PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH VÀ ĐÁNH GIÁ CÁC GENE ĐỘC TÍNH CỦA VI KHUẨN Vibrio parahaemolyticus GÂY BỆNH TRÊN TÔM

Hội chứng hoại tử gan tụy cấp tính (AHPNS) là căn bệnh truyền nhiễm nguy hiểm ở tôm nuôi. Căn bệnh này có thể được phát hiện quanh năm nhất là vào mùa hè từ tháng 4 đến tháng 8 khi điều kiện khí hậu thuận lợi cho vi sinh vật phát triển. Gặp điều kiện phù hợp bệnh có thể bùng phát nhanh và phát triển thành đại dịch và gây thiệt hại nghiêm trọng cho người nuôi tôm. Các triệu chứng ban đầu của tôm bị bệnh như là: lờ đờ, kém ăn hoặc bỏ ăn. Tôm bệnh thường có xu hướng tách đàn, có thể được nhìn thấy ở mặt ao, gần bờ hay bơi lòng vòng. Tôm bị bệnh chết thường có các biểu hiện: vỏ tôm bị mềm, xuất hiện các vết thương hoại tử, ăn mòn trên vỏ và gan tụy tôm. Nguyên nhân gây bệnh AHPNS được cho là do nhóm vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây ra.Mục đích của nghiên cứu này là phân lập và xác định vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus từ các mẫu tôm bệnh thu thập được từ các ao nuôi tôm ở một số tỉnh miền Tây Nam Bộ. Bằng việc sử dụng phương pháp sinh hoá và PCR với các đoạn mồi chuyên biệt cho nhóm V. parahaemolyticus như AP3, 16srDNA, và các gen độc tố của nó như là ToxR, tdh, tlh, trh. Kết quả của nghiên cứu này là có một chủng vi khuẩn V. Parahaemolyticus đã được phân lập và xác định, bên cạnh đó các chủng vi sinh vật khác bao gồm Vibrio spp. và staphylococcus cũng đã được phát hiện từ mẫu tôm bệnh. Kết quả nghiên cứu làm cơ sở khoa học cho việc nghiên cứu sâu hơn về sự biểu hiện của các gen độc nhằm xây dựng và phát triển các vaccin điều trị V.parahaemolyticus trên tôm cũng như cho những nghiên cứu tiếp theo về sự đa dạng của các loài vi khuẩn Vibrio ở Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH VÀ ĐÁNH GIÁ CÁC GENE ĐỘC TÍNH CỦA

VI KHUẨN Vibrio parahaemolyticus

GÂY BỆNH TRÊN TÔM

Sinh viên thực hiện: NGUYỄN HOÀNG PHƯƠNG

Tháng 02 năm 2015

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH VÀ ĐÁNH GIÁ CÁC GENE ĐỘC TÍNH CỦA

VI KHUẨN Vibrio parahaemolyticus

GÂY BỆNH TRÊN TÔM

Tháng 02 năm 2015

LỜI CẢM TẠ

Tôi xin chân thành cảm ơn

Cha, mẹ người thân đã luôn ủng hộ và giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận này Ban giám hiệu Trường Đại Học Nông Lâm TP.HCM, Ban chủ nhiệm Bộ môn Công nghệ Sinh học, cùng tất cả thầy cô đã truyền dạy kiến thức cho tôi trong suốt những năm học vừa qua.

TS Nguyễn Bảo Quốc đã tận tình hướng dẫn , giúp đỡ, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi suốt thời gian làm đề tài và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này.

