời gian tẩy chỉ khoảng 5-10 giây)
- Phủ lên tiêu bản dung dịch Fuchsin trong 1 phút. Sau đó rửa nhẹ bằng nước. Để cho tiêu bản khô và soi dưới kính hiển vi với vật kính dầu (X100).
* Phương pháp kiểm tra một số đặc tính sinh vật, hóa học
- Kiểm tra khả năng dung huyết trên môi trường thạch máu: dùng que cấy vô trùng lấy một ít canh khuẩn ria đều trên bề mặt thạch máu. Sau đó, ủ ở 370C trong điều kiện yếm khí. Sau 24 giờ lấy ra đọc kết quả, nếu xung quanh khuẩn lạc có vòng dung huyết thì phản ứng dương tính và ngược lại.
- Xác định khả năng lên men đường glucose, lactose, maltose, saccarose, mannitol : dùng que cấy vô trùng chọn lấy khuẩn lạc cần kiểm tra, chích sâu xuống đáy mỗi ống nghiệm có chứa từng loại đường riêng biệt, để tủ ấm 370C, 10% CO2. Sau 24 - 28 giờ lấy ra đọc kết quả, phản ứng dương tính khi môi trường chuyển từ màu đỏ sang vàng và ngược lại. Vi khuẩn có khả năng sinh hơi trên các môi trường đường, nếu thạch bị nứt hoặc bị đẩy lên trên và ngược lại.
- Kiểm tra khả năng di động trên môi trường Mannitol – motility: Vi khuẩn có khả năng di động sẽ làm môi trường đục đều, vi khuẩn di động yếu chỉ làm đục môi trường xung quanh đường cấy, vi khuẩn không di động chỉ mọc trên đường cấy.
- Kiểm tra khả năng lên men lactose và làm đông vón casein trên môi trường Litmus milk: dùng que cấy vô trùng lấy khuẩn lạc cấy vào môi trường Litmus milk, nuôi cấy trong tủ ấm 370C, 10% CO2, sau 24 – 28 giờ kiểm tra. Phản ứng dương tính khi vi khuẩn lên men lactose, làm đông vón Casein, môi trường chuyển từ màu tím sang nâu rồi sang trắng với chỉ thị pH litmus.
- Kiểm tra khả năng lên men lecithinase trên môi trường Egg yolk: dùng que cấy vô trùng chọn lấy khuẩn lạc cấy ria đều trên môi trường Egg yolk. Nuôi cấy vào trong yếm khí, đặt trong tủ ấm 370C sau 24 -28 giờ lấy ra đọc kết quả. Phản ứng
dương tính khi vi khuẩn phát triển sinh men lecithinase phân giải lecithin tạo thành vòng trắng sữa xung quanh khuẩn lạc và ngược lại.
- Đánh giá khả năng lên men và khả năng oxi hóa vi khuẩn Clostridium perfringens bằng phản ứng O-F test: Dùng que cấy vô trùng lấy khuẩn lạc cần kiểm tra cấy một đường trích sâu xuống đáy ống nghiệm, để tủ ấm 37 0C. Nuôi cấy 48 giờ, cứ sau 24 giờ đọc kết quả một lần.
+ Vi khuẩn có khả năng oxi hóa: chỉ sinh axit ở các ống hiếu khí (vàng ở các ống hiếu khí, xanh ở các ống kỵ khí).
+ Vi khuẩn có khả năng lên men đường: sẽ sinh axit ở cả 2 ống (cả 2 ống hiếu khí và kỵ khí đều có màu vàng).
+ Vi khuẩn không có khả năng lên men và không oxi hóa: sẽ không sinh axit (màu xanh ở ống hiếu khí, màu tím ở ống kỵ khí).
- Đánh giá khả năng hình thành nhân tố β – hemolysin gây nên hiện tượng tan huyết trên môi trường thạch máu nhờ phospholipase C của vi khuẩn Clostridium perfringens bằng phản ứng CAMP test: Dùng que cấy vô trùng lấy khuẩn lạc
Streptococcus agalactiae cấy thành một đường ngang trên đĩa. Trên vùng đĩa rộng, cấy chủng vi khuẩn C. perfringens thành đường thẳng vuông góc với đường cấy ban đầu, không để cho 2 đường cấy này giao với nhau.
Lật ngược đĩa và ủ trong điều kiện yếm khí ở 370C, đọc kết quả sau 24 giờ.
Thử nghiệm là (+) khi có sự hình thành vùng tan huyết trong rõ hình mũi tên tại vùng tiếp giáp giữa đường cấy của chủng C. perfringens và Streptococcus agalactiae. Ngược lại, không có vùng tan huyết tại vùng tiếp giáp như trên là (-).