Các bạn lớp DH10SH đặc biệt là các thành viên trong phòng thí nghiệm Bệnh học người đã giúp đỡ, động viên, chia sẻ cùng tôi trong thời gian làm đề tài vừa qua

Sinh viên thực hiện Nguyễn Hoàng Phương

Mục đích của nghiên cứu này là phân lập và xác định vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus từ các mẫu tôm bệnh thu thập được từ các ao nuôi tôm ở một số

tỉnh miền Tây Nam Bộ Bằng việc sử dụng phương pháp sinh hoá và PCR với các đoạn mồi chuyên biệt cho nhóm V parahaemolyticus như AP3, 16s-rDNA, và các

gen độc tố của nó như là ToxR, tdh, tlh, trh Kết quả của nghiên cứu này là có một

chủng vi khuẩn V Parahaemolyticus đã được phân lập và xác định, bên cạnh đó các

chủng vi sinh vật khác bao gồm Vibrio spp và staphylococcus cũng đã được phát hiện

từ mẫu tôm bệnh Kết quả nghiên cứu làm cơ sở khoa học cho việc nghiên cứu sâu hơn

về sự biểu hiện của các gen độc nhằm xây dựng và phát triển các vaccin điều trị

V.parahaemolyticus trên tôm cũng như cho những nghiên cứu tiếp theo về sự đa dạng

của các loài vi khuẩn Vibrio ở Việt Nam

disease in shrimp has been known to be the bacteria Vibrio parahaaemolyticus producing a

potent toxin rapidly that can destroy tissue and liver dusfunction in the pancreatic digestive system

In this study, the bacteria Vibrio parahaemolyticus was isolated from infected

shrimp samples collected from various shrimp raising ponds at some provinces in the South

West of Vietnam The detection of V parahaemolyticus was conducted by using biochemical methods and PCR with specific primers of AP3, 16S rDNA and tbe toxin genes such as ToxR , tdh, tlh and trh The results obtained here will be helpful for further studies involving in the expression profiles of toxic genes in vitro and in vivo to build and to develop the vaccine

based treatment to V parahaemoliticus on shrimp as well as for further research on the

diversity of Vibrio species in Vietnam

MỤC LỤC

DANH SÁCH CÁC BẢNG

DANH SÁCH CÁC HÌNH

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AHPNS: Acute hepatopancreatic necrosis disease

EMS: Early Moratlity Syndrome

PCR: Polymerase Chain Reaction

KIA: Kligler Iron Agar

NB: Nutrient Broth

tdh: Themostable direct hemolysin

trh: Themostable related hemolysin tlh: Themostable hemolysin

TCBS: Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose

TSA Tryptica Soy Agar

Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Ngành nuôi tôm thương phẩm trên thế giới đã có từ rất lâu nhưng chỉ thực sự phát triển vào những năm 1980, khi lần đầu tiên tôm giống được sản xuất ra với số lượng lớn cung cấp cho người nuôi Ngày nay, ở nhiều nơi trên thế giới, ngành nuôi tôm thương phẩm đang gặp rất nhiều khó khăn bởi các nạn dịch bệnh nguy hiểm, có tốc độ lan truyền rất nhanh như: bệnh đốm trắng, bệnh đầu vàng, bệnh còi, bệnh xuất huyết,… do bị các tác nhân như là virus, vi khuẩn, nấm,…gây ra đã và đang gây nhiều thiệt hại nghiêm trọng cho người nuôi tôm Trong đó, đối tượng gây bệnh đáng quan tâm hiện nay đó là vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus đã được chỉ ra là nguyên nhân

gây ra bệnh chết sớm (EMS) và bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPNS) Căn bệnh này rất nguy hiểm vì tôm mắc bệnh có thể bị chết lên đến 100 % trong vài ngày Nhiều nước trên thế giới đã xác nhận sự hiện diện của căn bệnh này như: Australia, Ấn Độ, Indonesia, Philippines, Đài Loan, Thái Lan, trong đó có Việt Nam Căn bệnh này đã gây ra sự giảm sút nghiêm trọng về mặt sản lượng tôm gần đây ở các nước như Việt Nam, Ấn Độ, Bangladesh, Philippines và Trung Quốc Tôm nhiễm bệnh do vi khuẩn

Vibrio parahaemolyticus thường có các dấu hiệu như: biếng ăn, bơi yếu, xuất hiện

những vùng hoại tử ở vỏ và mô gan Xuất phát từ thực trạng trên, đề tài “phân lập,

xác định và đánh giá sự hiện diện các gene độc tính của vi khuẩn Vibrio

parahaemolyticus gây bệnh trên tôm” đã được thực hiện tại Tòa nhà A1, Viện nghiên

cứu Công nghệ sinh học và Môi trường - Trường ĐH Nông Lâm TP Hồ Chí Minh từ tháng 01 năm 2014 đến tháng 02 năm 2015, nhằm mục đích phân lập và xác định

V.parahaemolyticus làm nguồn vật liệu ban đầu cho các nghiên cứu về biểu hiện của

các gen độc cũng như là cho việc xây dựng quy trình chuẩn đoán vi khuẩn này trên tôm

1.3 Nội dung thực hiện

- Phân lập Vibrio spp trên các mẫu tôm thu thập được.

- Đánh giá các chỉ tiêu sinh hoá trên các chủng vi khuẩn Vibrio spp phân lập được.

- Định danh sự hiện diện của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus bằng phương pháp PCR.

- Xác định sự hiện diện các gene gây độc của vi khuẩn V.parahaemolyticus bằng phương pháp PCR.

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Đặc điểm về giống Vibrio

Giống Vibrio thuộc họ Vibrionaceae là những loài vi khuẩn Gram (-), hình que

thẳng hoặc hơi uốn cong, kích thước 0,3 – 0,5 x 1,4 – 2,6 µm Chúng không sinh bào

tử và chuyển động nhờ một hay nhiều tiên mao mảnh nằm ở một đầu vi khuẩn Tất cả những loài vi khuẩn thuộc giống Vibrio đều là vi khuẩn kỵ khí tùy nghi, vi khuẩn

không phát triển trong môi trường không có muối (NaCl) và không sinh H2S

 Phân loại Vibrio

2.2 Lịch sử phát hiện và sự phân bố của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus

Bệnh do vi khuẩn Vibrio (Vibriosis) đã được phát hiện từ rất sớm trên các động

vật thủy sản thuộc họ giáp xác Cho đến nay bệnh Vibriosis đã được phát hiện ở nhiều nước trên thế giới cũng như ở Việt Nam Một nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng các loài tôm hùm châu Mỹ như: Homarus americarus, H gammarus và tôm hùm châu

Á như: Panulirus homarus, P ornatus đều có thể bị nhiễm bệnh do vi khuẩn Vibrio

(Fisher và ctv, 1977; Phillips, 2013) Ở Việt Nam, một số nghiên cứu cho rằng nguyên nhân gây ra bệnh đỏ thân là do tôm ăn Artemia và tảo Từ năm 1989 đến 1990 các nghiên cứu đã chỉ ra rằng bệnh Vibriosis, đặc biệt là bệnh phát sáng xảy ra khá phổ biến ở các trại sản xuất tôm sú giống và ở ao nuôi tôm thương phẩm tại Việt Nam (Đỗ Thị Hòa, 1994) Trong những năm gần đây, khi nghề nuôi tôm phát triển thì bệnh

Vibriosis đã trở nên quen thuộc với người nuôi tôm Hằng năm, bệnh vẫn gây ra những

tổn thất lớn về sản lượng tôm Tại Việt Nam, trong năm 2012 dịch bệnh Hội chứng

tôm chết sớm (EMS) ảnh hưỏng nghiêm trọng trên diện rộng Cả nước có khoảng 100.766 ha diện tích nuôi tôm đã bị ảnh hưởng bởi dịch bệnh này (Lê Hằng và Nguyễn Thị Bích, 2012)

Các loài vi khuẩn thuộc giống Vibrio chủ yếu sống ký sinh trên cơ thể động vật

thủy sản và gây ra một số triệu chứng bệnh lý nhất định Gần đây, một số nghiên cứu

đã chỉ ra rằng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus là nguyên nhân gây ra bệnh

EMS/AHPNS trên tôm nuôi (Lightner và ctv, 2012) Bệnh này xảy ra và phát triển thành dịch phụ thuộc vào nhiều điều kiện khác nhau: tôm bị bệnh truyền nhiễm hoặc các bệnh về dinh dưỡng, tôm bị thương hoặc điều kiện môi trường khắc nghiệt Việc phân lập Vibrio parahaemolyticus từ mẫu tôm bệnh không khó nhưng xác định được

vai trò của chúng trong một bệnh là điều không đơn giản và việc gây bệnh thực nghiệm khó thành công do không tạo được các yếu tố phù hợp để bệnh bùng phát

Trong tự nhiên, vi khuẩn Vibrio spp có mặt ở hầu hết các môi trường nước đặc biệt là vùng nước lợ ở cửa sông và vùng nước ngập mặn Ion Na + là yếu tố cần thiết cho sự phát triển của các loài vi khuẩn này, với một số loài thì ion này là nhu cầu tuyệt đối và không thể thiếu.

2.3 Đặc điểm dịch tễ học

2.3.1 Đặc điểm phân bố

- Địa lý: Bệnh Vibriosis có thể được phát hiện được ở mọi khu vực trên thế giới, nơi

có nghề nuôi động vật thủy sản nước lợ và nước mặn Các khu vực tập trung nhiều nhất như là ở châu Á, châu Phi và châu Mỹ Từ các mẫu bệnh của ấu trùng, hậu ấu trùng và tôm bệnh, một số loại khác nhau của giống vibrio đã phân lập được Như ở Philippines, Lavilla-Pitogo đã phân lập được 2 loài V.harveyi và V.splendidus (Lavilla-Pitogo và ctv, 1990) Trong khi ở Thái Lan, V.parahaemolyticus được phát hiện trên các mẫu tôm bệnh Tại Việt Nam, 2 loài vi khuẩn thuộc giống này đã được phân lập là V.alginolyticus và V.parahaemolyticus.

- Ký chủ: Hầu hết các loài động vật thủy sản nước lợ, mặn đều có thể mang và bị ảnh hưởng của bệnh Vibriosis như: các loài tôm he (Penaeus spp.) và tôm thẻ

(Metapenaeus spp.), các loài tôm hùm châu Mỹ (Homarus spp.) và tôm hùm châu Á (Panulirus spp.), các loài cua biển như cua xanh, cua đá

- Giai đoạn phát bệnh: xảy ra ở hầu hết các giai đoạn phát triển của tôm như : ấu trùng, hậu ấu trùng, ấu niên, cơ thể trưởng thành và cả cá thể bố mẹ Nhưng tùy vào từng loại bệnh mà vi khuẩn Vibrio spp có thể gây bệnh mạnh ở giai đoạn này

và nhẹ hơn ở giai đoạn kia Ví dụ: Bệnh phát sáng do Vibrio harveyi có thể xảy ra ở nhiều giai đoạn khác nhau, nhưng tác hại nặng nhất là giai đoạn tiền ấu trùng Zoae

và Mysis

- Con đường lan truyền: vi khuẩn Vibrio spp xâm nhập vào ao nuôi thuỷ sản theo một

số con đường như: nguồn nước, dụng cụ dùng, tôm bố mẹ hoặc tôm giống, thức ăn đặc biệt là thức ăn tươi sống Artemia và chúng có thể nằm sẵn ở thành bể hay dưới đáy ao

2.3.2 Thời gian xuất hiện bệnh.

Thời gian xuất hiện bệnh do vi khuẩn Vibrio spp tùy thuộc theo loài và địa

điểm nuôi Nhìn chung vi khuẩn Vibrio spp sinh sản rất nhanh ở độ mặn 10 – 40 ppt

(phát triển mạnh nhất ở độ mặn 20 – 30 ppt), lây lan nhanh ở nhiệt độ cao (mùa hè), phát triển tốt ở nơi có nhiều chất hữu cơ, oxy thấp và pH trong khảng 7 – 9 Trong bể nuôi, lượng vi khuẩn Vibrio tăng theo thời gian nuôi Mật độ vi khuẩn Vibrio spp tăng

nhanh rõ rệt khi thời tiết thay đổi, vào các thời điểm biển động do bão, gió mùa hay áp thấp nhiệt đới hoặc theo con nước của thủy triều (nước cường, nước ròng) (Đỗ Thị Hòa, 1997)

2.3.3 Tác hại của bệnh

Theo thống kê của tổng cục thủy sản Việt Nam, trong 10 tháng đầu năm 2013,

dịch bệnh do vi khuẩn Vibrio spp gây ra đã được phát hiện tại 192 xã của 57 huyện

thuộc 18 tỉnh, thành phố trong cả nước Tổng diện tích nuôi tôm xuất hiện bệnh là 5.705 ha, bao gồm 2.423 ha nuôi tôm thẻ chân trắng và 3.282 ha nuôi tôm sú Dịch bệnh diễn ra ở hầu hết các vùng trọng điểm nuôi tôm, trên cả 2 đối tượng nuôi chính là tôm sú và tôm thẻ chân trắng, trong đó các tỉnh nuôi tôm ở Đồng bằng Sông Cửu Long

là bị thiệt hại nặng nề nhất (Kiều Ngọc Hà, 2013)

Thông thường bệnh do vi khuẩn Vibrio spp gây ra ở tôm có thể xảy ra ở dạng

cấp tính hoặc mãn tính, trong trường hợp cấp tính, tỷ lệ chết có thể lên đến 100 %

2.3.4 Đặc điểm sinh hóa của Vibrio

Bảng 2.1 Đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn Vibrio harveyi.

2.4 Dấu hiệu bệnh lí

2.4.1 Dấu hiệu lâm sàng

Tôm bị nhiễm vi khuẩn Vibrio spp ở trạng thái không bình thường, lờ đờ, kém

ăn hoặc bỏ ăn Tôm có thể được nhìn thấy ở mặt ao, gần bờ hay bơi lòng vòng Tôm chết bệnh thường xuất hiện các triệu chứng như : vỏ tôm bị mềm, xuất hiện các vết thương hoại tử, ăn mòn trên vỏ và bộ phận khác của tôm

Vỏ kitin của tôm khi mang vi khuẩn này có thể xuất hiện các vết thương tổn màu nâu đen do bị ăn mòn và viêm nhiễm Hội chứng này gọi là bệnh vỏ hay bệnh nhiễm nâu

Ấu trùng tôm và tôm giống khi nhiễm V parahaemolyticus và V harveyi sẽ có

sự phát sáng ở phần giáp đầu ngực trong tối Sau đó sẽ kèm theo hiện tượng lắng đáy

và chết hàng loạt Hội chứng này gọi là bệnh phát sáng trên tôm

Xuất hiện các chấm đỏ ở gốc râu ngực, ở thân hay ở các phần phụ của ấu trùng tôm khi nhiễm V alginolyticus Xuất hiện vùng mờ ở phần cơ bụng, tôm bị nhiễm

bệnh thường có các biểu hiện: bỏ ăn, xuất hiện sắc tố nâu đen trên mặt lưng của phần bụng gây nên những khoảng tối sáng khác với tôm bình thường, các cơ quan phần phụ chuyển màu đỏ

2.4.2 Dấu hiệu bệnh tích

Vi khuẩn Vibrio cũng có thể nhiễm ở gan tụy, ruột và một số vùng cơ của tôm

Tuy nhiên, khi giải phẩu cơ thể tôm bệnh chúng ta không thể phát hiện được dấu hiệu bệnh tích Một số bệnh đặc trưng do Vibrio spp gây ra trên tôm:

- Bệnh phồng đuôi: Nguyên nhân chính là do số lượng thức ăn dư thừa và vật chất khác tích tụ ở đáy ao tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn phát triển, chủ yếu là vi khuẩn thuộc giống Vibrio mà chiếm đa số là V.parahaemolyticus (Đỗ Thị Hòa, 2004).

- Bệnh đỏ dọc thân: Nguyên nhân chính là do nước và đáy ô nhiễm nặng, thức

ăn thừa quá nhiều, công tác vệ sinh kém, nhiễm vi khuẩn Vibrio mà chủ yếu

là V.alginolyticus (Đỗ Thị Hòa, 2004).

2.5 Gene độc tố của V parahaemolyticus

Gen toxR là gen điều hòa các gen độc tố, có trình tự bảo tồn đặc trưng cho loài nên có thể được sử dụng làm gen đích để xây dựng phương pháp phát hiện nhanh

vi khuẩn Vibrio trong mẫu tôm bệnh bằng kỹ thuật PCR Bên cạnh đó, gen tlh là gen

mã hóa một hemolysin không bền nhiệt có trình tự amino acid bảo thủ trong họ

Vibrionaceae, nên có tiềm năng làm vaccin điều trị bệnh thủy sản và marker chẩn

đoán bệnh do Vibrio (Nguyễn Văn Duy và ctv, 2012).

Ngoài khả năng gây bệnh trên tôm V.parahaemolyticus còn có khả năng gây bệnh trên người do loài vi khuẩn này có các gen mã hóa cho độc tố hemolysin như là: themostable direct hemolysin (tdh), themostable related hemolysin (trh) và themostable hemolysin (tlh) Đây là loại độc tố làm phân giải tế bào hồng cầu và giải phóng hemoglobin Có nghiên cứu đã chỉ ra rằng, các gen độc tố của vi khuẩn V.parahaemolyticus là nguyên nhân gây ra bệnh viên dạ dày cấp tính ( Honda T và Iida T, 1993).

2.6 Các phương pháp phát hiện Vibrio spp.

2.6.1 Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật

2.6.1.1 Nguyên tắc

Nuôi cấy tăng sinh khối trong môi trường canh peptone kiềm, phân lập trên môi trường phân lập đặc trưng Quan sát chọn những khuẩn lạc đặc trưng trên đĩa cấy Phương pháp này có ưu điểm là đơn giản, dễ thực hiện và ít tốn kém Tuy nhiên, nhược điểm của nó là mất thời gian để thực hiện.

2.6.1.2 Cách thực hiện

Lấy mẫu mô gan tụy của tôm bệnh, nghiền nhỏ và pha loãng đến nồng độ thích hợp Sau đó nhỏ 0.3 ml dịch mẫu lên các đĩa chứa môi trường TCBS, dàn đều khắp bề mặt môi trường, mỗi mẫu cấy lên một đĩa Ủ trong tủ ấm ở 300 C trong 24 giờ Tách dòng các chủng vi khuẩn mọc trên bề mặt môi trường Tiến hành thử nghiệm các đặc tính sinh hóa của Vibrio spp như khả năng sử dụng các đường glucose, sorbitol,

maltose, sucrose, lactose, galactose; khả năng sử dụng Citrate như nguồn carbon duy nhất trên môi trường Simons Citrate Agar; khả năng sinh gar của glucose, kiểm tra khả năng lên men và oxy hóa; khả năng phân giải gelatin; khả năng sử dụng Nitrate; phản ứng Indol hóa; khả năng sử dụng các acid amin

2.6.2 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)

Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) được Karl Mullis và cộng sự

(Mỹ) phát minh năm 1985, từ đó đã tạo ra một tác động to lớn đối với các nghiên cứu sinh học trên toàn thế giới Ðây là phương pháp in vitro sử dụng các cặp mồi để tổng hợp một số lượng lớn bản sao từ một trình tự DNA đặc biệt dựa trên hoạt động của enzyme polymerase Phương pháp PCR dựa trên nguyên tắc hoạt động của DNA polymerase trong việc tổng hợp DNA mới từ mạch khuôn Tất cả các DNA polymerase đều cần có những mồi, là những đoạn DNA ngắn có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn DNA Ðoạn mồi này sau đó sẽ được kéo dài dưới tác động của DNA polymerase để hình thành một mạch mới hoàn chỉnh Để phản ứng PCR có thể khuyếch đại một trình tự đặc biệt nào đó thì cần phải có những thông tin tối thiểu về trình tự đó để thiết kế các mồi tương ứng bao gồm một mồi xuôi (sense primer) và một mồi ngược (antisense primer) so với chiều phiên mã của gene Khi phản ứng xảy ra sẽ cho hàng loạt bản sao của đoạn DNA nằm giữa hai mồi đó

Một phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm

ba giai đoạn cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA khuôn mẫu được biến tính ở nhiệt

độ cao trong vòng 30 giây – 1 phút, thường là ở 940 C Giai đoạn bắt cặp là giai đoạn

mà nhiệt độ được hạ thấp, cho phép các mồi bắt cặp bổ sung với khuôn Trong thực nghiệm, nhiệt độ này dao động trong khoảng từ 30 – 700 C và thời gian dao động trong khoảng 40 giây – 1 phút Giai đoạn tổng hợp: trong giai đoạn này, nhiệt độ được tăng lên đến 720 C kéo dài từ 20 giây đến nhiều phút để cho DNA polymerase thực hiện quá trình tổng hợp Trong phản ứng PCR, chu kỳ gồm ba giai đoạn trên sẽ được lặp lại nhiều lần, mỗi lần lặp lại sẽ làm tăng số lượng bản sao lên gấp đôi Theo tính toán, sau

30 chu kỳ, số bản sao sẽ là 106 so với số lượng bản mẫu ban đầu

Rất nhiều nghiên cứu không chỉ ở Việt Nam mà còn ở nhiều nước trên thế giới

đã sử dụng phương pháp này để phát hiện vi khuẩn V.parahaemolyticus Các nghiên cứu sử dụng cặp mồi ToxR như là: Nguyễn Văn Duy và ctv, 2012; Lightner và ctv,

2012; Kim và ctv, 1999 hay với 3 cặp mồi tdh, trh, tlh như là: Bej và ctv, 1999; Honda và ctv, 1993 và gần đây nhất là nghiên cứu sử dụng phương pháp này với cặp mồi AP3 là Kongrueng và ctv, 2014 cũng cho phép xác định loài vi khuẩn này.

Ngoài 2 phương pháp trên, với sự tiến bộ của khoa học công nghệ, các nhà nghiên cứu đã phát triển một số phương pháp mới như là multiplex PCR, realtime PCR, multipleax realtime PCR, kỹ thuật LAMP, Các phương pháp mới này dựa trên

nguyên lí hoạt động của phương pháp PCR truyền thống nhưng lại có tính ưu việt hơn

Ví dụ như: phương pháp realtime PCR có sự gắn kết giữa máy PCR và máy vi tính cho phép việc xem xét mức độ biểu hiện của các gen mục tiêu hay kỹ thuật LAMP sử dụng cùng lúc các cặp mồi chuyên biệt cho phép xác định nhanh loài vi khuẩn quan tâm trong thời gian ngắn

Một số nghiên cứu sử dụng phương pháp realtime PCR trong việc xác định vi

khuẩn V.parahaemolyticus như nghiên cứu của Nordstrom, J L và ctv, 2007 Nội dung của nghiên cứu này là xác định sự hiện diện của vi khuẩn V.parahaemolyticus

gây bệnh viêm dạ dày ở Hoa Kỳ Bằng kỹ thuật realtime multiplex PCR sử dụng đồng

thời 3 cặp mồi là tdh, trh, tlh Kết quả của nghiên cứu này dùng để chứng minh sự tiện

ích của phương pháp PCR và ứng dụng phương pháp này trong việc phát hiện vi

khuẩn V.parahaemolyticus trong các ổ dịch.

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Thời gian và địa điểm

• Thời gian: từ 01/2014 đến 02/2015

• Địa điểm: Tòa nhà A1, Viện nghiên cứu Công nghệ sinh học và Môi trường - Trường ĐH Nông Lâm TP Hồ Chí Minh

3.2 Dụng cụ và vật liệu

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Các loài vi khuẩn thuộc chi Vibrio phân lập được từ các mẫu tôm bệnh thu thập

được

3.2.2 Thiết bị và dụng cụ

 Dùng cho phân lập vi khuẩn

- Lam – lame

- Kính hiển vi quang học

- Máy PCR (Master cycler Nexus, Eppendorf, Đức)

- Máy điện di gel (Mupid-Exu, Nhật Bản)

- Ống eppendoft (25 – 50 µl)

- Máy ly tâm (Beckman Coulter, Đức)

- Tủ lạnh

- Các thiết bị khác có liên quan

3.2.3 Môi trường và hóa chất

3.2.3.1 Môi trường và hóa chất dùng cho phương pháp nuôi cấy

 Môi trường TSA

Môi trường TSA (thành phẩn môi trường xem ở phụ lục 1) là môi trường cơ bản đùng để nuôi cấy vi khuẩn thuộc họ vi khuẩn Vibrio Với nồng độ muối NaCl trong môi trường là 7 % đã tạo ra môi trường phù hợp để các vi khuẩn thuộc họ vi khuẩn Vibrio có thể sống và phát triển.

 Môi trường Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose (TCBS)

Môi trường TCBS (thành phẩn môi trường xem ở phụ lục 1) được xem như là môi trường chọn lọc cơ bản ban đầu các chủng vi khuẩn thuộc họ vi khuẩn Vibrio Dựa vào sự thay đổi màu sắc khác nhau của từng khuẩn lạc trên môi trường mà việc chọn lọc các chủng vi khuẩn thuộc nhóm này bước đầu đễ dàng hơn. Tuy nhiên,

môi trường TCBS chỉ có thể phân loại vi khuẩn Vibrio thành hai nhóm: có sử dụng và

không sử dụng đường sucrose, vì vậy để có thể xác định chính xác tên của các chủng

vi khuẩn này thì cần phải làm các phản ứng sinh hóa và chạy PCR để có những kết luận chính xác hơn

 Dung dịch tăng sinh vi khuẩn Nutrient Broth (NB)

Hình 3.1 Máy PCR

Môi trường NB (thành phẩn môi trường xem ở phụ lục 1) là môi trường lỏng dung để tăng sinh vi khuẩn thuộc họ vi khuẩn Vibtio Việc tăng sinh vi khuẩn đóng vai trò quan trọng trong việc lưu mẫu vi khuẩn và tạo sinh khối vi khuẩn trong quá trình ly trích DNA từ vi khuẩn.

3.2.3.2 Môi trường và hóa chất dùng cho phản ứng PCR

- Kit PCR (TopTaqTM PCR, QIAGEN)

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Phương pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu

- Mẫu sau khi lấy từ ao lên được cho vào ống fancon và đậy nắp lại.

- Cho ống dựng mẫu vào trong thùng đá trong quá trình vận chuyển.

- Lưu mẫu trong tủ - 20 0 C

- Pha loãng mẫu đến nồng độ thích hợp

- Cấy lên môi trường chọn lọc TCBS, ủ ở nhiệt độ phòng trong 24h để vi khuẩn có thể phát triển.

- Phân dòng các chủng vi khuẩn Vibrio spp mọc trên môi trường TCBS

- Làm thuần chủng vi khuẩn Vibrio trên môi trường TCBS, ủ ở nhiệt độ phòng trong 24 – 48h để vi khuẩn phát triển

- Tăng sinh vi khuẩn trong môi trường NB lỏng ở 37 0 C từ 24 – 48h.

- Hút 0,8 ml dung dịch tăng sinh vi khuẩn + 0,2 ml dung dịch Glycerol cho vào ống type 1,5 ml, trộn đều và giữ giống trong tủ - 20 0 C.